NAGIOS: RODERIC FUNCIONANDO

Experimental evolution of genome architecture and complexity in an RNA virus

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Experimental evolution of genome architecture and complexity in an RNA virus

dc.contributor.advisor	Elena Fito, Santiago F.
dc.contributor.advisor	Zwart, Mark P.
dc.contributor.author	Willemsen, Anouk
dc.contributor.other	Departament de Bioquímica i Biologia Molecular	es_ES
dc.date.accessioned	2016-05-23T07:24:39Z
dc.date.available	2016-05-24T04:45:06Z
dc.date.issued	2016	es_ES
dc.date.submitted	24-05-2016	es_ES
dc.identifier.uri	http://hdl.handle.net/10550/53654
dc.description.abstract	The evolution of genome architecture – the dimensions and organization of an organism's hereditary material – is poorly understood. There are clear differences in genome architecture over organisms, and it is clear that this complexity can be altered on relatively short time scales. Here, three specific processes of the evolution of genome architecture in viruses are studied: (i) the reshuffling of existing elements, (ii) the decrease of genome complexity through loss of redundant or unnecessary genetic material, (iii) and the increase of genome complexity through the acquisition of new genes. These topics were addressed in vivo using Tobacco etch virus, a plant RNA virus, as a model organism. Important changes in the viral genome were generated – from changes in gene order, to duplications of existing genes, to the introduction of exogenous sequences – followed by experimental evolution to observe how these changes were accommodated. The evolved and ancestral lineages were compared by next-generation sequencing and measurements of virulence, viral accumulation and within-host competitive fitness. First, we identified multiple barriers to the evolution of alternative gene orders. Second, we observed differences in the deletion dynamics of genetically and functionally redundant sequences and we developed a model to predict the stability of gene insertions. Third, we found an exogenous sequence that was evolutionary stable in the Tobacco etch virus genome that does not appear to affect viral fitness and can act as a backup in case of failure of the viral host defense mechanism. Lastly, we observed that a host species jump can be a game changer for evolutionary dynamics, allowing unstable viruses to be competitive in alternative hosts.	en_US
dc.description.abstract	Introducción La evolución de la arquitectura del genoma – las dimensiones y la organización del material hereditario de un organismo – es poco conocida. Existe una variación asombrosa en la arquitectura genómica entre diferentes organismos. Los virus tienden a tener genomas pequeños, con un mínimo de secuencias intergénicas y típicamente con genes solapantes, los cuales se cree son una forma de compresión del genoma que permite al virus incrementar su número de proteínas sin aumentar su tamaño. Los procariotas tienen genomas compactos, pero con secuencias intergénicas más largas que los virus, y los genes con solapamientos largos son escasos. Los eucariotas presentan una amplia gama de tamaños de genoma, desde el rango de los procariotas a órdenes de magnitud más largos, y se distinguen por su organización génica en intrones y exones. Las secuencias intrónicas e intergénicas contribuyen al gran tamaño del los genomas eucariotas, pudiendo éstas constituir hasta un 60% del ADN. En contraste, los virus y procariotas consisten principalmente de ADN (o ARN) codificante, representando éste más del 85% del tamaño total del genoma. Hay un aumento notable en la complejidad del genoma desde los virus, pasando por los procariotas, hasta los eucariotas, en términos de tamaño del genoma, el número de genes, el número de elementos móviles, el número y tamaño de los intrones, y la complejidad de las regiones reguladoras. Aun así, no existen límites claros en las diferencias de la arquitectura genómica entre organismos. El descubrimiento de los virus gigantes y de bacterias simbióticas con genomas pequeños, ha eliminado la separación de genomas celulares y virales por tamaño. Por lo tanto, esto sugiere que los mecanismos principales promoviendo la divergencia de la arquitectura genómica son genético-poblacionales, y no los diferentes estilos de vida, estructuras celulares o fisiologías de los organismos. Los mecanismos genético-poblacionales, como la tasa de mutación y el tamaño efectivo de la población, podrían desempeñar un papel en la conformación de arquitecturas genómicas divergentes. La Ley de Drake describe como la tasa de mutación en todo el genoma es más o menos constante entre los organismos, por lo tanto, existe una correlación negativa entre la tasa de mutación y el tamaño de genoma. Esto también es una consecuencia de la paradoja de Eigen sobre el umbral de error: la longitud de un genoma está limitada por la tasa de mutación. Cuando la tasa de mutación está por debajo del umbral