NAGIOS: RODERIC FUNCIONANDO
Development and application of (bio)analytical methodologies in capillary electrophoresis. Enantioselectivity considerations
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Development and application of (bio)analytical methodologies in capillary electrophoresis. Enantioselectivity considerations
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| dc.contributor.advisor | Martín Biosca, Yolanda | |
| dc.contributor.advisor | Sagrado Vives, Salvador | |
| dc.contributor.advisor | Medina Hernández, María José | |
| dc.contributor.author | Asensi Bernardi, Lucía | |
| dc.contributor.other | Facultat de Química | es_ES |
| dc.date.accessioned | 2014-02-27T09:20:09Z | |
| dc.date.available | 2014-03-30T06:10:06Z | |
| dc.date.issued | 2014 | |
| dc.date.submitted | 07-03-2014 | es_ES |
| dc.identifier.uri | http://hdl.handle.net/10550/33383 | |
| dc.description.abstract | The development of new drugs is a long, complex and expensive process that involves the evaluation of pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of the new molecule in different stages. In the early stages of drug development, in vitro methods for the high-throughput screening of new molecules’ properties are commonly used, with the aim of having preliminary data about the potential pharmacological activity of a molecule and also its pharmacokinetics. When chiral molecules are employed, both pharmacokinetic and pharmacodynamic properties can show a certain degree of enantioselectivity due to the interaction with optically active biomacromolecules (Brocks, 2006), so the methods applied in these preclinical early stages must allow evaluating these properties in an enantioselective way. This need comes from the growing interest of the pharmaceutical industry in the development of single-enantiomer formulations, and also from the regulations concerning racemic drugs, which indicate that enantioselective analysis should be performed also over racemates (Food and Drug Administration, 1992; European Medicines Agency, 1993). Capillary electrophoresis (CE) is a convenient analytical technique to be applied for these preclinical studies. It provides advantageous possibilities for the chiral analysis of small molecules and also for the in-line evaluation of some pharmacokinetic and pharmacodynamic processes, such as the binding of drugs to plasma proteins or their behavior in different enzymatic reactions. Its main features, which are extremely interesting for these applications, are speediness of analysis, low consumption of chemicals and reagents, ease of automation, high peak efficiencies and low environmental impact (Lin et al., 2003). The main purpose of this Thesis is the development and application of capillary electrophoretic methodologies for the in vitro enantioselective evaluation of pharmacological properties of drugs, in order to provide to the pharmaceutical industry fast and reliable alternatives for the preclinical stages of drug development. It is divided into three main parts: development of methods and theoretical studies for chiral separations of xenobiotics by CE (Papers I-IV), evaluation of the enantioselective binding of drugs to plasma proteins (Papers V-VII) and study of enzymatic reactions by electrophoretically mediated microanalysis, EMMA (Papers VIII-X). A powerful chiral selector, the highly sulfated β-cyclodextrin (HS-β-CD), has been widely used along this Thesis to perform enantioseparations. So, the first and second studies of this Thesis are theoretical; about its enantiorecognition ability. In Paper I, apparent binding constants between HS-β-CD and enantiomers of eight psychoactive drugs were estimated by electrokinetic chromatography-complete filling technique (EKC-CFT). The experimental mobility data of both enantiomers were fitted vs. the cyclodextrin concentration using a non-linear model that allows the estimation of apparent binding constants and overall limit mobilities. From these estimations, it was possible to calculate the thermodynamic (αt) and electrophoretic (αe) enantioselectivities of the separation process. The results show that this cyclodextrin strongly binds to the enantiomers of these basic drugs, with high enantioselectivity in most of the cases. The binding constants of HS-β-CD to the studied drugs are equal or higher than those found in the literature for other compounds (Vaccher et al., 2005, Lipka et al., 2007). Both thermodynamic (due to the difference between the apparent binding constants of the enantiomers) and electrophoretic (related to the difference between the overall complex enantiomer-CD mobilities) enantioselectivities were found to be responsible for the enantioseparation with the HS-β-CD, with a major contribution of αt . However, in one of the cases, where no thermodynamic enantioselectivity was found, only the electrophoretic one was enough to achieve complete separation of the enantiomers. The use of complete filling technique for the evaluation of binding constants, which is discussed in this Thesis, is presented as an alternative to conventional electrokinetic chromatography with a saving on chiral selector of around 99%. The second Paper included in this Thesis is a quantitative structure-property relationship study that models the enantiorecognition ability of the HS-β-CD for basic compounds in EKC, by relating the resolution obtained for forty xenobiotics (drugs and pesticides) with some of their structural properties. This is an attempt to provide researchers in the field of enantioseparations an alternative to the usually employed trial-and-error procedures for the development of chiral methods. A discriminant-partial least squares analysis over a single response variable (DPLS1) has been performed using a categorical resolution (Rs) value as y-vector and the structural properties of the xenobiotics as X-matrix. Only four structural variables were selected as significant in the final model: logarithm of octanol-water partition coefficient estimated at pH 7.4 (lgD), polar surface area (PSA), number of hydrogen bond donors (HBD) and acceptors (HBA). From the de-scaled coefficients of the model, an explicit equation that relates the categorical Rs with these four variables was obtained: Rs = 2.354 + 0.095lgD – 0.008PSA – 0.159HBD – 0.137HBA. This model shows an explained variance of 72.4%. For those xenobiotics whose predicted Rs is not so high (i.e., expected chiral separation only under concrete experimental conditions) a multivariate optimization of the most influential