El cáncer gástrico (CG) cuando se diagnostica en estadio avanzado debe considerarse una enfermedad incurable, con una mediana de supervivencia global (OS) de 12 meses. La identificación de las características moleculares de CG ha llevado al descubrimiento de rutas intracelulares y genes que contribuyen a la carcinogénesis (1). Entre estas alteraciones, la amplificación de HER2, detectable en 7-14% de los casos (2), juega un papel clave en el crecimiento celular, en la supervivencia y en la diferenciación celular (3-4). Un ensayo fase III, demostró el beneficio derivado de añadir trastuzumab, anticuerpo monoclonal que se une de manera selectiva y eficiente al receptor HER2, a quimioterapia basada en platino. En dos estudios fase III, lapatinib, un inhibidor de la actividad tirosina quinasa del dímero HER1-HER2, no demostró un beneficio clínico estadisticamente significativo. A pesar de la identificación de HER2 como biomarcador, la mayoría de los pacientes tratados con trastuzumab desarrollan una resistencia al tratamiento, primaria o secundaria (5). El presente trabajo se centra en la búsqueda de mecanismos moleculares implicados tanto en la resistencia primaria como en la resistencia adquirida a tratamientos anti HER2 en cáncer gástrico HER2 positivo. Para evaluar los posibles mecanismos de resistencia primaria se ha seleccionado un panel de líneas celulares comerciales que tienen amplificado el gen HER2 (SNU216, NCI N87 y OE19) y líneas HER2-negativas (AGS, SNU484). Diferentes ensayos de viabilidad han permitido caracterizar la sensibilidad de las líneas HER2-positivas a trastuzumab y lapatinib. La línea NCI N87 destaca por ser la más sensible a los dos fármacos mientras que la línea OE19 es insensible a trastuzumab. SNU216 es insensible a ambos fármacos. Se ha realizado una caracterización molecular de estas líneas, basada en un análisis mutacional por Sequenom y un exhaustivo análisis de expresión de proteínas. Estos estudios han permitido identificar la hiperactivación de las vías de señalización PI3K/AKT/mTOR/RPS6 y MEK/MAPK, de una manera prevalente en las líneas celulares que presentan resistencia a tratamiento anti HER2. Ante las alteraciones observadas 120 se evaluó la viabilidad de todas las líneas tras el tratamiento con un inhibidor de MEK1/MEK2 (Pimasertib) y un inhibidor dual PI3K/TORC1/C2 (GSK458) solos o en combinación con trastuzumab o lapatinib. La combinación del inhibidor dual GSK 458 con trastuzumab o lapatinib disminuye de forma significativa la viabilidad celular en las líneas HER2 positivas, lo que permite concluir que la activación de PI3K/AKT/mTOR tiene un papel relevante en la resistencia primaria a tratamiento anti HER2. Para el estudio de los mecanismos moleculares implicados en resistencia secundaria a tratamientos anti HER2 se han generado diferentes modelos de resistencia tanto a trastuzumab como a lapatinib. Para ello se seleccionaron aquellas líneas celulares que presentaban mayor sensibilidad a tratamiento antiHER2 y mayor expresión de HER2, NCI N87 y OE19. Este trabajo ha permitido generar una librería de líneas resistentes a lapatinib (8 derivadas de las OE19 y 5 derivadas de las NCI N87) y 11 líneas resistentes a trastuzumab derivadas de las NCI N87, mediante tratamiento a dosis crecientes durante 4-5 meses. Para estudios posteriores se seleccionaron tres líneas resistentes a lapatinib, dos derivadas de las OE y una derivada de las NCI N87 y una línea resistente a trastuzumab. Para analizar los mecanismos moleculares implicados en la resistencia secundaria se ha realizado una serie de estudios tanto a nivel genómico (sequenom), transcriptómico (microarray de expresión, RT-PCR), como proteómico (ELISA “Pathscan array”, “Western blot”, inmuno fluorescencia) en los modelos seleccionados. Cuando se comparan las líneas parentales con las líneas resistentes derivadas, se observan cambios llamativos de expresión génica tanto a nivel de proteína como de mRNA, no observándose cambios genómicos relevantes. A nivel proteico se observa, en todos los modelos de resistencia generados, un aumento de SRC, RPS6, y STAT3 en mayor o