The thesis entitled In vitro antimicrobial activity of new 6-fluoroquinolones for oral administration. Structure-activity relationship is a part of the research Project SAF 96-1710 Bioavailability prediction in drug development studies: new quinolones. In this study, we have synthesized new ciprofloxacin homolog derivatives belonging to two series: 4N-alkylciprofloxacin and 3methyl,4N-alkylciprofloxacin, whose antimicrobial activity (minimum inhibitory concentration, MIC) we have studied and compared with that of ciprofloxacin against 160 bacterial strains from clinical sources. MICs were determined by the standard NCCLS, M7-A5 method. The results showed that 4N alkyl substitution does not modify the reference drug antibacterial spectrum. Nevertheless, the synthesized compounds present different activity against the assayed microorganisms. Time-kill kinetics of some homolog compounds against Staphylococcus aureus ATCC-25923 were determined. These derivatives present the same lethality kinetics than ciprofloxacin. The 3methyl,4N-methylciprofloxacin derivative shows the quickest lethality, which is not due to a change in the primary target selection, as topoisomerase IV is its primary target for S. aureus, as it is for ciprofloxacin. Furthermore, we have studied the relationship between the lipophilicity, as a structural parameter, and the inverse of the geometric mean MIC, as an activity index. The activity-lipophilicity correlations can be fitted to a bilineal equation and allow the selection of the optimum partition coefficient for each species studied. This optimum tends to be lower for gramnegative microorganisms than for grampositive ones.We have also studied the mechanisms of action of these quinolones by determining the in vitro inhibition effects through Streptococcus pneumoniae gyrase and topoisomerase IV (carried out in St. Georges Hospital Medical School, London). Topoisomerase IV is the primary target of ciprofloxacin homologs for S. pneumoniae. Ciprofloxacin C7 substitution affects drug-enzyme interaction. The cleavage through gyrase or topoisomerase IV is low, suggesting that 4N ciprofloxacin alkylation is not favourable. Finally, the activity-bioavailability balance has been considered, in order to select the best drug candidates. Three compounds are pointed out: 4N-methylciprofloxacin and 3methylciprofloxacin against gramnegative microorganisms and 4N-ethylciprofloxacin against grampositive ones. These finding are consistent with the established activity-lipophilicity correlations and the selected candidates against gramnegatives are more hydrophilic than those against grampositives.Las fluoroquinolonas se han convertido en agentes importantes en quimioterapia, especialmente en pacientes con infecciones graves que requieran fármacos potentes administrados por vía oral. Sin embargo, la aparición de resistencias a las quinolonas ha conducido a la búsqueda de nuevas moléculas, principalmente incluyendo modificaciones en el núcleo base de la benzopiridona, lo que ha llevado al hallazgo y comercialización de nuevas quinolonas, más activas pero, en muchos casos, más tóxicas, hasta el punto de que algunas han dejado de utilizarse o han sido retiradas del mercado tras haberse demostrado su peligrosidad a medio o largo plazo. En este contexto, el ciprofloxacino es una de las quinolonas más clásicas y de uso más extendido por su amplio espectro de acción, su eficacia, su excelente tolerancia y por permitir su administración tanto por vía parenteral como por vía oral, si bien presenta el problema de poseer una biodisponibilidad oral relativamente baja e irregular. Por este motivo y tomando esta quinolona como referencia de actividad, se han sintetizado nuevos derivados homólogos pertenecientes a dos series: 4N-alquilciprofloxacino y 3metil,4N-alquilciprofloxacino que podrían mejorar la biodisponibilidad y la actividad. En esta línea se incluye el Proyecto de Investigación SAF 96-1710 titulado Predicción de la biodisponibilidad en los estudios de desarrollo de fármacos: nuevas quinolonas que pretende comprobar si el aumento de biodisponibilidad esperado en los derivados afecta a la actividad antimicrobiana. En resumen, se ha estudiado y comparado la actividad de estos homólogos con la del ciprofloxacino. Para ello, se ha determinado la CMI de los derivados, sobre 160 cepas bacterianas de origen clínico, utilizando el método de diluciones dobles seriadas en MHA según las especificaciones del NCCLS. Se demuestra que la adición del sustituyente alquílico en 4N no altera el espectro de acción del patrón utilizado. Sin embargo, los compuestos sintetizados presentan diferente actividad frente a los gérmenes ensayados. En conjunto, los más activos son 4N-metilciprofloxacino, 4N-etilciprofloxacino, 3metilciprofloxacino(97-100) y 3metil,4N-metilciprofloxacino (97-101). De forma general, se puede afirmar que respecto a la serie 4N-alquilciprofloxacino, los compuestos con un radical metilo o etilo son los más activos: 4N-metilciprofloxacino es el más activo frente a los Gram negativos (a excepción de E. coli) y 4N-etilado el más activo frente a los Gram positivos. No obstante, 4N-propilciprofloxacino también presenta mejor actividad que el patrón en los microorganismos Gram positivos (a excepción de E. faecalis), y en A. calcoaceticus. 