experimental conditions affecting enantioseparation (cyclodextrin concentration, pH of the background electrolyte (BGE) and capillary temperature) has been proposed, via a Box-Behnken experimental design and a posterior adjust of the experimental results to a PLS2 model, which allows estimating the migration time and the Rs for each set of experimental conditions. Paper III is an application of the enantioseparation of the antidepressant fluoxetine with HS-β-CD to the chiral analysis of three pharmaceutical formulations. The separation conditions were adjusted in order to avoid a matrix interference and a suitable EKC-CFT method has been obtained, which allows the quantification of both fluoxetine enantiomers in less than 2 min with a Rs of 2.4. A partial validation of the chiral analytical method was performed following the guidance of the International Conference on Harmonization (ICH) and the US Pharmacopeia in terms of identity, linearity, precision and accuracy. Good analytical features were obtained: determination coefficients (R2) of 0.996 for the calibration curves of both enantiomers, relative standard deviations (RSD) less than 20%, obtained under intermediate precision conditions, and recoveries of 92 ± 13 and 105 ± 6 % for the first and second eluted enantiomers, respectively. For all samples, the content of racemic fluoxetine was within specifications of the US Pharmacopeia (20 mg ± 15%), and stereoisomer ratios were around 1. So, the suitability of HS-β-CD for the enantioseparation of basic drugs has been proved here, not only with theoretical studies but also with an application to chiral pharmaceutical analysis. An approach of non-aqueous capillary electrophoresis (NACE) to the chiral separation of drugs, developed during a research stay in the Katholieke Universiteit of Leuven, is described in Paper IV. It responded to the interest on developing analysis methods based on non-aqueous systems that could be able to determine new active pharmaceutical ingredients (APIs) which are non-soluble in aqueous or methanolic mediums. Many drugs in the pipeline suggested by combinatorial chemistry show low aqueous solubility due to high molecular weight. If a badly soluble lead molecule has very good potency and low toxicity, the drug might go into further development anyway, and in these cases chiral methods for their analytical control may be developed. In this work, the use of dimethyl sulfoxide (DMSO) is proposed as an alternative to the most commonly used BGEs of alcoholic nature, due to its lower volatility and hazardousness, and better solvent properties for drugs with low polarity. However, it may be taken into account that the enantioseparation is disfavored in the DMSO medium because the intermolecular forces responsible for the enantiorecognition are weaker in organic media (Chankvetadze and Blaschke, 2001). The enantioseparation of three drugs, verapamil, pindolol and fenfluramine, has been performed with this NACE methodology, using univariate optimization in order to select the best separation conditions. Finally, DMSO-based BGEs containing a variable amount of methanol (0-30%), 0.5-1 M HAc, 125 mM NH4Ac and 40 mM carboxymethyl-γ-cyclodextrin were selected, with a capillary temperature of 15 ºC and a separation voltage of 30 kV. Using these conditions, Rs values of 1.5, 2.0 and 1.2 were obtained for verapamil, pindolol and fenfluramine, respectively. The electric current was stable during all the separations performed, despite the fact that one of the most common drawbacks of NACE is current breakdowns. Papers V-VII of this Thesis deal with the enantioselective evaluation of an important pharmacokinetic property at the level of drugs distribution, the protein binding. The amount of drug that binds to plasma proteins, as well as the strength of this binding, influences considerably the availability of the drug for reaching target organs and also for being eliminated. As plasma proteins are optically active molecules, chiral drugs can show different binding properties between enantiomers. Therefore, the development of fast and reliable procedures for the in vitro evaluation of enantioselective drug-protein binding is interesting for the pharmaceutical industry research. The most abundant protein in human plasma is albumin (HSA), and it presents a high degree of enantioselectivity in its binding with drugs. In this Thesis, the evaluation of enantioselective binding of drugs to HSA and total plasma proteins has been performed by ultrafiltration followed by chiral analysis by EKC. In ultrafiltration, a pre-equilibrated drug-protein mixture is filtered through a membrane that retains the protein and only allows the pass of the unbound drug fraction. This unbound fraction is then analyzed, here using chiral EKC. Paper V points out some weak aspects of the experimental methodologies and mathematical models previously published for the study of protein binding (Katrahalli et al., 2010; Fielding et al., 2005), and proposes a novel strategy for a reliable binding evaluation. An extended discussion concerning the different mathematical approaches to protein binding is performed, using the enantioselective binding of the antidepressant fluoxetine to HSA as an example. The analysis of fluoxetine enantiomers has been performed here using HS-β-CD as chiral selector in CFT, in a 30 mM phosphate buffer of pH 7.0. The separation temperature and voltage have been fixed at 30 ºC and 15 kV. The proposed strategy implies working close to physiological conditions, thus keeping always the ratio between the drug concentration (D) and the protein concentration (P) lower than 0.5, and P near the physiological level (around 475 μM). In this situation, a simple binding model that assumes that only one kind of binding site is occupied in the protein molecule and the stoichiometry of the binding is 1:1 can be used, always confirming these assumptions via other equations. Also, data were inspected in order to detect and eliminate outliers that could affect the reliability of the estimations. Enantiomer-protein binding constants (K1) have been estimated for fluoxetine, as well as the enantioselectivity, defined as the ratio between binding constants. Finally, the percentage of protein binding (PB%), which is an interesting parameter from a pharmacokinetic point of view, has been also estimated for both fluoxetine enantiomers, being 95.2 and 90.0% for the first and second eluted enantiomers, respectively. The correspondent enantioselectivity is around 2, in favor