NAGIOS: RODERIC FUNCIONANDO

The Mighty Bt: Interactions between pests and pesticidal proteins from Bacillus thuringiensis

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The Mighty Bt: Interactions between pests and pesticidal proteins from Bacillus thuringiensis

dc.contributor.advisor	Ferré Manzanero, Juan
dc.contributor.advisor	Hernández Martínez, Patricia
dc.contributor.author	Pinos Pastor, Daniel
dc.contributor.other	Departament de Genètica	es_ES
dc.date.accessioned	2022-03-15T12:37:53Z
dc.date.available	2022-03-16T05:45:05Z
dc.date.issued	2022	es_ES
dc.date.submitted	23-03-2022	es_ES
dc.identifier.uri	https://hdl.handle.net/10550/81928
dc.description.abstract	Bacillus thuringiensis, también conocida como “Bt”, es una bacteria gram positiva que forma endosporas. Se trata de un organismo ubicuo, aunque se encuentra principalmente en el suelo o en ambientes con alta presencia de insectos. Fue aislada por primera vez en 1901 por el bacteriólogo Shigetane Ishiwata en muestras de intestino de gusanos de seda (Bombyx mori) infectados y fue apodada como “Sottokin- Bacillus” (“Bacilo de muerte súbita”) por la muerte que causaba cuando era ingerida por larvas de gusanos de seda. Pocos años después, el biólogo Ernst Berliner aisló B. thuringiensis de crisálidas de polilla mediterránea de la harina (Ephestia kuehniella) infectadas con esta bacteria en la provincia de Thuringia, Alemania, otorgándole el nombre por el que se conoce en la actualidad. Además, Berliner describió la presencia de una especie de cristal dentro de la célula bacteriana, aunque la naturaleza de este elemento era desconocida en ese momento. Fue en 1954 cuando el microbiólogo Thomas A. Angus descubrió que esas inclusiones proteicas con formas de cristal, producidas en la fase de esporulación de Bt, eran responsables de su acción insecticida y las apodó “proteínas Cry” (del inglés crystal). A parte de estas proteínas, se han descrito varios factores de virulencia posteriormente, tal y como la b-exotoxina, la cual puede inhibir ARN polimerasas dependientes de ADN, las hemolisinas, o exoenzimas como las quitinasas. En el año 1996 se descubrió una nueva clase de proteínas, conocidas actualmente como Vip3 (de las siglas en inglés “Proteínas Vegetativas Insecticidas”), producidas durante la fase vegetativa de Bt, las cuales son altamente tóxicas para lepidópteros. Desde entonces, una amplia variedad de proteínas de Bt tóxicas para diferentes invertebrados (principalmente insectos y nematodos) han sido identificadas a partir de un gran número de cepas aisladas, y han sido clasificadas en función de la similitud de su secuencia proteica. En la actualidad existen 391 secuencias holotípicas de proteínas Bt, y los principales órdenes de insectos que han mostrado susceptibilidad a algún tipo de proteína son Lepidoptera, Diptera, Coleoptera, Hemiptera e Hymenoptera. Esta tesis se centra en el estudio de dos familias de proteínas, las proteínas Cry de tres dominios (“3D-Cry”) ylas proteínas Vip3 que afectan a lepidópteros. El modo de acción de estas proteínas, así como el ciclo de vida de Bt tras la infección del insecto constan de una serie de pasos, desarrollados en las siguientes páginas. El primer paso supone la ingestión de Bt por parte del insecto. Tras ello, los cristales que forman las proteínas Cry se solubilizan por la rotura de los puentes disulfuro, liberando las protoxinas presentes en el cristal. Esta solubilización es dependiente tanto del pH como de condiciones reductoras del intestino. En el caso de las proteínas Vip3, no precisan de este paso de solubilización, ya que son secretadas al exterior de la bacteria en forma soluble. Tanto las protoxinas Cry solubilizadas como las protoxinas Vip, son procesadas por enzimas digestivas como las tripsinas y quimotripsinas presentes en los fluidos intestinales, produciendo una toxina activa que en general es resistente a posteriores procesos proteolíticos. Una vez activadas, las toxinas deben atravesar la membrana peritrófica del intestino medio. Esta membrana es una matriz rica en quitina, cuya función principal es la separación entre el alimento y las células epiteliales. Esta separación impide que el alimento pueda tener un efecto abrasivo sobre el intestino y también sirve como primera barrera contra infecciones de tipo bacteriano, vírico o parasítico. Asimismo, el papel protector