The apoptotic function of Apoptosis-inducing factor (AIF) is well documented in the literature, but its physiological role in the mitochondrion is less certain. Using a small interfering RNA (siRNA) strategy, we studied whether modulation of AIF expression in cultured cells influenced the production of reactive oxygen species (ROS). We found that siAIF-transfected cells had reduced AIF protein levels and this was paralleled by a significant increase in ROS. We tested the generality of this response by using two different human cell lines, the hepatoma cell line Hep3B and cervix carcinoma line HeLa, and also by employing a mouse ES AIF-KO cell line. The increased ROS were mitochondrial in origin as a similar silencing strategy in cells devoid of a functioning mitochondrial electron transport chain (ETC) did not result in a ROS-increase. The augmented ROS levels were sufficient to activate Hypoxia-inducible factor 1α (HIF-1α), a ROS-sensitive transcription factor, and this effect could be reversed using antioxidants, both the broad-range general antioxidant (N-acetyl cysteine) and a specific mitochondrial-targeted antioxidant (MitoQ), proving the implication of ROS in the HIF-1α stabilization. We also studied another two redox-sensitive transcription factor and thus observed up-regulation in the expression of Nuclear factor (erythroidderived 2)-like 2 (Nrf2), however without major changes in Nuclear factor-kappa B (NF-κB) levels. Examination of the cellular oxygen consumption rate revealed that AIFdepleted cells had a major impairment of respiration, at Complex I in the ETC. Western blot analysis also showed a loss of Complex I 39 and 20 kDa subunits. Studies using the antioxidants mentioned above, revealed that the respiratory competence could be regained in AIF-silenced cells. However, neither of the antioxidant treatments we used could recover Complex I assembly. Studies of the energetic state of siAIF cells showed that despite a 30% decrease in the overall intact cell respiration, these cells maintain normal basal levels of ATP, presumably due to a higher glycolytic capacity and a lower proliferation rate. Moreover, we analyzed the expression of another redox-active protein, thioredoxin, by Western blot and found that the mitochondrial isoform, Trx2, was significantly decreased when AIF was silenced. Preliminary co-immunoprecipitation analyses and proteomic studies failed to show any direct correlation between AIF and Trx2 at the protein level. Our results lead us to the conclusion that the defect in respiration in siAIF cells is downstream of Complex I protein loss and is presumably due to ROS-mediated damage to the ETC. This suggests an integral mitochondrial function of AIF, as a redox modifier and chaperone-like molecule, necessary for Complex I assembly. Additional studies are required to define the detailed mechanism of the AIF enzymatic activity in the mitochondrion and to establish its binding partners. __________________________________________________________________________________________________ RESUMEN La función proapoptótica del Factor Inductor de Apoptosis (AIF) está bien documentada, sin embargo su papel fisiológico en la mitocondria es menos conocido. Empleando la metodología de interferencia por ARN, estudiamos si la modulación de la expresión proteica de AIF en cultivo celular modifica la producción celular de especies reactivas de oxígeno (ROS). Observamos que el silenciamiento de AIF estaba seguido por un incremento significativo en los niveles de las ROS. Estas ROS fueron mitocondriales de origen, puesto que el silenciamiento de AIF en células que carecen de la cadena de transporte electrónico funcional (ETC) en la mitocondria no llevó a un incremento de ROS. Este incremento fue suficiente para activar el Factor inducible por hipoxia (HIF-1α), efecto que se puede revertir usando los antioxidantes, N-Acetil Cisteina y MitoQ, demostrando así la implicación de los ROS en la estabilización de HIF1-α. Los análisis del consumo de oxigeno celular mostraron que las células de AIF silenciado sufren una disminución en la respiración celular, al nivel del Complejo I de la ETC, acompañada por una disminución significativa en la expresión de sus subunidades 39 y la 20kDa. Tratamientos con los antioxidantes previamente nombrados mostraron que la tasa de respiración se puede recuperar, no siendo así con la expresión del Complejo I de la ETC. Estudios del estado energético de las células siAIF mostraron que a pesar de la disminución de 30% en la tasa de la respiración celular, estas células mantienen niveles normales de ATP, como resultado de un incremento en la capacidad glucolítica y una reducción en la tasa de proliferación. Posteriormente, analizamos la expresión de la proteína tioredoxina y observamos una disminución significativa en la isoforma mitocondrial, la tioredoxina 2 (Trx2), aunque los análisis preliminares de coinmunoprecipitación y proteómica no mostraron la existencia de una correlación directa entre las proteínas AIF y Trx2. Concluyendo, nuestros resultados sugieren que el defecto de la respiración celular es posterior al defecto en el Complejo I, probablemente como consecuencia al daño de la ETC por ROS. Esta observación apunta a un papel integrador de AIF en la mitocondria, como modulador del estatus redox y necesario para el ensamblaje del Complejo I.