of the first eluted enantiomer. Still in the field of enantioselective drug-protein interactions, Papers VI and VII study the enantioselective binding of the hypnotic zopiclone and the antidepressant nomifensine to HSA and total plasma proteins, also by ultrafiltration and chiral EKC using the partial (PFT) or complete filling techniques. In Paper VI, the enantioseparation of zopiclone with carboxymethyl-β-cyclodextrin (CM-β-CD) is adjusted for the analysis of the unbound fractions after ultrafiltration. A solution containing 30 mM CM-β-CD in 50 mM Tris buffer at pH 6.0 has been used as chiral selector in PFT, injecting it at 0.5 psi during 99 s prior to samples injection. The chiral separation has been performed at 25 ºC by applying 15 kV. The mathematical approaches and experimental designs developed in Paper V have been also applied here to calculate the binding constants, enantioselectivity and protein binding. The PB% values to HSA were found to be 47 and 36% for S- and R-zopiclone, respectively, and to total plasma proteins 45 and 49%, respectively. These values were in agreement with those reported in the literature for racemic zopiclone, around 45% (Gaillot et al., 1983; Spanish Drug Agency, 2011). The enantioselective binding of nomifensine to HSA and total plasma proteins is evaluated in Paper VII, in this case using 30 mM heptakis-(2,3,6-O-methyl)-β-cyclodextrin as chiral selector in CFT for the enantioseparation of the unbound fraction, with the same BGE and voltage as in Paper VI but with a capillary temperature of 50 ºC. The experimental design of calibration curves and samples was repeated in two independent sessions in order to check the inter-day precision of the procedure. As no significant differences were found between the data of both working sessions, all data were used together for estimations. The PB% to HSA was estimated at 40 and 63% for the first and second eluted enantiomers respectively. For the binding to total plasma proteins, the estimated values were 63 and 64% respectively. By comparing these values, it can be concluded that the second eluted enantiomer of nomifensine binds mainly to HSA while the first enantiomer binds also to other plasma proteins. The experimental design and mathematical approaches proposed in this Thesis for a reliable estimation of enantioselective protein binding with ultrafiltration and chiral EKC have demonstrated to be a robust tool which allows obtaining good in vitro estimates in near-physiological conditions, thus providing valuable data from a pharmacokinetic point of view. Enantioselective protein binding data for fluoxetine, zopiclone and nomifensine have been estimated here, thus completing the information available in the literature about these drugs. The third part of this Thesis is related to the development of in-capillary enzymatic reactions by electrophoretically mediated microanalysis (EMMA). In EMMA the reagents are sequentially introduced in an electrophoretic capillary and left to mix and react for a fixed time. The separation of substrates, enzymes and products is then performed by electrophoresis. The main advantage of EMMA is that the reaction takes place in a nanoliter scale, so the consumption of reagents is extremely low. Furthermore, it is fully automated since the reaction and the separation take part in a unique step inside the capillary, which is another important advantage for screening procedures. In Paper VIII an EMMA screening methodology for the evaluation of acetylcholinesterase (AChE) inhibitors has been developed and applied to the study of five drugs with known inhibitory activity. Tacrine has been used as model compound in order to optimize the method conditions. The progress of the enzymatic reaction of the hydrolysis of acetylthiocholine in presence of AChE and the inhibitors has been determined by measuring the peak area of the reaction product thiocholine. A “sandwich” injection has been performed by injecting the substrate plug between two enzyme plugs. The plugs’ mixing has been performed by simple diffusion, with an incubation time of 2 min. The BGE for the reaction and separation was 30 mM borate-phosphate buffer at pH 8.0, the capillary temperature has been set at 37 ºC and the separation voltage at 15 kV. Due to the dilution of solutes in the EMMA methodology, a correction may be performed in calculations to achieve accurate results. Here, a dilution factor is estimated by comparing the calculated inhibitory potency of tacrine with that reported with the reference method (Andrisano et al., 2001), and applied then to all calculations. The proposed screening methodology has proved to be useful for the estimation of inhibitory constants, inhibitory potency, a qualitative approach to the inhibition mechanism and the percentage of inhibition of tacrine, edrophonium, neostigmine, pyridostigmine and eserine. The screening results show that according to their percentage of inhibition under fixed conditions, the order of inhibitor potency for these compounds is tacrine > edrophonium > neostigmine > eserine > pyridostigmine. This screening procedure, with an analysis time shorter than 5 min, can be employed for the evaluation of new potential AChE inhibitors. Continuing with the use of EMMA methodologies for the evaluation of drug-enzyme interactions, Papers IX and X are studies of enantioselective metabolism by different isoforms of the cytochrome P450. In these studies, the capillary acts simultaneously as reactor and chiral separation system, thus providing enantioselective information with a fast, fully automated assay. The chiral separation is performed in both cases using HS-β-CD and the partial filling technique. Paper IX deals with the enantioselective metabolism of the Ca+2-channel blocker verapamil by CYP3A4, the most important isoform of cytochrome P450 in humans. Different possibilities for the EMMA assay have been considered and variables have been optimized prior to calculation of the Michaelis-Menten parameters for the enantioselective metabolism kinetics. The selected experimental conditions for the EMMA assay included a “sandwich” injection of the substrate plug between two enzyme plugs, and two plugs of incubation buffer before and after the “sandwich” in order to give to the enzyme its adequate reaction medium. The mixing of plugs has been performed by simple diffusion during an incubation time of 5 min. After that, the separation of all the reaction mixture, including the enantiomers of verapamil and its major metabolite norverapamil, has