de error, una población se mantendrá en el equilibrio entre la acción de la mutación y de la selección. Los virus, que tienen genomas pequeños en comparación con las especies multicelulares, tienen una tasa de mutación más alta. En particular, las altas tasas de mutación observadas para los virus ARN son varios órdenes de magnitud superiores a las tasas de mutación observadas en la mayoría de los organismos de ADN. Una explicación para este contraste es que, a diferencia de los polimerasas de ADN, muchas polimerasas de ARN no tienen un mecanismo de corrección de errores, y por lo tanto son más propensas a introducir errores durante la replicación. Aún así, los límites de las tasas de mutación entre los virus con diferentes arquitecturas genómicas no están bien definidos, y las altas tasas de mutación de los virus de ARN son igualadas por algunos virus de ADN. Por lo tanto, se sugiere que otros aspectos como la arquitectura del genoma y la velocidad de replicación, en lugar de la baja fidelidad de la polimerasa de ARN, podrían explicar las diferencias de las tasas de mutación en los virus. Las transiciones desde organismos simples hasta organismos más complejos, parecen estar asociadas a grandes reducciones en el tamaño de la población. Cuando el tamaño poblacional es pequeño, el poder de la deriva genética aumenta, el cual crea oportunidades para la producción de nuevas y diversas características genómicas, que por el contrario serían eliminadas por la acción de la selección purificadora. Por lo tanto, se ha propuesto que un tamaño efectivo poblacional grande – como el de los virus de ARN – es un obstáculo importante para la evolución de los genomas complejos. Para estudiar la evolución de la arquitectura genómica, se optó por trabajar con el virus del grabado del tabaco (TEV). Este patógeno de planta tiene un genoma de ARN de cadena sencilla y polaridad positiva. Los virus de ARN de polaridad positiva representan el grupo de virus conocido más grande hasta la fecha, y se clasifican en tres tribus: picorna- , alfa- y flavi-like. Estos virus se caracterizan por tener grupos de genes conservados, y en especial por la disposición helicasa-polimerasa, en donde el gen de la helicasa se encuentra normalmente corriente arriba del gen de la polimerasa. En particular, la tribu picorna-like se identifica por la conservación parcial de genes esenciales. Además, estos genes esenciales tienden a estar organizados en el mismo orden, mientras que los genes no esenciales son responsables de la reorganización genómica y la recombinación entre grupos distantes de virus de las tres tribus. El genoma monopartito lineal de TEV es de aproximadamente 9.5 kb en longitud, y codifica para un único marco de lectura abierto, es decir una poliproteína. Después de la traducción, la poliproteína se procesa proteolíticamente en diez péptidos maduros, mediante la acción de proteaseas que están codificadas en el propio virus. TEV está clasificado dentro del género Potyvirus de la familia Potyviridae. Esta familia se divide en ocho géneros y todos los virus en estos géneros tienen un genoma monpartito, a excepción de los virus del género Bymovirus que tienen un genoma bipartito. Curiosamente, el orden de los genes de los diferentes miembros de la familia Potyviridae está muy bien conservado, inclusive en los Bymovirus. Objetivos, metodología y resultados Esta tesis trata de entender tres conceptos básicos sobre la evolución de la arquitectura genómica de los virus de RNA: (i) el posible aumento de su complejidad mediante la adquisición de nuevos genes, (ii) la disminución de su complejidad por pérdida de material redundante o innecesario y (iii) la reorganización de elementos ya existentes. Utilizando como sistema modelo al TEV, hemos generado cambios importantes en el genoma viral (reorganizaciones, duplicaciones y la introducción de genes exógenos), seguidos por evolución experimental de estos genomas modificados para ver cómo acomodaban los cambios introducidos. Hemos comparado por secuenciación masiva, mediciones de acumulación, virulencia y experimentos de competencia los linajes evolucionados contra los ancestrales y entre si. Los cuatro objetivos principales de este estudio se corresponden con los cuatro capítulos en esta tesis. Capítulo 1: Múltiples barreras a la evolución de órdenes alternativos de genes. El primer objetivo es comprender mejor la conservación del orden génico en los órdenes y familias de los virus. El orden en que los genes se organizan dentro de un genoma por lo general no se conserva entre especies poco relacionadas. Sin embargo, dentro de los órdenes y las familias virales, se observa una fuerte conservación en el orden génico. Los factores que limitan o promueven la diversidad en el orden génico son en su mayoría desconocidos, aunque se sabe que la regulación de la expresión génica es una limitación importante para los virus. Aquí investigamos por qué el orden de los genes se