que ejerce la membrana peritrófica puede verse comprometido por la acción de las quitinasas endógenas o exógenas de Bt (enzimas capaces de degradar la quitina). Tras superar la barrera de la membrana peritrófica, se produce una interacción entre las proteínas Cry o Vip3 y la membrana de borde en cepillo de las células del intestino medio, consideradas como las células diana de las toxinas. Uno de los retos principales en la investigación de Bt durante las últimas décadas ha sido identificar cuáles son las moléculas que se unen de forma específica con las toxinas Cry o Vip3, así como deducir la relevancia de la función de esta interacción, tanto en el modo de acción de las toxinas como en los mecanismos de resistencia. Actualmente, existen tres tipos de proteínas de membrana que pueden funcionar como receptores putativos para las proteínas Cry en insectos: las aminopeptidasas N (“APN”), las cadherinas y los transportadores “ABC” (del inglés “ATP-Binding Cassette”). Aunque inicialmente la fosfatasa alcalina (“ALP”) también fue propuesta como posible receptor, al estar asociada con la resistencia, no se dispone de evidencias claras de su implicación en la unión. En cuanto a los transportadores ABC, son los receptores que mayor importancia han adquirido en los últimos años. Son proteínas de membrana con capacidad para transportar distintas moléculas de forma activa gracias a la hidrólisis de ATP. Dentro de esta gran superfamilia, el transportador más caracterizado ha sido el ABCC2, tanto por su implicación como receptor de proteínas Cry1, como por haber sido encontrado alterado en distintas especies de lepidópteros resistentes a proteínas Bt. En cuanto a las toxinas Vip3, los estudios de interacción han demostrado que los sitios de unión no son compartidos con las toxinas Cry. Existen pocos estudios concluyentes sobre los posibles receptores específicos para las toxinas Vip3. Algunos trabajos indican que tanto la proteína ribosomal S2 como el “scavenger” tipo C pueden actuar como receptores de la toxina Vip3A en varias especies del género Spodoptera. Además, este último se encuentra involucrado en la vía endocítica, siendo capaz de mediar la internalización de la toxina. Existen numerosos estudios que han señalado que la actividad tóxica de las proteínas de Bt se debe principalmente a su habilidad para formar poros en la membrana de las células diana. Este modelo (conocido como modelo de formación de poro) es actualmente el más respaldado por la comunidad científica debido al gran número de trabajos experimentales que lo apoyan tanto para toxinas de tipo Cry como para Vip3. Una vez unidas las toxinas a los receptores específicos, se forma una estructura oligomérica que se inserta en la membrana de las células intestinales constituyendo el poro. De esta forma se pierde la integridad de la membrana, generando un desequilibrio osmótico que provoca un hinchamiento de las células, desembocando en lisis celular. Tras la lisis de las células intestinales se produce una septicemia, causada principalmente por el paso a la hemolinfa no sólo de las propias esporas o formas vegetativas de Bt, sino también de todas aquellas bacterias oportunistas y otros patógenos presentes en el bolo alimentario. Como consecuencia, el insecto acaba muriendo. Por último, Bt puede aprovechar este nicho para continuar creciendo y esporular, favoreciendo su posterior dispersión en el medio. Dada su eficacia como insecticida, el ser humano ha utilizado Bt para contener la expansión de distintas plagas. El primer producto basado en Bt se comercializó en 1938, y desde entonces, su uso, ya sea en formato de formulado Bt o plantas con expresión de genes Bt, ha incrementado notablemente. Como ejemplo, las hectáreas de plantas de maíz, algodón o soja Bt aumentaron de 1,1 millones en el año 1996 a 101 millones en 2017. Por ello, no es de extrañar que B. thuringiensis sea el agente microbiano más utilizado entre las soluciones biotecnológicas presentes en la actualidad. Aunque los investigadores han trabajado durante muchos años en descifrar cómo se comportan las proteínas de este excepcional organismo en el ambiente intestinal de los insectos, aún queda mucho por entender. El conocimiento de forma detallada del modo de acción de las proteínas insecticidas de Bt es un punto clave para garantizar su uso a largo plazo por varias razones; nos