been performed in the same capillary with the following conditions: 50 mM phosphate at pH 8.8 as BGE, 2.5% HS-β-CD injected at 10 psi/2 min, 25ºC and 20 kV with a little pressure of 0.2 psi in order to shorter the migration times. The result is a fully automated methodology that allows the enantioselective evaluation of verapamil metabolism by CYP3A4 in less than 35 min including capillary preconditioning, injection, incubation and separation. Michaelis-Menten parameters (Km and Vmax) have been calculated for the overall enantioselective metabolism of verapamil by CYP3A4. Km values have been estimated as 51 ± 9 and 47 ± 9 μM for S- and R-verapamil, respectively, while Vmax estimates were 22 ± 2 and 21 ± 2 pmol•min-1•(pmol CYP)-1 for S- and R-verapamil, respectively. Intrinsic clearances, defined as the amount of plasma from which a xenobiotic is removed in a certain time, and estimated in vitro as Vmax/Km (Kroemer et al., 1992), have been also calculated for both enantiomers. The enantioselective metabolism of fluoxetine by other CYP450 isoform, CYP2D6, is estimated in Paper X following the same methodology as in the previous work. The EMMA conditions from Paper IX were directly applied, while the separation conditions were adjusted in order to separate the enantiomers of fluoxetine and its major metabolite norfluoxetine. The influence of the most important variable on the enantioseparation, the concentration of HS-β-CD, was studied and a final concentration of 1.25% was selected for the separation of the reaction mixture. The other separation conditions were kept as in Paper IX. Kinetic parameters have been estimated by non-linear fitting of experimental data to the Michaelis-Menten equation. Km values were found to be 30 ± 3 μM for S-fluoxetine and 39 ± 5 μM for R-fluoxetine. Vmax estimates were 28.6 ± 1.2 and 34 ± 2 pmol•min-1•(pmol CYP)-1 for S- and R-fluoxetine, respectively. The kinetic assay was repeated using a single enantiomer (R-fluoxetine) instead of the racemic mixture. Similar results were obtained indicating that the use of the racemate is a good option for obtaining enantioselective estimations. The usefulness of EMMA as screening methodology for the in vitro evaluation, enantioselective or not, of drug-enzyme interactions has been proved in this Thesis. The developed methods allow to estimate kinetic and inhibition parameters in fast assays with low consumption of reagents and samples. The coupling of EMMA with the enantioseparation of substrates and products in a unique step carried out in the CE system provides valuable enantioselective information about the pharmacokinetic or pharmacodynamic processes evaluated. All the methods proposed and applied in this Thesis (chiral separations, prediction models, enantioselective protein binding evaluation and drug-enzyme interaction) can be applied in the pharmaceutical industry to obtain useful in vitro information in the preclinical phases of drug development and for the enantioselective quality control of raw materials, synthesis intermediates and final products. References:- Andrisano, V., Bartolini, M., Gotti, R., Cavrini, V., Felix, G. (2001) Determination of inhibitors¿ potency (IC50) by a direct high-performance liquid chromatographic method on an immobilised acetylcholinesterase column. Journal of Chromatography B 753, 375-383. - Brocks, D.R. (2006) Drug disposition in three dimensions: an update on stereoselectivity in pharmacokinetics. Biopharmaceutics and Drug Disposition 27, 387-406. - Chankvetadze, B., Blaschke, G. (2001) Enantioseparations in capillary electromigration techniques: Recent developments and future trends. Journal of Chromatography A 906, 309-363. - European Medicines Agency. (1993) Investigation of Chiral Active Substances. Available in: http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/2009/09/WC500002816.pdf [accessed February 2013] - Fielding, L., Rutherford, S., Fletcher, D. (2005) Determination of protein-ligand binding affinity by NMR: observations from serum albumin model systems. Magnetic Resonance in Chemistry 43, 463-470. - Food and Drug Administration. (1992) Development of New Stereoisomeric Drugs. Available in: http://www.fda.gov/drugs/guidancecomplianceregulatoryinformation/guidances/ucm122883.htm [accessed February 2013] - Gaillot, J., Houghton, G.W., Marc Aurele, J., Dreyfus, J.F. (1983) Pharmacokinetics and metabolism of zopiclone. Pharmacology 27, 76-91. - Katrahalli, U., Jaldappagari, S., Kalanur, S.S. (2010) Probing the binding of fluoxetine hydrochloride to human serum albumin by multispectroscopic techniques. Spectrochimica Acta Part A 75, 314-319. - Kroemer, H.K., Echizen, H., Heidemann, H., Eichelbaum, M. (1992) Predictability of the in vivo metabolism of verapamil from in vitro data: contribution of individual metabolic pathways and stereoselective aspects. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 260, 1052-1057. - Lin, C.C., Li, Y.T., Chen, S.H. (2003) Recent progress in pharmacokinetic applications of capillary electrophoresis. Electrophoresis 24, 4106-4115. - Lipka, E., Danel, C., Orhan, H., Bonte, J.P., Vaccher, C. (2007) Chiral resolution of melatoninergic ligands by EKC using highly sulfated CDs. Electrophoresis 228, 3915-3921. - Spanish Drug Agency (Agencia Española del Medicamento). Available in: http://www.aemps.es [accessed March 2011] - Vaccher, M.P., Lipka, E., Bonte, J.P., Foulon, C., Gossens, J.F., Vaccher C. (2005) Enantiomeric analysis of baclofen analogs by capillary zone electrophoresis, using highly sulfated cyclodextrins: inclusion ionization constant pKa determination. Electrophoresis 26, 2974-2983. | en_US |