conserva en un virus de ARN de cadena positiva que codifica una única poliproteína, en el contexto de su huésped natural (multicelular). Inicialmente, hemos identificado la trayectoria más plausible por la cual los órdenes alternativos de genes podrían evolucionar. Posteriormente, se estudió la accesibilidad de los pasos clave a lo largo de esta trayectoria evolutiva mediante la construcción de dos pasos intermedios: (i) la duplicación de un gen seguido por (ii) la pérdida del gen ancestral. Se identificaron cinco barreras a la evolución de los órdenes alternativos de genes. En primer lugar, el número de posiciones viables para el reordenamiento es limitado. En segundo lugar, la eficacia viral dentro del huésped de los virus con duplicaciones de genes es baja en comparación con el virus silvestre. En tercer lugar, después de la duplicación, la copia del gen ancestral siempre se mantiene, y nunca la del gen duplicado. En cuarto lugar, los virus con un orden génico alternativo tienen una eficacia viral incluso más baja que los virus con duplicaciones de genes. En quinto lugar, después de más de medio año de evolución experimental, en aislamiento, los virus con un orden génico alternativo son aún mucho más inferiores que el virus silvestre. Nuestros resultados muestran que todos los pasos a lo largo de las trayectorias evolutivas plausibles a los órdenes génicos alternativos, son muy poco probables. Estos resultados contribuyen a nuestro entendimiento acerca de los factores que limitan y/o promueven la conservación del orden génico. Capítulo 2: Predicción de la estabilidad de duplicaciones de genes homólogos. El segundo objetivo es comprender mejor la estabilidad de la redundancia genética y cómo los virus evolucionan a tener genomas pequeños mediante la eliminación de ésta. Una de las características sorprendentes de muchos eucariotas, es la cantidad aparente de redundancia de los elementos codificantes y no codificantes de sus genomas. A pesar de sus ventajas evolutivas, hay menos ejemplos de secuencias redundantes en los genomas virales, particularmente en aquellos con genomas de ARN. La baja prevalencia de duplicación génica en los virus de ARN probablemente refleja las fuertes restricciones selectivas en contra del aumento en el tamaño de genoma. Mediante la evolución experimental de variantes de TEV hemos explorado como un genoma de ARN viral puede acomodar duplicaciones génicas potencialmente beneficiosas, y cómo la evolución adaptativa procede a eliminarlos. Hemos medido la estabilidad y los costes en la eficacia viral de los genomas del TEV con redundancia genética. Ninguno de los eventos de duplicación explorados parecen ser beneficiosos para TEV. La duplicación de un gen resultó en un virus no viable o en una reducción significativa en la eficacia viral. En todos los casos, se delecionó el gen duplicado, lo que condujo a la recuperación de la eficacia viral. Hemos observado diferencias en la dinámica de cómo se delecionan las secuencias, asociadas a la duración de los pases evolutivos, y al origen, al tamaño y a la ubicación del gen duplicado. Basado en los datos experimentales, hemos desarrollado un modelo que permite predecir la estabilidad de la redundancia genética. Con este modelo, mostramos que hay una tasa de recombinación dependiente del contexto genómico, donde la identidad y la posición de la duplicación juegan un papel. Los resultados contribuyen a nuestra comprensión de que características biológicas limitan la probabilidad de la retención de genes duplicados. Capítulo 3: Introducción de secuencias exógenas funcionales. El tercer objetivo es explorar el destino evolutivo de un aumento en el tamaño genómico, en el contexto de la transferencia horizontal de genes (THG). La THG es un mecanismo clave en la evolución de los virus y extendido en estos organismos. Sin embargo, la fuerte selección en contra de un aumento en el tamaño genómico de los virus es un impedimento para la THG. Además, la inestabilidad de los genomas virales puede impedir la innovación evolutiva. Aquí, consideramos dos posibles eventos de THG introduciendo secuencias exógenas funcionales en el genoma de TEV que están relacionadas con la supresión del silenciamiento de ARN. Mediante evolución experimental, hemos observado cómo se acomodan estas secuencias exógenas y hemos determinado su estabilidad. Uno de los eventos simula la adquisición de una nueva función, mediante THG del dominio AlkB, responsable de la reparación de daños de alquilación. Encontramos que AlkB es inestable en TEV, por lo menos en nuestra configuración experimental. El otro evento simula la adquisición de una función existente, mediante THG del supresor del silenciamiento 2b del virus del mosaico del pepino (CMV). Este gen foráneo es estable y no parece afectar al TEV en términos de acumulación y eficacia darwiniana. Además, nuestros resultados sugieren que este gen puede hacerse cargo de la supresión de silenciamiento