permite entender en cierta medida, cuáles son los mecanismos alterados en el desarrollo de la resistencia, dónde se localizan y por qué se encuentran alterados. Además, gracias a este conocimiento podemos combinar proteínas Bt con diferentes modos de acción con la finalidad de maximizar su efecto. En la presente tesis, hemos profundizado en el estudio de estas interacciones mediante distintas aproximaciones. En el primer y segundo capítulo, nos hemos centrado en estudiar las interacciones que ocurren entre las propias proteínas Cry, así como con el transportador ABCC2 de la rosquilla verde, Spodoptera exigua. Dado que esta plaga es de alta relevancia por su impacto en la agricultura, y se encuentra ampliamente distribuida en todo el mundo, conocer cómo las proteínas Cry1 interaccionan con los receptores del intestino es muy importante, ya que los productos basados en Bt y las plantas Bt que contienen proteínas Cry1 son comúnmente utilizadas para controlar esta plaga. En estos dos capítulos, elegimos una aproximación ex vivo, ya que el uso de estos sistemas, como el cultivo de células de insecto o las preparaciones de vesículas de membrana intestinales (“BBMV”, de sus siglas inglés, Brush Border Membrane Vesicles), nos permiten entender y profundizar en interacciones específicas que pueden pasar desapercibidas durante los ensayos in vivo. Para ello, utilizamos una línea de células de insecto que expresa el transportador ABCC2 en su versión completa, denominada “Sf21- FRA”. Además, utilizamos proteínas Cry1A marcadas con yodo para realizar ensayos de unión y no marcadas para ensayos de viabilidad celular. Descubrimos que las proteínas Cry1A unen de forma específica y con alta afinidad a células que expresan el transportador, y que la presencia de éste en células es suficiente para causar toxicidad de las proteínas Cry1A probadas. Estos resultados apoyan que el ABCC2 de S. exigua actúa como receptor funcional de las proteínas Cry1A, tal y como se ha observado en otras especies plaga. A través de los dos capítulos, la falta de competencia de la proteína Cry1C, así como la ausencia de toxicidad en células HEK que expresan el transportador, descartaron al ABCC2 como receptor para esta proteína. Estos resultados indican que la proteína Cry1C pueda poseer distintos sitios de unión en el intestino medio de S. exigua, ya que es altamente efectiva en el control de esta plaga. Por otra parte, observamos un fenómeno insólito en los ensayos de unión con I125-Cry1Aa, en los que concentraciones bajas de Cry1Aa no marcada y utilizada como competidor, producía una respuesta estimulatoria, causando un incremento de la unión total conseguida por la I125-Cry1Aa a las células expresando el transportador. Dado que a concentraciones altas de competidor, éste competía de una forma habitual, exploramos por qué ocurría este comportamiento bifásico. Pudimos observar también estimulación causada a bajas concentraciones, e incluso más acentuada, al utilizar las proteínas Cry1Ab, Cry1Ac o la proteína híbrida H04 (que contiene los mismos dominios I y II que las proteínas Cry1Ab/c, pero contiene el dominio III de la Cry1C) como competidores contra la I125-Cry1Aa. Sin embargo, no observamos dicho comportamiento bifásico al utilizar la proteína Cry1C o la proteína híbrida H205 (con los mismos dominios I y II que la proteínas Cry1C y mismo dominio III que la Cry1Aa), lo cual indica la importancia de poseer el mismo dominio I, común a estas tres Cry1As, para que se produzca la fase de estimulación de la unión. Curiosamente, también pudimos observar dicho comportamiento, aunque de forma mucho más discreta, cuando utilizamos I125-Cry1Ac y Cry1Aa como competidor. Para revelar la naturaleza del agente causante de la fase estimulatoria, realizamos electroforesis en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE) de la fase insoluble de los ensayos de competencia, así como autoradiografías de la misma. Tanto el tamaño molecular como la intensidad de la banda observada nos permitió determinar que la forma oligomérica de la proteína es la responsable de la respuesta estimulatoria, señalando este hecho la habilidad de las proteínas Cry1A de formar tanto homo- como hetero-oligómeros. Para confirmarlo, utilizamos dos versiones mutantes de Cry1Aa y Cry1Ab, que poseen una sustitución del aminoácido Arg por Glu en la posición 99 del