| dc.description.abstract | El desarrollo de nuevos fármacos es un proceso largo, complejo y costoso que incluye la evaluación en diferentes etapas de propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas de la nueva molécula. En las primeras etapas del desarrollo de un fármaco es habitual el uso de métodos in vitro para el cribado de alto rendimiento de las propiedades de nuevas moléculas, con el objetivo de obtener datos preliminares sobre la potencial actividad farmacológica de una molécula y sobre su farmacocinética. Cuando se emplean moléculas quirales, tanto sus propiedades farmacocinéticas como las farmacodinámicas pueden presentar un cierto grado de enantioselectividad debido a la interacción con biomacromoléculas ópticamente activas (Brocks, 2006), por lo que los métodos aplicados en estas primeras etapas preclínicas deben permitir la evaluación de estas propiedades de una manera enantioselectiva. Esta necesidad proviene del creciente interés de la industria farmacéutica en el desarrollo de formulaciones enantioméricamente puras, y también de las normativas en torno a medicamentos racémicos, que indican que el control de calidad realizado sobre estos fármacos también debe ser enantioselectivo (Food and Drug Administration, 1992; European Medicines Agency, 1993). La electroforesis capilar (CE, del inglés capillary electrophoresis) es una técnica analítica conveniente para abordar estos estudios preclínicos. Proporciona ventajosas posibilidades para el análisis quiral de moléculas pequeñas y para la evaluación en línea de numerosos procesos farmacocinéticos y farmacodinámicos, como la unión de fármacos a las proteínas plasmáticas o su comportamiento en diferentes reacciones enzimáticas. Sus principales características, extremadamente interesantes para estas aplicaciones, son rapidez de análisis, bajo consumo de reactivos y muestras, facilidad de automatización, elevadas eficacias de pico y bajo impacto medioambiental (Lin y col., 2003). El principal objetivo de esta Tesis es el desarrollo y aplicación de metodologías electroforéticas para la evaluación enantioselectiva in vitro de propiedades farmacológicas de medicamentos, con el fin de proporcionar a la industria farmacéutica alternativas rápidas y fiables en las fases preclínicas del desarrollo de nuevos fármacos. Esta Tesis se divide en tres bloques principales: desarrollo de métodos y estudios teóricos para la separación quiral de xenobióticos mediante electroforesis capilar (Artículos I-IV), evaluación de la unión enantioselectiva de fármacos a las proteínas plasmáticas (Artículos V-VII) y estudio de reacciones enzimáticas empleando microanálisis mediante electroforesis (EMMA, del inglés electrophoretically mediated microanalysis) (Artículos VIII-X). Los dos primeros trabajos incluidos en esta Tesis son estudios teóricos sobre la capacidad de enantioreconocimiento de la β-ciclodextrina altamente sulfatada (HS-β-CD, del inglés highly sulfated β-cyclodextrin), potente selector quiral que se ha utilizado en una gran parte de las separaciones quirales desarrolladas en esta Tesis. En el Artículo I se han estimado constantes de unión aparentes entre la HS-β-CD y los enantiómeros de ocho fármacos psicoactivos empleando cromatografía electrocinética y la técnica del llenado completo del capilar (EKC-CFT, del inglés electrokinetic chromatography-complete filling technique). Los datos experimentales de movilidad electroforética de ambos enantiómeros se representaron frente a la concentración de ciclodextrina empleando un modelo de ajuste no lineal que permite la estimación de constantes de unión aparentes y movilidades límite. A partir de estas estimaciones se calcularon las enantioselectividades termodinámica (αt) y electroforética (αe) del proceso de separación. Los resultados mostraron que esta ciclodextrina se une fuertemente a los enantiómeros de los ocho fármacos básicos seleccionados, con elevada enantioselectividad en la mayoría de los casos. Las constantes aparentes de unión de la HS-β-CD a los fármacos estudiados son iguales o mayores que las descritas en la bibliografía para otros compuestos (Vaccher y col., 2005, Lipka y col., 2007). Ambas enantoselectividades, termodinámica (relacionada con las diferencias entre las constantes de unión aparentes de ambos enantiómeros) y electroforética (debida a las diferentes movilidades de los complejos enantiómero-ciclodextrina), resultaron ser responsables de la separación quiral con HS-β-CD, aunque con una mayor contribución de αt. Sin embargo, en uno de los casos en el que no se vio enantioselectividad termodinámica, los enantiómeros se resolvieron completamente debido únicamente a la enantioselectividad electroforética. Por otro lado, el uso de la técnica del llenado completo del capilar para la evaluación de constantes de unión se presenta en esta Tesis como una alternativa a la cromatografía electrocinética convencional con un ahorro en selector quiral en torno al 99%. El segundo Artículo incluido en esta Tesis es un estudio de relación cuantitativa estructura-actividad que modela la capacidad de enantioreconocimiento de la HS-β-CD para compuestos básicos en EKC, relacionando la resolución obtenida para cuarenta xenobióticos (fármacos y plaguicidas) con algunas de sus propiedades estructurales. Este trabajo proporciona a los investigadores en el campo de las separaciones quirales una alternativa a los procedimientos habituales de ensayo y error para el desarrollo de métodos enantioselectivos. Se llevó a cabo una regresión de mínimos cuadrados parciales discriminante sobre una variable respuesta (DPLS1, del inglés discriminant-partial least squares) empleando como vector y un valor categórico de resolución (Rs) y como matriz X las propiedades estructurales de los xenobióticos. Únicamente se seleccionaron cuatro variables estructurales como significativas en el modelo final: logaritmo del coeficiente de partición octanol-agua estimado a pH 7,4 (lgD), área superficial polar (PSA), número de dadores (HBD) y aceptores (HBA) de enlaces de hidrógeno. A partir de los coeficientes no escalados del modelo, se obtuvo una ecuación explícita que relaciona el valor categórico de Rs con las cuatro variables estructurales seleccionadas: Rs = 2,354 + 0,095lgD – 0,008PSA – 0,159HBD – 0,137HBA. El modelo seleccionado presentó una varianza explicada del 72,4%. Para aquellos xenobióticos cuya Rs predicha no es muy elevada, que puede interpretarse como posible separación quiral pero sólo en determinadas condiciones experimentales, se propuso una optimización multivariante de las tres condiciones experimentales más influyentes en la enantioseparación (concentración de ciclodextrina, pH del tampón de separación (BGE, del inglés background electrolyte) y temperatura del capilar), a través de un diseño experimental Box-Behnken y un ajuste posterior de los resultados experimentales a un modelo PLS2, que permite la estimación del tiempo de migración y la resolución para cada conjunto de condiciones experimentales. El Artículo III es una aplicación de la enantioseparación del antidepresivo fluoxetina con HS-β-CD al análisis quiral de tres formulaciones farmacéuticas. Las condiciones de separación se optimizaron para evitar una interferencia de la matriz y se obtuvo un método de separación adecuado mediante EKC-CFT que permite la cuantificación de ambos enantiómeros de fluoxetina en menos de 2 minutos con un valor de Rs de 2,4. Se llevó a cabo