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Estudio de la implicación del receptor P2X7 en los efectos proinflamatorios de Abacavir

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Estudio de la implicación del receptor P2X7 en los efectos proinflamatorios de Abacavir

dc.contributor.advisor	Álvarez Ribelles, Angeles
dc.contributor.advisor	Esplugues Mota, Juan Vicente
dc.contributor.author	Collado Díaz, Víctor
dc.contributor.other	Departament de Farmacologia	es_ES
dc.date.accessioned	2018-07-09T07:11:49Z
dc.date.available	2018-07-10T04:45:05Z
dc.date.issued	2018	es_ES
dc.date.submitted	19-07-2018	es_ES
dc.identifier.uri	http://hdl.handle.net/10550/66938
dc.description.abstract	ABC, a nucleoside reverse transcriptase inhibitor (NRTI), is one of the most commonly used drugs in the treatment of the Human Immunodeficiency Virus (HIV) infection and has been related with an increase in cardiovascular risk. There is currently a controversy surrounding the use of ABC due to discrepancies between the results and conclusions of different studies and the lack of a clear mechanism of action that could justify its putative vascular toxicity. Different studies performed in our laboratory suggest that Abacavir is capable of inducing leukocyte accumulation, the first phase in the development of inflammatory cardiovascular diseases, and that this occurs through interaction between Mac-1 in leukocytes and endothelial ICAM-1. These effects were reproduced by didanosine - another NRTI purine analog - but not by other NRTI pyrimidine analogs, suggesting a structure-activity relationship in the proinflammatory action of ABC, further demonstrated by the implication of the P2X7 receptor in these effects. The present project aimed to corroborate the implication of the P2X7 receptor in the events in question, the importance of its location, and the mechanism of action by which ABC activates the receptor. The studies we have performed in “in vitro” and “in vivo” models confirm that the effect of ABC on leukocyte-endothelium interaction and the expression of Mac-1 is due to the P2X7 receptors located mainly in leukocytes. The activation of this membrane P2X7 purinergic receptor could be attributable to the direct action of ABC, the action of the endogenous ligand of the P2X7 receptor (ATP) or the action of CBV-TP, the active metabolite of ABC. Binding studies of the P2X7 receptor indicated that ABC is not capable of binding to the receptor at the binding site of the radioligand used, while ATP and CBV-TP do interact at that site. Both ATP and CBV-TP reproduced the effects of ABC on leukocyte-endothelium interaction and Mac-1 expression; however, the effects of ATP were not mediated specifically by the P2X7 receptor, whereas this receptor did mediate the effects of CBV-TP. The fact that we were not able to detect sufficient levels of CBV-TP to produce the evaluated effects led us to rule out this ligand as responsible for the effect of ABC. We could not exclude a role for ATP, because, although ABC did not produce changes in extracellular nucleotide levels (ATP, ADP, AMP, Adenosine), and affected neither the metabolism of these nucleotides nor the expression or enzymatic activity of the enzymes involved in this process, we did detect extracellular levels of ATP in our system (50-130 nM). Apirase (a compound that hydrolyzes ATP) reverted the effects of ABC without degrading it and was able to degrade ATP thus targeting ATP as the ligand responsible for the proinflammatory effects of ABC, raising the possibility that ABC was modulating the P2X7 receptor allosterically and sensitizing it to ATP. Thus, "docking" studies were performed and showed that ABC was not capable of interacting with binding site 1 (ATP’s binding site) but instead binds to binding site 2. Moreover, ABC and ATP, at concentrations that, by themselves, did not have effects, potentiated the proinflammatory effect of ABC, demonstrating that ABC sensitizes the receptor to the action of ATP. In addition, the proinflammatory effect of ABC was reverted by blocking connexin channels. This fact, together with the data of the intracellular reduction of ATP levels by ABC, suggests that this effect is dependent on connexin channels that release ATP into the extracellular medium. In conclusion, the proinflammatory effect of ABC is a result of the allosteric modulation of the ATP P2X7 receptor located mainly in leukocytes. At clinically relevant concentrations, this drug can activate the receptor, sensitizing it to the binding of endogenous ATP and promoting its release through the Cx43 channels present in leukocytes. This ATP acts extracellularly on the receptor itself, amplifying the process. Activation of the P2X7 receptor leads to overexpression of the β2 integrin Mac-1, which interacts with endothelial ICAM-1, causing adhesion of leukocytes to the endothelium and leading to an initial phase of the generation of an inflammatory process that can trigger adverse vascular effects compatible with the clinic associations described.	en_US