dominio I que impide la oligomerización. La ausencia de fase estimulatoria o banda correspondiente a oligómero en las autoradiografías al usar estos mutantes como competidores, confirman la habilidad de homo- y hetero-oligomerizar de las proteínas en su versión no modificada, a través del dominio I, así como de unir con alta afinidad al transportador ABCC2. Además, las toxicidades observadas con las proteínas Cry1Ab y Cry1Ac en células expresando el transportador, así como los ensayos de competencia llevados a cabo con I125-Cry1Ac en el primer capítulo, nos permiten concluir que estas dos proteínas comparten un sitio de unión, que tiene poca afinidad por la proteína Cry1Aa. La presencia de este sitio compartido se pudo confirmar con el uso del híbrido H04, lo cual señaló al dominio II de Cry1Ab/c como dominio con mayor afinidad por este sitio. Dado que la proteína Cry1Aa parecía tener un papel menos relevante en la unión a este sitio, pero aún así es tóxica para células expresando el transportador, realizamos experimentos de competencia tanto con I125-Cry1Aa como con I125-Cry1Ac, usando Cry1Aa y el híbrido H205 como competidores. Pudimos concluir que la proteína Cry1Aa debe de tener otro sitio de unión en el transportador, el cual tendría alta afinidad por el dominio III de Cry1Aa. A este sitio de unión, también se podría unir la proteína Cry1Ab con alta afinidad, dado que comparte el mismo dominio III que la Cry1Aa. Por último, a través de distintas combinaciones de proteínas Cry1Aa en ensayos de toxicidad pudimos observar que, la ventaja obtenida al formar mayores concentraciones de hetero-oligómeros que de homo-oligómeros no sólo también se trasladaba a mayores tasas de unión, sino a mayor toxicidad sobre las células. En resumen, el primer capítulo destaca la importancia del ABCC2 como un receptor multivalente para las proteínas Cry1A y el segundo capítulo demuestra la habilidad de formar hetero-oligómeros por las proteínas Cry1Aa para beneficiarse de la multivalencia del transportador. Hasta ahora, es evidente que el transportador ABCC2 de S. exigua y de otros lepidópteros juega un rol relevante en la unión y toxicidad de al menos las proteínas Cry1A, pero pocos miembros de la familia de este transportador han sido caracterizados. Es muy probable que estemos pasando por alto numerosos transportadores ABC que interaccionen con proteínas insecticidas de B. thuringiensis, ya que hasta ahora se han descrito más de 400 transportadores ABC en artrópodos. Por ello, estudiar nuevas interacciones entre transportadores ABC y proteínas insecticidas es un gran reto en la investigación con Bt. A parte del ABCC2, sólo unos pocos transportadores ABC se han relacionado con proteínas Bt, como el ABCB1 del coleóptero Chrysomela tremulae, receptor de la proteína Cry3Aa, el ABCA2 de los lepidópteros Helicoverpa armigera y B. mori, receptor para las proteínas Cry2A, o el ABCC3 de S. exigua, Spodoptera litura, Plutella xylostella, H. armigera y Spodoptera frugiperda, relacionado con la acción de la proteína Cry1Ac. Curiosamente, ningún otro miembro de la familia ABC (aparte del ABCC2) se ha caracterizado en el gusano bellotero Heliothis virescens, plaga en la que se relacionó por primera vez un transportador ABC con las proteínas de Bt, hace ya más de una década. En el tercer capítulo de la tesis, hemos realizado una búsqueda de nuevos transportadores ABC en H. virescens para abordar esta falta de conocimiento. Hemos identificado y descrito dos nuevos transportadores, el ABCC3 y ABCC4. El análisis filogenético ha demostrado alta similitud entre el transportador ABCC3 y el ya descrito ABCC2, como se ha observado en otras especies como H. armigera. Sin embargo, el transportador ABCC4 es una proteína más distante atendiendo a su secuencia de aminoácidos. Según los modelos de predicción, ambos transportadores estarían formados por dos dominios transmembrana y seis regiones en la parte exterior que se corresponden con asas extracelulares. Evaluamos la funcionalidad de los nuevos transportadores como posibles receptores para proteínas Bt desarrollando mutantes de deleción para cada uno de los genes HvABCC3 o HvABCC4 mediante la técnica de CRISPR/Cas9. Para ello, microinyectamos huevos y cruzamos los adultos resultantes hasta obtener líneas de homozigotos mutantes. Seguidamente, realizamos bioensayos con Cry1Aa, Cry1Ac y