una validación parcial del método quiral siguiendo las indicaciones de la International Conference on Harmonization (ICH) y de la US Pharmacopeia sobre identidad, linearidad, precisión y exactitud. Se obtuvieron buenas características analíticas: coeficientes de determinación (R2) de 0,996 para las curvas de calibrado de ambos enantiómeros, desviaciones estándar relativas (RSD, del inglés relative standard deviation) inferiores al 20%, obtenidas en condiciones de precisión intermedia, y recuperaciones de 92 ± 13 y 105 ± 6 % para el primer y segundo enantiómero eluídos, respectivamente. Para todas las muestras se obtuvo un contenido en fluoxetina racémica dentro de las especificaciones de la US Pharmacopeia (20 mg ± 15%), con relaciones estereoisoméricas en torno a 1. Así pues, en esta Tesis se ha demostrado la idoneidad de la HS-β-CD para la enantioseparación de fármacos básicos, no sólo con estudios teóricos sino también con una aplicación al análisis quiral de productos farmacéuticos. En el Artículo IV se describe una aplicación de la electroforesis capilar no acuosa (NACE, del inglés non-aqueous capillary electrophoresis) a la separación quiral de fármacos, llevada a cabo durante una estancia de investigación en la Katholieke Universiteit of Leuven. Este trabajo responde al interés en desarrollar metodologías basadas en sistemas no acuosos que sean capaces de disolver y analizar nuevos principios activos que sean insolubles en medios acuosos o metanólicos. Muchos fármacos en desarrollo sugeridos por aplicación de la química combinatoria presentan baja solubilidad en agua debida a un elevado peso molecular. Si una molécula objetivo poco soluble en medios acuosos presenta buena potencia y baja toxicidad, puede resultar de interés continuar en fase de desarrollo a pesar de esta baja solubilidad y en estos casos se requieren métodos de análisis quiral para su control analítico. En este trabajo se propuso el uso de dimetilsulfóxido (DMSO) como alternativa a los BGEs de naturaleza alcohólica más comúnmente empleados, debido a su baja volatilidad y toxicidad y mejores propiedades disolventes para moléculas poco polares. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que la enantioseparación en DMSO se encuentra desfavorecida debido a que las fuerzas intermoleculares responsables del enantioreconocimiento son más débiles en medios orgánicos (Chankvetadze y Blaschke, 2001). Se llevó a cabo la separación quiral de tres fármacos, verapamilo, pindolol y fenfluramina, mediante NACE y empleando una optimización univariante para la selección de las mejores condiciones experimentales. Finalmente, se seleccionaron BGEs basados en DMSO y que contenían proporciones variables de metanol (0-30%), HAc 0,5-1 M, NH4Ac 125 mM y carboximetil-γ-ciclodextrina 40 mM, con una temperatura de separación de 15 ºC y un potencial aplicado de 30 kV. Empleando estas condiciones se obtuvieron valores de Rs de 1,5; 2,0 y 1,2 para verapamilo, pindolol y fenfluramina, respectivamente. La corriente fue estable durante todas las separaciones llevadas a cabo, a pesar de que uno de los principales problemas de NACE son los frecuentes cortes de corriente. Los Artículos V-VII de esta Tesis se refieren a la evaluación enantioselectiva de una importante propiedad farmacocinética al nivel de la distribución de fármacos, la unión a proteínas plasmáticas. La cantidad de un fármaco que se une a las proteínas plasmáticas, así como la fuerza de esta unión, influyen considerablemente en la disponibilidad de los fármacos para alcanzar órganos diana y también para su eliminación. Dado que las proteínas plasmáticas son moléculas ópticamente activas, los fármacos quirales pueden presentar diferencias en las propiedades de unión de sus enantiómeros a éstas. Así pues, el desarrollo de metodologías rápidas y fiables para la evaluación in vitro de la unión enantioselectiva de fármacos a las proteínas plasmáticas resulta de gran interés para la investigación en la industria farmacéutica. La proteína más abundante en el plasma humano es la albúmina (HSA, del inglés human serum albumin), que presenta un elevado grado de enantioselectividad en su unión a fármacos. En esta Tesis se ha evaluado la unión enantioselectiva de fármacos a HSA y al total de las proteínas plasmáticas mediante ultrafiltración seguida de análisis quiral mediante EKC. En la ultrafiltración se filtra una mezcla pre-equilibrada de fármaco y proteína a través de una membrana que retiene la proteína y sólo permite el paso de la fracción libre de fármaco. Esta fracción libre se analiza posteriormente, en este caso empleando EKC quiral. El Artículo V destaca algunos aspectos débiles de las metodologías experimentales y modelos matemáticos previamente publicados para el estudio de la unión a proteínas plasmáticas (Katrahalli y col., 2010; Fielding y col., 2005), y propone una estrategia novedosa para una evaluación fiable de la unión a proteínas. Se lleva a cabo una amplia discusión acerca de los diferentes modelos matemáticos de unión a proteínas, empleando como ejemplo la unión enantioselectiva del antidepresivo fluoxetina a HSA. El análisis enantioselectivo de fluoxetina se realizó empleando HS-β-CD como selector quiral en el modo de llenado completo del capilar, en un tampón fosfato 30 mM de pH 7,0. La temperatura y el potencial de separación se fijaron a 30 ºC y 15 kV respectivamente. La estrategia propuesta implica trabajar en condiciones cercanas a las fisiológicas, por tanto, manteniendo el cociente entre la concentración de fármaco (D) y la de proteína (P) por debajo de 0,5; y P cerca del nivel fisiológico (en torno a 475 μM). En estas condiciones, se puede emplear un modelo simple de unión que considera que sólo se ocupa un tipo de sitio de unión en la molécula de proteína y que la estequiometría de dicha unión es 1:1, siempre y cuando estas consideraciones se confirmen a través de otras ecuaciones. Además, los datos fueron evaluados con el fin de detectar y eliminar valores anómalos que pudieran afectar a la fiabilidad de las estimaciones. Se estimaron para ambos enantiómeros de fluoxetina constantes de unión enantiómero-proteína (K1), así como la enantioselectividad en el proceso de unión, definida como el cociente entre ambas constantes. Finalmente, se estimó para ambos enantiómeros el porcentaje de unión a proteína (PB%, del inglés protein binding), que es un parámetro interesante desde un punto de vista farmacocinético. Se obtuvieron porcentajes de 95,2 y 90,0% para el primero y segundo enantiómero eluídos, respectivamente. Se