RESUMEN La Ribulosa 1,5-bisfosfato carboxilasa oxigenasa (Rubisco) cataliza el primer paso en la asimilación fotosintética de carbono a través del ciclo de Calvin y es, por tanto, la principal vía de entrada del CO2 de la atmósfera en la biosfera. La estructura del enzima en organismos eucariotas es un hexadecámero compuesto por 8 subunidades grandes (de 51-58KDa, de codificación cloroplástica) y 8 subunidades pequeñas (de 12-18KDa, de codificación nuclear). La Rubisco desempeña una importante función no catalítica como reserva de nitrógeno, azufre y carbono, al degradarse de forma rápida y selectiva en condiciones de senescencia natural o inducida por estrés. Una de las respuestas más generalizadas ante diferentes tipos de estrés en distintos organismos es la oxidación de grupos tioles de la Rubisco, que se ha relacionado in vitro e in vivo con la inactivación y susceptibilización proteolítica del enzima. Con estos antecedentes, en la presente tesis se ha profundizado en el conocimiento de los mecanismos que regulan la actividad y la disponibilidad proteolítica de la Rubisco a través del estado de oxidación de residuos de cisteína del propio enzima. Dentro de este tema, se estudiaron los siguientes aspectos concretos: 1. Patrón diferencial de proteolisis de Rubisco reducida y oxidada. La utilización de proteasas de baja especificidad de secuencia como sondas estructurales reveló que la accesibilidad del sitio de corte tras la Lys 18 de la subunidad grande de la Rubisco de diferentes especies no depende del estado redox del enzima. Por otro lado, la oxidación de las cisteínas conservadas de Rubisco induce un cambio conformacional progresivo que favorece la exposición del lazo Ser61-Thr68 de la subunidad grande a la acción de proteasas exógenas. El corte proteolítico en este lazo, situado en la interfase entre las dos subunidades grandes que componen cada uno de los dímeros del holoenzima, promueve el desensamblaje y la digestión completa (no restringida) del enzima. La proteolisis de la Rubisco por subtilisina puede modelizarse mediante un sistema de tres ecuaciones diferenciales acopladas, que incluye cuatro constantes cinéticas de primer orden: k1, para el procesamiento tras la Lys 18, k2, para el corte en el lazo Ser61-Thr68 de una subunidad grande intacta, k2´, para el corte en el mismo lazo de una subunidad grande previamente procesada tras la Lys 18 y k3, para el desensamblaje y la consecuente proteolisis no restringida. El modelo describe correctamente la cinética de proteolisis y puede utilizarse como herramienta para detectar cambios conformacionales y comportamientos anómalos en enzimas mutantes. 2. Obtención de mutantes de Rubisco por sustitución de residuos conservados de cisteína. Los procedimientos de transformación cloroplástica y nuclear de C. reinhardtii han permitido la obtención de mutantes fotosintéticamente activos de cisteínas conservadas de la subunidad grande (C84S, C247S, C284S, C427S, C449S, C459S y C449S/C459S) y de la subunidad pequeña (C41S, C83S) de la Rubisco. La futura caracterización de estos mutantes puede ayudar a desvelar el papel concreto que cada uno de estos residuos pueda desempeñar en el control redox del enzima. 3. Estudio del papel del par Cys 449-459 en la modulación redox de la Rubisco. De entre los mutantes obtenidos, se escogieron los correspondientes a los residuos de cisteína 449 y 459 de la subunidad grande de la Rubisco para una caracterización más detallada. El residuo de cisteína 459, con un alto grado de conservación entre las secuencias de plantas superiores, algas verdes y cianobacterias, se encuentra en C. reinhardtii a una distancia de la cisteína 449 compatible con la formación de un puente disulfuro. La sustitución de los residuos de cisteína 449 y 459 no provoca cambios apreciables en el centro activo del enzima en estado reducido aunque supone una ligera desestabilización de la estructura nativa, percibible sólo a temperaturas muy superiores a la fisiológica. Los residuos de cisteína 449 y 459 de la subunidad grande de la Rubisco son necesarios para inactivar completamente el enzima a potenciales redox elevados y favorecen de forma redundante la exposición del lazo Ser61-Thr68 a la acción de proteasas exógenas in vitro en condiciones oxidantes. Las cisteínas 449 y 459 tienen un papel aparentemente redundante de forma que su relevancia funcional sólo se pone de manifiesto in vivo al sustituir ambos residuos. Así, el doble mutante, a diferencia de los mutantes simples, presenta un mayor contenido de Rubisco, proteínas totales y pigmentos fotosintéticos por célula durante la fase estacionaria de crecimiento. El estrés salino se ha descrito como un desencadenante de estrés oxidativo en el interior del cloroplasto, y se escogió como modelo para el estudio del papel redox de las cisteínas 449 y 459 in vivo, en condiciones que inducen la degradación de Rubisco. La sustitución simultánea de los residuos de cisteína 449 y 459 intensifica la degradación de Rubisco y los procesos de inactivación, polimerización en agregados de alto peso molecular y asociación de la proteína con las membranas, relacionados con el catabolismo del enzima. Se presenta una discusión sobre los posibles mecanismos por los cuales las cisteínas 449 y 459 pueden estar implicadas en estos procesos in vivo, en base a los datos bibliográficos de los que se dispone hasta el momento. ____________________________________________________________________________________________________ SUMMARY In the present work, it has been intended to further characterize the mechanisms that regulate the activity and the proteolytic availability of Rubisco through the redox state of its cysteine residues. The following aspects were studied: 1. Differential proteolytic pattern upon Rubisco oxidation. The oxidation of conserved cysteine residues induces a progressive conformational change that favours the exposure of the Ser61-Thr68 loop of the large subunit to exogenous proteases. A proteolytic cut in this loop promotes disassembly and the complete digestion of the enzyme. A mathemathical model with three coupled differential equations is proposed. This model fits properly the observed kinetics of proteolytic fragmentation and can be used as a tool to detect conformational changes in mutant enzymes. 2. Site-directed mutagenesis of conserved cysteine residues of Rubisco in Chlamydomonas reinhardtii. In order to test the contribution of each of the conserved cysteines to redox regulation, photosynthetically active Rubisco mutants corresponding to large subunit (C84S, C247S, C284S, C427S, C449S, C459S, C449S/C459S) and small subunit (C41S, C83S) conserved cysteines residues were obtained. 3. Study of the role of the Cys449-459 pair in Rubisco redox modulation through analyis of the phenotype of the C449S, C459S and C449S/C459S mutants. Cysteine residues 449 and 459 of the large subunit are involved in full inactivation of the enzyme at strong oxidizing conditions, and favour the exposure of loop Ser61-Thr68 to in vitro proteolytic attack. Cysteines 449 and 459 have a redundant role in vivo, in such a way that their physiological role becomes evident only after substitution of both residues. The double mutant accumulates a higher biomass per cell and shows a more intense response to saline stress in processes (degradation, aggregation, association to membranes and inactivation) related to the catabolism of the enzyme.