Vip3A. Los resultados preliminares no mostraron reducción en la toxicidad para ninguna línea mutante, en comparación con la colonia de H. virescens usada como control. Sin embargo, sí se observaron mortalidades ligeramente disminuidas en la concentración más baja de Cry1Ac utilizada, especialmente en la línea de mutantes con deleción en el ABCC3, aunque el grado de significación debe de estudiarse en mayor profundidad dado el bajo número de réplicas en los bioensayos. Además, falta por confirmar la correcta deleción de los transportadores en ambas líneas de mutantes mediante la secuenciación del ARN mensajero de los genes. Dado que los ARN guías utilizados se diseñaron en el primer exón de cada gen, podrían haber pautas de lectura alternativas, por lo que debemos de asegurar que no se estén expresando otras versiones funcionales de los transportadores. Por tanto, la posible implicación de los nuevos transportadores ABC con proteínas Bt tendrá que estudiarse en mayor profundidad. Por ahora, se sabe que el ABCC3 de S. exigua, H. armigera S. exigua, H. armigera y S. frugiperda comparte redundancia funcional con el ABCC2 en el modo de acción de las proteínas Cry1A y juega un rol menor y secundario en su toxicidad. Para comprender si este fuera el caso en H. virescens, son necesarios experimentos adicionales como desarrollar líneas de mutantes con deleción del ABCC2 o dobles mutantes con deleción del ABCC2 y ABCC3, así como la evaluación, mediante ensayos con proteínas marcadas, de las capacidades de unión sobre las líneas de los mutantes. Por último, aparte del ABCC2, ABCC3 y ABCC4, aún queda un gran número de transportadores ABC por describir en H. virescens. Además de estudiar la interacción entre receptores putativos y proteínas Bt y buscar receptores desconocidos, debemos de tratar de entender cómo y por qué ciertas especies plaga consiguen desarrollar resistencia a proteínas Bt, ya que la resistencia es la principal amenaza para el uso continuado de plantas Bt o bioinsecticidas basados en Bt. Está ampliamente aceptado que la alteración de unión al receptor de membrana es la principal causa de resistencia a proteínas Bt en especies plaga, aunque otros mecanismos pueden estar involucrados. Las alteraciones de unión pueden ocurrir por diferentes razones, tales como la reducción en la expresión de un gen que codifique para una proteína de membrana, deleciones en su secuencia, o mutaciones aminoacídicas que impidan la interacción entre la toxina y el receptor. Por ello, es interesante caracterizar la funcionalidad de los receptores que han sido encontrados alterados en diferentes plagas resistentes. A día de hoy, existen numerosos estudios funcionales con las versiones “wild-type” de transportadores ABC usando diferentes técnicas, tales como silenciamiento con ARN de interferencia, deleción mediante CRISPR, o expresión en un sistema ex vivo, pero pocos estudios han caracterizado la funcionalidad de las versiones alteradas de los transportadores ABC de cepas resistentes. Además, se propuso que el mecanismo de transporte activo de los transportadores tiene que funcionar correctamente para que pueda actuar como receptor de las proteínas Cry. En el cuarto capítulo, caracterizamos la funcionalidad de una versión alterada del ABCC2 de una colonia de S. exigua resistente a XentariTM, un bioinsecticida basado en Bt. Este transportador contiene una deleción en el segundo dominio de unión a nucleótidos (“NBD2”) que fue genéticamente ligada a la resistencia en un estudio previo. Sin embargo, no se han realizado ensayos de funcionalidad del transportador mutado para dilucidar si esta mutación es la causa de la resistencia. Para ello, utilizamos una línea celular de insecto que expresa la versión truncada del transportador denominada Sf21-XenR, así como la línea celular utilizada en los dos primeros capítulos que expresa la versión original del ABCC2 (Sf21-FRA). A través del estudio de la secuencia de aminoácidos, identificamos cuatro mutaciones adicionales, en forma de sustitución,tres de las cuales se encontraban en los NBD intracelulares y una de ellas en una de las asas extracelulares (asa extracelular número 4). Las primeras caracterizaciones mediante Western blot e inmunohistoquímica mostraron la expresión del transportador truncado y su localización en la membrana de las células Sf21-XenR, lo cual indica que