obtuvo una enantioselectividad en torno a 2 en favor del primer enantiómero eluído. Todavía en el campo de las interacciones enantioselectivas fármaco-proteína, los Artículos VI y VII estudian la unión enantioselectiva del hipnótico zopiclona y del antidepresivo nomifensina a HSA y al total de las proteínas plasmáticas, de nuevo mediante ultrafiltración y EKC quiral. En el Artículo VI, la enantioseparación de zopiclona con carboximetil-β-ciclodextrina (CM-β-CD) se ajustó para el análisis de la fracción de fármaco libre post-ultrafiltración. Se empleó como selector quiral una disolución de CM-β-CD 30 mM en tampón Tris 50 mM de pH 6,0, que se inyectó en el modo de llenado parcial del capilar aplicando una presión de 0,5 psi durante 99 s antes de la inyección de muestra. La separación quiral se llevó a cabo a 25 ºC aplicando un potencial de 15 kV. Los modelos matemáticos y diseños experimentales desarrollados en el Artículo V se aplicaron aquí para el cálculo de las constantes de unión, enantioselectividad y porcentaje de unión a las proteínas plasmáticas. Los valores de PB% a HSA fueron 47 y 36% para S- y R-zopiclona, respectivamente, mientras que los valores de PB% al total de las proteínas plasmáticas fueron 45 y 49%, respectivamente. Estos valores concuerdan con el PB% descrito en la bibliografía para zopiclona racémica, en torno al 45% (Gaillot y col., 1983; Agencia Española del Medicamento, 2011). La unión enantioselectiva de nomifensina a HSA y al total de las proteínas plasmáticas se evaluó en el Artículo VII, en este caso usando heptakis-(2,3,6-O-metil)-β-ciclodextrina 30 mM como selector quiral en el modo de llenado completo del capilar, con el mismo BGE y potencial de separación del Artículo VI pero con una temperatura del capilar de 50 ºC. El diseño experimental para la obtención de curvas de calibrado y análisis de muestras se repitió en dos sesiones independientes con el fin de evaluar la precisión inter-día del procedimiento. Como no se encontraron diferencias significativas entre los datos de ambas sesiones de trabajo, todos los datos se emplearon en conjunto para realizar las estimaciones. El PB% a HSA estimado fue de 40 y 63% para el primer y segundo enantiómero eluídos, respectivamente. Para la unión al total de proteínas plasmáticas, los valores estimados fueron de 63 y 64% respectivamente. Comparando estos valores, puede concluirse que el segundo enantiómero eluído de la nomifensina se une principalmente a la HSA, mientras que el primero se une también a otras proteínas plasmáticas. El diseño experimental y los modelos matemáticos propuestos en esta Tesis para una estimación fiable de la unión enantioselectiva de fármacos a las proteínas plasmáticas mediante ultrafiltración y EKC han demostrado ser una herramienta robusta que permite la obtención de buenas estimaciones in vitro en condiciones cercanas a las fisiológicas, proporcionando por lo tanto datos valiosos desde un punto de vista farmacocinético. En esta Tesis se han estimado datos de unión enantioselectiva de fluoxetina, zopiclona y nomifensina a las proteínas plasmáticas, completando la información disponible en la bibliografía sobre estos fármacos. La tercera parte de esta Tesis se dedica al desarrollo de reacciones enzimáticas en el interior del capilar empleando la metodología EMMA. En EMMA los reactivos se introducen secuencialmente en el capilar electroforético y se dejan mezclar y reaccionar durante un tiempo determinado. Después se lleva a cabo la separación de sustratos, enzimas y productos mediante electroforesis. La principal ventaja de la metodología EMMA es que la reacción tiene lugar a escala de nanolitros, por lo que el consumo de reactivos y muestras es extremadamente bajo. Además, es una metodología completamente automatizada, ya que la reacción y la separación tienen lugar en una única etapa en el interior del capilar, lo que constituye otra importante ventaja para su empleo en procedimientos de cribado. En el Artículo VIII se desarrolla una metodología de cribado mediante EMMA para la evaluación de inhibidores de la acetilcolinesterasa (AChE), y se aplica al estudio de cinco fármacos de actividad inhibidora conocida. Para la optimización de condiciones del método se empleó tacrina como fármaco modelo. El avance de la reacción enzimática de hidrólisis de acetiltiocolina en presencia de AChE y de los diferentes inhibidores se determinó midiendo el área de pico del producto de reacción tiocolina. Se llevó a cabo una inyección en “sándwich”, introduciendo una zona de sustrato entre dos zonas de enzima. El mezclado de las zonas se llevó a cabo mediante difusión simple, con un tiempo de incubación de 2 minutos. El tampón empleado para la reacción y la separación fue borato-fosfato 30 mM a pH 8,0; la temperatura del capilar se fijó a 37 ºC y el potencial de separación a 15 kV. Debido a la dilución de los solutos en la metodología EMMA, se realizó una corrección en los cálculos para obtener una buena exactitud en los resultados. Se estimó un factor de dilución comparando la potencia inhibitoria de la tacrina calculada en este trabajo con la descrita en la bibliografía empleando el método de referencia (Andrisano y col., 2001). Dicho factor se aplicó posteriormente a todos los cálculos realizados. La metodología de cribado propuesta ha demostrado ser de utilidad para la estimación de constantes de inhibición, potencia inhibitoria, una aproximación cualitativa al mecanismo de inhibición y el porcentaje de inhibición de tacrina, edrophonium, neostigmina, piridostigmina y eserina. Los resultados del cribado muestran que, de acuerdo con su porcentaje de inhibición en condiciones prefijadas, el orden de potencia inhibitoria para estos compuestos es tacrina > edrophonium > neostigmina > eserina > piridostigmina. Esta metodología de cribado, con un tiempo de análisis inferior a 5 minutos, puede ser empleada para la evaluación de nuevas moléculas que sean inhibidores potenciales de la AChE. Continuando con el uso de la metodología EMMA para la evaluación de interacciones fármaco-enzima, los Artículos IX y X son estudios de metabolismo enantioselectivo empleando diferentes isoformas del citocromo P450. En estos estudios, el capilar actúa simultáneamente como reactor y como sistema de separación quiral, de modo que proporciona información enantioselectiva a través de un ensayo rápido y completamente automatizado. La separación quiral se lleva a cabo en ambos casos usando HS-β-CD y la técnica del llenado parcial del capilar. El Artículo IX hace referencia al metabolismo