4N-butilciprofloxacino no presenta mejor actividad que el compuesto de referencia en ningún caso, si bien en los microorganismos ya mencionados la actividad es la misma. Respecto a la serie 3metil, 4N-alquilciprofloxacino, se puede colegir que los compuestos 97-100 y 97-101 son los más activos. En resumen, el derivado 97-101 presenta la mayor actividad frente a A. calcoaceticus, M. catarrhalis, S. aureus, SCN y S. pneumoniae. Por otro lado, 97-100 es el más activo frente a Achromobacter spp. No obstante, 97-102 y 97-103 también presentan mejor actividad que el ciprofloxacino en los microorganismos A. calcoaceticus, S. aureus y S. pneumoniae. El derivado 97-104 no presenta mejor actividad que el patrón en ningún caso, si bien en los microorganismos ya mencionados la actividad es la misma. En lo que se refiere a los heterólogos estudiados, en general, el grepafloxacino es el compuesto más activo. El ofloxacino y el sarafloxacino presentan una actividad muy similar a la del ciprofloxacino, y el flumequino es el menos activo. También se ha estudiado la cinética de letalidad de algunos de estos compuestos en Staphylococcus aureus ATCC 25923. Este estudio proporciona una serie de parámetros de gran interés en lo que se refiere al mecanismo de acción. Los resultados obtenidos demuestran que la dinámica de crecimiento y letalidad que presentan los homólogos es la misma que su patrón, siguen la misma cinética bactericida y muestran un efecto paradógico similar. Si se considera la concentración absoluta, el antibiótico con mayor velocidad de letalidad es el 97-101. Se planteó si el grupo metilo adicional que presenta este derivado en posición 3 con respecto a ciprofloxacino y los compuestos de la otra serie, podría ser el responsable de su mayor letalidad. Dado que la selección de la girasa como primera diana por parte de las quinolonas se asocia con un aumento en la velocidad de letalidad, se determinó la diana de primera elección para este derivado. Se comprobó que la mayor letalidad de este compuesto no se debe a un cambio en la selección de la diana intracelular; pues se demostró, mediante estudios de CMI sobre cepas mutantes, que la topoisomerasa IV es su primera diana en S. aureus, al igual que para el ciprofloxacino. Por otro lado, debido a que los antibióticos estudiados pertenecen a series homólogas, se ha estudiado la relación entre la lipofilia, como parámetro estructural, y la inversa de la media geométrica de la CMI, como índice de actividad. Esta correlación proporciona ajustados bilineales y permite identificar el coeficiente de reparto óptimo para una especie dada, que es en general más bajo para los microorganismos Gram negativos que para los Gram positivos. Además, se ha investigado acerca del mecanismo de acción de estas quinolonas a nivel molecular. En concreto, la investigación se ha centrado en Streptococcus pneumoniae, determinando los efectos de inhibición de las quinolonas ensayadas en la girasa y topoisomerasa IV bacteriana in vitro, con el propósito de conocer la diana específica de los derivados alquilados en comparación con el ciprofloxacino, proporcionar información acerca del modo de acción de estos compuestos y comprobar si ello permite explicar las diferencias en la actividad observadas sobre este microorganismo. Esta parte del trabajo se ha desarrollado en el St. Georges Hospital Medical School, University of London, bajo la dirección del Dr LM Fisher. Se demostró por estudios de CMI sobre cepas mutantes de S. pneumoniae que los homólogos mantienen la diana principal en Topoisomerasa IV, como el patrón. Por otra parte, la determinación de la CC25 mediante electroforesis en gel de agarosa demuestra que los compuestos estudiados no provocan mayor formación del complejo ternario ni con la topoisomerasa IV ni con la girasa. Sólo con el derivado 97-100 éste es igual que ciprofloxacino, lo que indica que la alquilación en 4N del anillo piperacínico del ciprofloxacino no es favorable, si bien afecta a las interacciones entre fármaco y enzima. El efecto del sustituyente en C7 sobre la bomba de secreción PmrA no se conoce puesto que los resultados de este estudio no fueron concluyentes. No se puede descartar, pues, la penetración intracelular como posible responsable de la diferencia de actividad de los homólogos, debido a que para un microorganismo dado, este parámetro está bajo el control de las propiedades fisicoquímicas de la quinolona. Por último, al considerar el equilibrio actividad-biodisponibilidad oral comparada para la selección de los candidatos, existen tres compuestos que presentan las mejores propiedades en conjunto: 4N-metilciprofloxacino, compuesto de elección en todos los microorganismos Gram negativos a excepción de E. coli. 4N-etilciprofloxacino, muy eficaz frente a los microorganismos Gram positivos, entre los que es el derivado de elección en todos los casos, y además presenta buenas propiedades en los microorganismos Gram negativos. 3-metilciprofloxacino (97-100) presenta una eficacia en general mejor a la del patrón en todas las especies estudiadas, sin embargo sólo resulta el candidato de primera elección en E. coli, en el que la mayoría de compuestos son menos activos que el ciprofloxacino. No obstante, aunque estos tres compuestos son los candidatos de elección, los demás derivados también podrían resultar de interés en algunos de los microorganismos estudiados como A. calcoaceticus, S. aureus y S. pneumoniae.