las mutaciones presentes en el transportador no impiden su presencia en la membrana. Tras ello, realizamos ensayos de viabilidad celular con las proteínas Cry1Aa, Cry1Ab y Cry1Ac, tanto en células Sf21-XenR como en células Sf21 no transformadas como control. Las tres proteínas ensayadas fueron tóxicas contra células con expresión del transportador truncado, y a un nivel muy similar al encontrado previamente en células que expresan el transportador en su versión original (Capítulo 1). Además, los ensayos de unión con Cry1Ac marcada con I125 revelaron unión específica al transportador truncado, así como un valor similar en la constante de disociación (Kd) al observado para células con transportador original en ensayos de competencia. Por otra parte, la proteína Cry1Ab pudo competir parcialmente por los sitios de unión de la Cry1Ac marcada, mientras que la Cry1Aa no compitió. Estos resultados confirman que las sustituciones en la secuencia de aminoácidos y la falta de parte del NBD2 no impide la unión y, consecuentemente toxicidad, producida por las proteínas Cry1A sobre la versión truncada del transportador ABCC2 en S. exigua. Por ello, estos resultados señalan que la versión truncada del transportador ABCC2 no sería la causa directa de la resistencia al producto XentariTM en la colonia de S. exigua estudiada en la presente tesis. Otro lepidóptero plaga que actualmente causa un gran impacto global en la agricultura es Ostrinia furnacalis, el taladro del maíz asiático, el cual se alimenta principalmente de cultivos de maíz, pero también de caña de azúcar, algodón, o pimiento. El impacto de las larvas de esta especie es notorio de China a Australia, donde puede causar entre un 10-30% de pérdida en la producción del maíz cada año. Una herramienta prometedora para su control efectivo es el uso de maíz Bt, el cual expresa varias proteínas Bt a las cuales esta especie es susceptible, como Cry1Ab, Cry1Ac y Cry1F. Por lo tanto, es de gran interés conocer el modo de acción de estas proteínas Bt en O. furnacalis y sus posibles mecanismos de resistencia antes de que ocurran en el campo. En el quinto capítulo hemos analizado en primer lugar los parámetros de unión de una colonia susceptible de O. furnacalis para establecer un modelo preliminar de sitios de unión de las proteínas Cry1 en esta especie. Para este fin, hemos marcado con I125 las proteínas Cry1Ab y Cry1Aa hemos realizado ensayos de competencia con Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac y Cry1F. De estos ensayos, podemos concluir que existen al menos dos sitios de unión distintos en la membrana de las células de intestino, que pueden ser compartidos principalmente por Cry1Aa y Cry1Ab, pero también en menor medida con Cry1Ac y Cry1F. Este modelo presentaría ciertas similitudes con el modelo previamente propuesto para la especie Ostrinia nubilalis, el taladro de maíz europeo, en el hecho de que las proteínas Cry1A pueden unirse a más de un sitio. Seguidamente, analizamos una colonia de laboratorio de O. furnacalis que fue seleccionada para desarrollar resistencia a la proteína Cry1Ab. Evaluamos la presencia de resistencia cruzada mediante bioensayos con proteínas Cry1A y Cry1F en ambas colonias. Con una resistencia a Cry1Ab mayor a 700 veces, los análisis de resistencia cruzada mostraron resistencias moderadamente altas a Cry1Aa (unas 180 veces resistente), pero también a Cry1Ac o Cry1F (más de 192 veces a ambas) comparado con los valores de susceptibilidad obtenidos para la colonia susceptible. Teniendo estos datos en cuenta, conocer el mecanismo que produce resistencia a la proteína utilizada en la selección, pero también resistencia cruzada a otras proteínas, es un elemento clave para preservar el uso a largo plazo del maíz Bt. Dado que el principal mecanismo de resistencia es la alteración de receptores en la membrana de células del intestino medio, llevamos a cabo ensayos de unión entre las mismas proteínas utilizadas en bioensayos y BBMV de la colonia resistente. Pudimos observar una reducción parcial en la unión específica de Cry1Ab y Cry1Aa a las BBMV, lo cual indicaría alteración de receptor. La alteración de este sitio en la colonia resistente estaría causando una deficiencia en la unión de, al menos, las proteínas Cry1A probadas aquí y ello sería la causa de la reducción en su toxicidad. En cuanto a la Cry1F, las pequeñas