menor medida. Los estudios funcionales, mediante ensayos de silenciamiento génico y ensayos de viabilidad tras el tratamiento con inhibidores, apuntan que PI3K/AKT/mTOR/RPS6 es una de las vías implicadas en 121 la resistencia adquirida a tratamiento anti HER2 en estos modelos. Por otro lado, se ha observado un aumento de expresión de diferentes miembros de la familia FGFR y efrinas, proteínas que se ha relacionado con la transición epitelio mesénquima (EMT) y el desarrollo de resistencia adquirida en otros modelos de tumores sólidos. Las líneas resistentes generadas efectivamente migran mas que sus parentales y expresan marcadores EMT. También debe destacarse que la línea resistente a trastuzumab presenta una mayor capacidad de formación de esferas en un cultivo 3D, característica típica de células madre de cáncer (CSCS). El análisis del transcriptoma de las OE19 y sus dos líneas derivadas, resistentes a lapatinib, ha permitido poner de relieve que 132 genes cambian su expresión de manera significativa y común en ambos modelos de resistencia. Mediante la anotación funcional de estos genes se demuestra que los procesos biológicos mas alterados en las líneas resistentes tienen que ver con el metabolismo celular, procesos de oxido-reducción, respuesta a drogas y regulación de la proliferación celular. Muchos de los genes alterados detectados en este trabajo se han asociado a mecanismos de resistencia a quimioterapia en otros modelos pero el papel en resistencia a fármacos anti diana no está tan estudiado. Un análisis detallado de los genes alterados indicó que muchos de estos genes tienen en su promotor secuencias ARE (Antioxidant Response Element), reconocidas por el factor de transcripción NRF2. Este factor induce la expresión de genes que codifican enzimas destoxificantes y antioxidantes y el aumento de su expresión/activación se ha relacionado con quimio resistencia en otros modelos. Análisis por western blot e inmunofluorescencia, demuestran un aumento de expresión y activación (translocación al núcleo) de NRF2 en todos nuestros modelos y por tanto su posible papel en la adquisición de resistencia a tratamientos anti HER2, cuestión que está siendo analizada en el laboratorio. Por otro lado, se ha puesto a punto el establecimiento de tumores, en ratones inmunodeprimidos, de todas las líneas resistentes generadas y sus parentales. Con el objetivo de realizar análisis funcionales de las alteraciones identificadas in vitro, se ha realizado un experimento piloto donde se han optimizado las condiciones para 122 la inhibición de la vía PI3K/AKT/mTOR en los tumores implantados, observándose una clara disminución de la fosforilación de su efector RPS6 por inmunohistoquímica (IHC). Aunque por el número de ratones no es estadísticamente significativo también se ha observado un reducción del crecimiento tumoral por efecto del tratamiento. Finalmente, ante la evidente relación de la activación de RPS6 con la resistencia, tanto primaria como adquirida, a tratamientos antiHER2 en líneas celulares, se planteó un ensayo retrospectivo en muestras de pacientes diagnosticados con CG HER2 positivos que habían recibido tratamiento con trastuzumab. Se practicó una IHC de RPS6 fosforilada (pRPS6) y se relacionó con la PFS (Progression Free Survival). Los resultados no alcanzan una significación estadística pero se evidencia una tendencia hacia un menor beneficio clínico en los pacientes tratados con trastuzumab que presentan un aumento de pRPS6. Fue posible además analizar a una paciente que se diagnosticó con un cáncer de unión esófago gástrica HER2 positivo en estadio localmente avanzado que recibió tratamiento basado en platino más trastuzumab como tratamiento perioperatorio. Tras 4 ciclos la paciente se volvió a evaluar y se intervino, siendo finalmente un pT3 pN2 sin evidencia de respuesta a tratamiento neo adyuvante. El análisis de RPS6 en las muestras pre y post cirugía evidenció un nivel alto de pRPS6, confirmando el posible papel de esta proteína en el desarrollo de resistencia. Claramente estos datos son solo exploratorios y necesitan de una confirmación prospectiva.