del virus, relajando la presión de selección sobre esta función en la proteína HC-Pro del TEV. Capítulo 4: Los efectos sobre la eficacia viral de las secuencias exógenas pueden ser impredecibles en huéspedes alternativos. El cuarto objetivo es entender mejor los efectos de la virulencia y la transmisión sobre la evolución. Cuando predominan las presiones de selección entre huéspedes, la teoría sugiere que la alta virulencia podría dificultar la transmisión de microparásitos entre huéspedes, y por lo tanto, que la virulencia evolucionaría hacia niveles más bajos, lo cuál optimizaría la transmisión entre huéspedes. Los microparásitos con una alta virulencia también pueden restringir el desarrollo del huésped, lo cual limitaría los recursos del huésped disponibles tanto para ellos como para su propio tamaño poblacional efectivo. Por lo tanto, la alta virulencia puede reducir la tasa de mutación y aumentar la fuerza con la que la deriva genética actúa sobre las poblaciones de microparásitos, limitando así el potencial para adaptarse al huésped y, finalmente, quizás a la capacidad de evolucionar una virulencia baja. Como una primera exploración de esta hipótesis, hemos evolucionado experimentalmente un TEV protador del marcador eGFP en dos especies de huésped semipermisivas, Nicotiana benthamiana y Datura stramonium. Después de aproximadamente 30 semanas de evolución, hemos secuenciado los genomas de los linajes evolucionados y hemos medido su eficacia viral. Sorprendentemente, el marcador eGFP no tiene ningún costo de eficacia viral en N. benthamiana, mientras que sí tenia un coste en D. stramonium, lo que sugiere que los efectos en la eficacia de las secuencias heterólogas pueden ser impredecibles en huéspedes alternativos. En N. benthamiana, el marcador eGFP es estable en todos los linajes. En uno de los seis linajes evolucionados donde observamos una eficacia mayor, sólo encontramos mutaciones puntuales. En D. stramonium, el marcador eGFP se perdió en sólo uno de los diez linajes siendo éste el único con un aumento significativo en la eficacia viral. Los patrones observados de la adaptación son consistentes con los costes de la inserción de eGFP en los diferentes huéspedes. Nuestros resultados no proporcionan soporte alguno a la hipótesis de que la alta virulencia impide la evolución. Más bien, los resultados sugieren que un salto entre huéspedes puede cambiar radicalmente la dinámica evolutiva. Conclusiones Se identificaron múltiples barreras a la evolución de órdenes génicos alternativos, revelando limitaciones importantes a la evolución viral. Los pasos intermedios para evolucionar un orden génico alternativo, están asociados a costes elevados en la eficacia viral, los cuales no son fáciles de superar. La falta de trayectorias accesibles a un orden génico alternativo sugiere una contribución a la conservación del orden génico en los potyvirus. Las duplicaciones génicas que se exploraron en este estudio son evolutivamente inestables y no parecen ser beneficiosas para TEV. La duplicación de un gen resulta en una reducción en la eficacia viral, la cual se restaura mediante la eliminación de la copia duplicada del gen. Además de la eficacia viral, la estabilidad de la copia del gen duplicado se ve afectada por una tasa de recombinación dependiente de la identidad y la posición de las duplicaciones génicas. Contrariamente a la duplicación génica, la inserción de una secuencia exógena funcional – el gen 2b del virus del CMV – ha demostrado ser evolutivamente estable, sin afectar a la eficacia viral. Además, 2b ha demostrado ser beneficioso para TEV en el caso del fallo de su propio mecanismo de supresión de silenciamento de ARN. Estos resultados sugieren que la THG entre virus de plantas es un evento posible y prometedor para futuros estudios en evolución experimental. Un salto de huéspedes puede cambiar radicalmente la dinámica evolutiva de un virus. Una secuencia exógena funcional – eGFP – era más estable en huéspedes alternativos, para los cuales TEV tenía una virulencia tanto menor como superior. Además, eGFP no parece afectar la eficacia viral en el huésped para el que TEV tiene una virulencia alta. Esto choca con nuestra hipótesis de que la alta virulencia ralentiza el ritmo de adaptación. Los resultados sugieren que cuando se considera la evolución de la arquitectura del genoma, los saltos de huéspedes podrían desempeñar un papel muy importante, al permitir que los pasos evolutivos intermedios sean competitivos.	es_ES
dc.format.extent	195 p.	es_ES
dc.language.iso	en	es_ES
dc.subject	genome evolution	es_ES
dc.subject	genome architecture	es_ES
dc.subject	virus evolution	es_ES
dc.subject	experimental evolution	es_ES
dc.subject	RNA virus	es_ES
dc.subject	genome stability	es_ES
dc.title	Experimental evolution of genome architecture and complexity in an RNA virus	es_ES
dc.type	doctoral thesis	es_ES
dc.subject.unesco	UNESCO::CIENCIAS DE LA VIDA	es_ES
dc.embargo.terms	0 days	es_ES