dc.description.abstract	ABC, inhibidor de la transcriptasa inversa análogo de nucleósido (ITIAN), es uno de los fármacos más utilizados en el tratamiento del VIH y se ha asociado con un aumento del riesgo cardiovascular en estos pacientes. Hoy en día existe controversia acerca de esta relación debido a la disparidad de estudios con diferentes conclusiones y a la no existencia de un mecanismo claro de acción que pudiera justificar esta toxicidad vascular. Estudios realizados en nuestro laboratorio demostraron que Abacavir era capaz de inducir acumulación leucocitaria, primer paso para el desarrollo de enfermedades cardiovasculares con componente inflamatorio, a través de la interacción entre Mac-1 leucocitaria e ICAM-1 endotelial. Estos efectos fueron reproducidos por otro ITIAN análogo de purina didanosina pero no por los ITIAN análogos de pirimidina, hecho que sugirió una posible relación estructura-actividad en la acción proinflamatoria de ABC que fue demostrada por la implicación del receptor P2X7. El presente trabajo trata de corroborar la implicación del receptor P2X7 y, la importancia de su localización, así como el mecanismo de acción mediante el cual ABC activa a dicho receptor P2X7. Nuestros estudios confirman tanto en modelos in vitro como in vivo que el efecto de ABC sobre la interacción leucocito-endotelio y sobre la expresión de Mac-1 se debe a los receptores P2X7 localizados principalmente en leucocitos. La activación de este receptor purinérgico P2X7 de membrana podría deberse a la acción directa de ABC, a la acción del ligando endógeno del receptor P2X7 (ATP) o a la del CBV-TP que es el metabolito activo de ABC. Estudios de unión al receptor P2X7 indicaron que ABC no es capaz de unirse al receptor en el sitio de unión del radioligando empleado, mientras que ATP y CBV-TP sí que estarían interaccionando en ese lugar. Tanto ATP como CBV-TP reprodujeron los efectos observados con ABC sobre la interacción leucocito-endotelio y la sobre la expresión de Mac-1, sin embargo, los efectos de ATP no fueron mediados de forma específica por el receptor P2X7 mientras que este receptor sí que participó en los efectos de CBV-TP. El hecho de que no se detectaran los niveles necesarios de CBV-TP para producir los efectos evaluados hizo que este ligando fuera descartado como responsable del efecto de ABC. El ABC no produjo cambios en los niveles de nucleótidos extracelulares (ATP, ADP, AMP, Adenosina) ni afectó al metabolismo de estos nucleótidos ni a la expresión o a la actividad enzimática de las enzimas partícipes en este proceso de degradación. Pero si se encontraron niveles de ATP endógenos en el medio extracelular de células leucocitarias y endoteliales del orden de 50-130 nM. Por otro lado, la apirasa revirtió los efectos de ABC a pesar de no tener la capacidad de degradar a este fármaco, mientras que sí hidrolizó el ATP, apuntando a ATP como mediador responsable de los efectos proinflamatorios de ABC. Por otro lado, estudios de “docking” demostraron que ABC no es capaz de interaccionar con el sitio de unión 1 (sitio de unión del ATP) pero sí que se une al sitio de unión 2. Además, ABC y ATP a concentraciones que por sí solos no producen efectos fueron capaces de producir potenciación del efecto proinflamatorio de ABC, demostrando que ABC modula el receptor P2X7 de forma alostérica sensibilizando al receptor a la acción del ATP. Además, el efecto proinflamatorio de ABC fue revertido por el boqueo de los canales de conexina. Este hecho junto con el dato de reducción de los niveles de ATP intracelular por parte de ABC, sugieren que este efecto sería dependiente de los canales de conexina que liberan ATP al exterior de la célula. En conclusión, el efecto proinflamatorio de ABC se basa en la modulación alostérica del receptor de ATP P2X7 localizado principalmente en leucocitos por parte de ABC. Este fármaco, a concentraciones clínicamente relevantes, unirse al receptor, sensibilizándolo a la acción del ATP endógeno y favoreciendo también la liberación de ATP a través de los canales de Cx43 presentes en leucocitos. Este ATP actuaría de forma extracelular sobre el propio receptor amplificando el proceso. La activación del receptor P2X7 da lugar a la sobreexpresión de la integrina β2 Mac-1 que interactúa con ICAM-1 endotelial provocando la adhesión de los leucocitos al endotelio y dando lugar a uno de los primeros pasos en la generación de un proceso inflamatorio que podría desencadenar efectos adversos vasculares compatibles con la asociación descrita en clínica.	es_ES
dc.format.extent	255 p.	es_ES
dc.language.iso	es	es_ES
dc.subject	farmacologia	es_ES
dc.subject	Terapia antirretroviral	es_ES
dc.subject	Toxicidad cardiovascular	es_ES
dc.subject	p2x7	es_ES
dc.title	Estudio de la implicación del receptor P2X7 en los efectos proinflamatorios de Abacavir	es_ES
dc.type	doctoral thesis	es_ES
dc.subject.unesco	UNESCO::CIENCIAS MÉDICAS ::Farmacología ::Análisis de medicamentos	es_ES
dc.embargo.terms	0 days	es_ES