diferencias observadas son poco concluyentes y sólo podemos especular que otros mecanismos de resistencia estén ocurriendo, por lo que es necesario investigar más para entender por qué se producen estos niveles de resistencia cruzada con Cry1F en esta colonia. Por lo tanto, no podemos concluir de forma categórica que la alteración del sitio de unión observado aquí sea el único responsable de los niveles de resistencia observados, y estudios adicionales serán necesarios para identificar la naturaleza del receptor alterado. Una estrategia actual para evitar, o al menos retrasar la aparición de la resistencia a proteínas Bt en el campo es el uso de plantas Bt “piramidadas”. Esta estrategia se basa en la co-expresión de distintas proteínas Bt con diferentes modos de acción en una misma planta, generalmente combinando proteínas Cry y proteínas Vip3, lo cual obstaculiza el desarrollo de resistencia por parte de las plagas. Esta estrategia se utiliza desde hace algunos años y aunque el modo de acción de las proteínas Vip3 se presupone distinto al modo de acción de las proteínas Cry, aún no está bien caracterizado. No obstante, ya se han conseguido resistencias (en condiciones de laboratorio) a Vip3A en algunos lepidópteros. Estas colonias resistentes sirven para caracterizar los posibles cambios genéticos y bioquímicos que causan la resistencia y también nos permiten acercarnos al modo de acción de estas proteínas Bt. En el sexto capítulo, hemos explorado una colonia resistente de H. virescens que presenta niveles de resistencia a Vip3A mayores de 2000 veces comparado con la colonia susceptible. Mediante el marcaje con I125 de la proteína Vip3Aa, se realizaron ensayos de unión con BBMV, además de ensayos de “ligand blot”, tanto con la colonia sensible como con la resistente. En ninguno de los dos casos observamos diferencias significativas en la unión. Estos resultados iniciales indican que la resistencia a Vip3Aa podría deberse a mecanismos distintos a la alteración de sitios de unión. La ausencia de alteración de sitios de unión también ha sido observada en otras colonias resistentes a Vip3Aa de H. armigera y Mythimna separata. Además, detectamos una gran reducción en la actividad enzimática de la fosfatasa alcalina (“ALP”) en los intestinos de la colonia resistente. Mediante ensayos de Western blot y RT-qPCR pudimos confirmar la reducción en la cantidad de proteína ALP de membrana, así como su reducción a nivel transcripcional. Para saber si la ALP está actuando como receptor de la Vip3Aa, expresamos la ALP en células de insecto (Sf21) y realizamos ensayos de toxicidad con la proteína Vip3Aa. La susceptibilidad de la línea celular que expresaba la ALP no fue significativamente distinta a la línea celular control, lo cual apoya la idea de que la ALP no actúa como receptor funcional para la proteína Vip3Aa en H. virescens. Aunque la alteración de la ALP ha sido correlacionada con la resistencia a proteínas Cry1 en diferentes especies como H. virescens, H. zea, H. armigera, P. xylostella, S. frugiperda o S. litura, actualmente no podemos afirmar que sea receptor funcional o si su alteración se debe a una respuesta fisiológica a la resistencia. Del presente estudio, podemos descartar que la ALP de membrana actúe como receptor para la proteína Vip3Aa, al menos, en H. virescens, y podemos reseñar que la aparición de resistencia a proteínas Vip3A puede ser causada por mecanismos alternativos a la alteración de un sitio de unión. Para confirmarlo, necesitaremos más estudios que caractericen otras colonias resistentes a Vip3A y que desentrañen otros mecanismos de resistencia menos caracterizados. Actualmente, existe una amplia bibliografía en la que se constatan distintos mecanismos de respuesta de los insectos para superar la infección de Bt y sus proteínas, aparte de la alteración de receptores que se encuentran en las células del intestino medio. Sin embargo, existe la necesidad de recabar toda esta información para poder ponerla en valor, ya que parte de ella ha sido pasada por alto. En el séptimo y último capítulo de la tesis, hemos llevado a cabo una búsqueda exhaustiva de todos los mecanismos conocidos que puedan contribuir de alguna manera al desarrollo de la resistencia. Para ello, hemos escrito un artículo de revisión que clasifica estos mecanismos de respuesta atendiendo al paso en el que intervienen