Viroids are small, circular, noncoding RNAs that currently are known to infect only plants. They also are the smallest self-replicating genetic units known. Without encoding proteins and requirement for helper viruses, these small RNAs contain all the information necessary to mediate intracellular trafficking and localization, replication, systemic trafficking, and pathogenicity. All or most of these functions likely result from direct interactions between distinct viroid RNA structural motifs and cellular factors. Viroids present a simple model system to address some basic questions about the RNA structurefunction relationships. Replication of viroids entails reiterative transcription of their incoming single-stranded circular genomes, to which the (+) polarity is arbitrarily assigned, cleavage of the oligomeric strands of one or both polarities to unit-length, and ligation to circular RNAs. While cleavage in chloroplastic viroids (family Avsunviroidae) is mediated by hammerhead ribozymes, where and how cleavage of oligomeric (+) RNAs of nuclear viroids (family Pospiviroidae) occurs in vivo remains controversial. In the present work we have re-examined this question in vivo, using transgenic Arabidopsis lines expressing three dimeric nuclear viroid RNAs and host plants infected. Using this methodology, we have mapped the processing site of these three members at equivalent positions of a conserved region (the hairpin I/double-stranded structure that the upper strand and flanking nucleotides of the central conserved region can form). Together with mapping the in vivo processing site, our results with sixteen mutants of one of these viroids support that cleavage is directed by an RNA motif conserved in all members of the family, and ligation by an extended conformation containing a motif termed loop E. These results have deep implications on the underlying mechanism of both processing reactions, which are most likely catalyzed by enzymes different from those generally assumed: cleavage by a member of the RNase III family, and ligation by an RNA ligase distinct from the only one characterized so far in plants, thus predicting the existence of a least a second plant RNA ligase.RESUMEN Los viroides, los agentes infecciosos más pequeños descritos hasta la fecha (246-401 nt), están constituidos únicamente por una molécula circular de RNA de simple cadena. A pesar de su tamaño y de no codificar proteínas son capaces de replicarse autónomamente, moverse sistémicamente, y causar enfermedades en plantas susceptibles gracias a su capacidad para interaccionar con factores del huésped. Dichas propiedades biológicas y moleculares hacen de estos patógenos un excelente modelo para abordar el estudio de cuestiones básicas sobre la relación entre la estructura del RNA y su función. La replicación de los viroides transcurre según un mecanismo de círculo rodante en el que sólo intervienen intermediarios de RNA. Este proceso conlleva tres etapas: i) la transcripción reiterada del RNA circular monomérico infeccioso más abundante, al cual se la asigna arbitrariamente la polaridad positiva, ii) el corte de los RNAs oligoméricos de una o de ambas polaridades, y iii) la ligación de los RNAs monoméricos lineales resultantes. Mientras que para los viroides cloroplásticos (familia Avsunviroidae) se conoce el sitio de corte de los RNAs oligoméricos y la actividad catalítica implicada (ribozimas de cabeza de martillo que sus RNAs de ambas polaridades pueden adoptar), para los viroides nucleares (familia Pospiviroidae) ambos aspectos son controvertidos. En el presente trabajo hemos abordado el estudio del procesamiento (corte de los RNAs oligoméricos de polaridad positiva y ligación de los RNAs monoméricos lineales) de los viroides nucleares utilizando una metodología in vivo basada en plantas de Arabidopsis thaliana que expresan transcritos diméricos de tres miembros de la familia Pospiviroidae. Mediante el análisis del extremo 5 de los RNAs monoméricos lineales procesados in vivo (en plantas transgénicas o en plantas huésped infectadas), hemos identificado el sitio de corte en un motivo conservado en la familia: la rama superior de la región central conservada (CCR, central conserved region). Las secuencias que la componen y las repeticiones invertidas que la flanquean pueden adoptar un plegamiento en horquilla o, alternativamente, una estructura de RNA bicatenario palindrómico en RNAs oligoméricos. El sitio de corte determinado se localiza en posiciones estructuralmente equivalentes en los tres viroides estudiados, lo que sugiere la implicación de una o de ambas estructuras en la etapa de corte. Los datos obtenidos con varias líneas transgénicas de A. thaliana que expresan cDNAs diméricos de uno de los tres viroides mutados en posiciones definidas de la CCR han permitido concluir que el sustrato de la reacción de corte debe ser la estructura de RNA bicatenario palindrómico y que el bucle E, presente en la conformación en varilla de algunos miembros de la familia, participa en la reacción de ligación aunque no es el único motivo estructural relevante. Es de destacar que el modelo propuesto en este trabajo es aplicable a todos los miembros de la familia Pospiviroidae, y difiere de los modelos previos basados en estudios in vitro que tienen una aplicación más restringida. Los sitios de corte en la conformación que contiene el RNA bicatenario palindrómico generan RNAs monoméricos lineales con extremos 3 con dos nucleótidos protuberantes, la huella característica de las RNasas III. La caracterización de los grupos químicos terminales de los RNAs monoméricos lineales procesados in vivo indica la presencia de extremos 5-P, 3-OH compatibles con la actividad de una enzima de esta familia y con una RNA ligasa distinta a la única caracterizada en plantas. __________________________________________________________________________________________________