enantioselectivo de verapamilo, bloqueante de canales de Ca+2, mediante CYP3A4, la isoforma más importante del citocromo P450 en humanos. En este artículo se consideraron diferentes posibilidades para el ensayo mediante EMMA y se optimizaron variables experimentales previamente al cálculo de los parámetros cinéticos de Michaelis-Menten para el metabolismo enantioselectivo del verapamilo. Las condiciones experimentales seleccionadas incluyeron una inyección tipo “sándwich” de la zona de sustrato entre dos zonas de enzima, y la inyección de dos zonas de tampón de incubación antes y después del “sándwich” con el fin de proporcionar a la enzima su medio de reacción adecuado. El mezclado de las zonas se llevó a cabo mediante difusión simple durante un tiempo de incubación de 5 min. A continuación se llevó a cabo la separación de toda la mezcla de reacción incluyendo los enantiómeros del verapamilo y su metabolito principal norverapamilo en el mismo capilar, empleando las siguientes condiciones experimentales: fosfato 50 mM de pH 8,8 como BGE, HS-β-CD al 2,5% inyectada a 10 psi/2 min, 25 ºC y separación a 20 kV con una pequeña presión de 0,2 psi con el fin de acortar los tiempos de migración. El resultado es una metodología completamente automatizada que permite la evaluación enantioselectiva del metabolismo de verapamilo por el CYP3A4 en menos de 35 minutos, incluyendo el acondicionamiento previo del capilar, inyección, incubación y separación. A partir de la ecuación de Michaelis-Menten se calcularon parámetros cinéticos (Km y Vmax) para el metabolismo global de verapamilo por el CYP3A4. Los valores de Km estimados fueron de 51 ± 9 y 47 ± 9 μM para S- y R-verapamilo, respectivamente, mientras que los valores de Vmax obtenidos fueron 22 ± 2 y 21 ± 2 pmol•min-1•(pmol CYP)-1 para S- y R-verapamilo, respectivamente. También se calcularon para cada enantiómero valores de aclaramiento intrínseco, definido como la cantidad de plasma de la cual el fármaco es eliminado por unidad de tiempo, y estimado in vitro como el cociente entre Vmax y Km (Kroemer y col., 1992). El metabolismo enantioselectivo de fluoxetina mediante otra isoforma del CYP450, CYP2D6, se evaluó en el Artículo X siguiendo la misma metodología que en el trabajo anterior. Las condiciones del ensayo EMMA empleadas en el Artículo IX se aplicaron directamente, mientras que las condiciones de separación se ajustaron con el fin de separar los enantiómeros de fluoxetina y su metabolito principal norfluoxetina. Se estudió la influencia de la variable experimental más importante en la enantioseparación, la concentración de HS-β-CD, y se seleccionó una concentración final de 1,25% para la separación de la mezcla de reacción. Las otras condiciones de separación fueron las empleadas en el Artículo IX. Se estimaron parámetros cinéticos mediante un ajuste no lineal de los datos experimentales a la ecuación de Michaelis-Menten. Los valores de Km obtenidos fueron de 30 ± 3 μM para S-fluoxetina y 39 ± 5 μM para R-fluoxetina, mientras que las Vmax estimadas fueron de 28,6 ± 1,2 y 34 ± 2 pmol•min-1•(pmol CYP)-1 para S- y R-fluoxetina, respectivamente. El ensayo cinético fue repetido empleando un único enantiómero (R-fluoxetina) en lugar de la mezcla racémica. Se obtuvieron resultados similares, lo que indica que el uso del racemato es una buena opción para la obtención de estimaciones enantioselectivas. En esta Tesis se ha demostrado la utilidad de EMMA como metodología de cribado para la evaluación in vitro, enantioselectiva o no, de interacciones fármaco-enzima. Los métodos desarrollados permiten la estimación de parámetros cinéticos y de inhibición mediante ensayos rápidos con un bajo consumo de reactivos y muestras. El acoplamiento de la metodología EMMA con la enantioseparación de sustratos y productos en una única etapa llevada a cabo en el equipo de electroforesis capilar proporciona valiosa información enantioselectiva sobre los procesos farmacocinéticos o farmacodinámicos evaluados. Todos los métodos propuestos y aplicados en esta Tesis (separaciones quirales, modelos de predicción, evaluación enantioselectiva de la unión a proteínas e interacciones fármaco-enzima) son de aplicación en la industria farmacéutica para la obtención de información útil in vitro en las fases preclínicas del desarrollo de medicamentos, y para el control de calidad enantioselectivo de materias primas, intermedios de síntesis y productos finales. Referencias: - Andrisano, V., Bartolini, M., Gotti, R., Cavrini, V., Felix, G. (2001) Determination of inhibitors¿ potency (IC50) by a direct high-performance liquid chromatographic method on an immobilised acetylcholinesterase column. Journal of Chromatography B 753, 375-383. - Brocks, D.R. (2006) Drug disposition in three dimensions: an update on stereoselectivity in pharmacokinetics. Biopharmaceutics and Drug Disposition 27, 387-406. - Chankvetadze, B., Blaschke, G. (2001) Enantioseparations in capillary electromigration techniques: Recent developments and future trends. Journal of Chromatography A 906, 309-363. - European Medicines Agency. (1993) Investigation of Chiral Active Substances. Available in: http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/2009/09/WC500002816.pdf [accessed February 2013] - Fielding, L., Rutherford, S., Fletcher, D. (2005) Determination of protein-ligand binding affinity by NMR: observations from serum albumin model systems. Magnetic Resonance in Chemistry 43, 463-470. - Food and Drug Administration. (1992) Development of New Stereoisomeric Drugs. 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| dc.format.extent | 328 p. | es_ES |
| dc.language.iso | en | es_ES |
| dc.subject | ciclodextrina | es_ES |
| dc.subject | enantioselectividad | es_ES |
| dc.subject | proteínas plasmáticas | es_ES |
| dc.subject | reacciones enzimáticas | es_ES |
| dc.subject | interacción fármaco-biomolécula | es_ES |
| dc.subject | electroforesis capilar | es_ES |
| dc.subject | separación quiral | es_ES |
| dc.title | Development and application of (bio)analytical methodologies in capillary electrophoresis. Enantioselectivity considerations | es_ES |
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| dc.subject.unesco | UNESCO::QUÍMICA::Química orgánica ::Estereoquímica y análisis conformacional | es_ES |
| dc.subject.unesco | UNESCO::QUÍMICA::Química Farmacéutica::Diseño.Síntesis y estudio nuevos fármacos | es_ES |
| dc.subject.unesco | UNESCO::QUÍMICA::Bioquímica ::Química de macromoléculas biológicas | es_ES |
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