dentro del modo de acción de B. thuringiensis y sus proteínas. Hemos definido ocho categorías: (i) Ingestión, (ii) Solubilización del cristal, (iii) Activación, (iv) Secuestro de toxinas, (v) Reparación del epitelio intestinal, (vi) Rutas de defensa celular intrínsecas al epitelio, (vii) proteínas de respuesta a patógenos (proteínas REPAT) y (viii) Respuestas inmunes, y las hemos discutido, así como las interacciones entre ellas a lo largo de la revisión. Este trabajo pretende ilustrar todos los eventos conocidos que puedan contribuir a la defensa de los huéspedes contra B. thuringiensis y sus proteínas, y resaltar que el estudio de cómo interactúan estos mecanismos entre sí será uno de los principales retos en la investigación con Bt. Para concluir, los resultados obtenidos en esta tesis permiten tener una mejor comprensión de algunas de las interacciones que se producen entre insectos, B. thuringiensis y sus proteínas insecticidas, lo cual puede ser útil para garantizar el uso a largo plazo de este poderoso organismo.	es_ES
dc.description.abstract	Bacillus thuringiensis (Bt) is one of the most popular biological pest control alternatives to the use of chemical insecticides. It can produce several insecticidal proteins that are used in Bt-based products or genetically modified crops, mainly Cry and Vip3 proteins. However, field-evolved resistance can threat its long-term use. It is a key point to understand how Bt proteins produce their toxicity inside the insect. In Chapters 1 and 2, we investigated the role of the ABCC2 transporter as receptor from Spodoptera exigua, a global polyphagous pest. Our results show the co-existence of two different sites in the SeABCC2, depending on which domain of the Cry proteins is binding. Also, the ability of Cry1A proteins to hetero-oligomerize was characterized. In Chapter 3, we characterized other ABC transporters from Heliothis virescens, identifying 2 novel transporters. To understand if any of the new ABCCs are involved in the toxicity of Bt proteins, we performed independent knock-outs of the ABC genes in eggs. Results from bioassays showed no difference in toxicity levels, pointing out that both ABCs do not have a marked role in toxicity. In Chapter 4, we fully characterized the truncated ABCC2 from a resistant colony of S. exigua and we explored if its mutations are affecting the functionality as a receptor for Cry1A proteins. By expressing the truncated version of the transporter, we found that the Cry1Ac protein could bind to it, indicating that the mutations do not affect the binding. Cell viability assays demonstrated that the Cry1A proteins tested exert toxicity, confirming its functionality. In Chapter 5, we analyzed an O. furnacalis colony resistant to Cry1Ab. We explored the cross-resistance with other Cry1’s by performing bioassays, finding moderate-to-high levels of resistance to Cry1Aa, Cry1Ac, and Cry1F. We also performed binding assays, finding that the specific binding of Cry1Ab and Cry1Aa was reduced in the resistant colony. In Chapter 6, we studied the Vip3Aa-resistance of a H. virescens colony. Binding and ligand blot assays showed no significant alterations, indicating an alternative Vip3A-resistance mechanism to the alteration of binding sites in this colony. Lastly, in Chapter 7, we gathered all the available research on response mechanisms of insects to overcome the infection of Bt and its proteins. This review classifies these mechanisms according to which step of the mode of action is interfering with, in 8 categories: (Ingestion, Crystal solubilization, Activation, Toxin sequestration…) and shows how the complexity of the insect defense should be a matter of study in the Bt research world to ensure its long-term use. The results obtained here allow to understand some of the interactions between insects, Bt and its insecticidal proteins, which may be useful to guarantee the long-term use of this powerful organism.	en_US
dc.format.extent	338 p.	es_ES
dc.language.iso	en	es_ES
dc.subject	thuringiensis	es_ES
dc.subject	toxinas bt	es_ES
dc.subject	spodoptera	es_ES
dc.subject	ostrinia	es_ES
dc.subject	heliothis	es_ES
dc.title	The Mighty Bt: Interactions between pests and pesticidal proteins from Bacillus thuringiensis	es_ES
dc.type	doctoral thesis	es_ES
dc.subject.unesco	UNESCO::CIENCIAS DE LA VIDA	es_ES
dc.embargo.terms	0 days	es_ES