Coronavirus vectors expressing rotavirus proteins have been developed in order to induce an immune response and protection against rotavirus in the mouse model. Rotaviruses are the leading etiology of severe diarrhea disease in children and cause annually 610.000 deaths of children younger than 5 years of age worldwide. The tropism of the TGEV (porcine transmissible gastroenteritis virus)-derived vector was modified by replacing the spike protein with the S protein from mouse hepatitis virus (MHV-A59 strain). The rotavirus gene encoding VP7, the outer capsid protein of bovine rotavirus strain RF, was cloned into the coronavirus cDNA by replacing the non-essentials 3a and 3b genes under the control of the corresponding transcription-regulating signals. The genes encoding structural proteins VP2 and VP6 have also been cloned and their co-expression allows the intracellular assembly of rotavirus VLPs (VP2/VP6). Balb/c and STAT1-deficient mice were inoculated by the oral, intranasal and intraperitoneal routes with the recombinant viral vector encoding VP7, which stably expresses the VP7 rotavirus protein. Organ tropism and viral titers in different tissues were studied by RT-PCR and immunofluorescence. Analyses of antibody responses to TGEV and rotavirus were performed by ELISA. Production of cytokines in serum samples and in cultivated splenocytes from the inoculated mice were determined by multiplex immunofluorescence beads and flow cytometry. Protection against rotavirus-induced diarrhea in suckling Balb/c mice after maternal immunization with rTGEVS-MHVVP7 virus was determined. The viral vector with modified tropism, rTGEVS-MHV, replicates in the small intestine of mice and spread to other organs such as liver, spleen and lung. TGEV and rotavirus-specific IgG antibodies were detected in sera of Balb/c mice. TGEV-specific antibodies were measured in all inoculated groups (mostly by intraperitoneal and intranasal routes), while rotavirus-specific antibodies was detected only after immunization by intraperitoneal route. In addition, humoral and fecal IgA antibodies anti-TGEV responses were detected. A predominant type-Th2 cytokine response was identified in Balb/c mice, with production of IL-10, and low levels of IFN- and TNF-. A partial protection against rotavirus diarrhea was induced in pups born to dams immunized with the recombinant viral vector encoding VP7 when challenged orally with the homotypic rotavirus strain.RESUMEN Las infecciones por rotavirus son la causa más importante de gastroenteritis en niños menores de cinco años de edad. Se calcula que provocan unas 600.000 muertes anuales, principalmente en los países en vías de desarrollo. Una de las estrategias más prometedoras de desarrollo de nuevas vacunas consiste en el uso de virus recombinantes. Entre los sistemas virales de expresión de proteínas recombinantes más interesantes se encuentran los coronavirus. En este trabajo se aborda la producción de vectores virales basados en genomas del coronavirus TGEV (virus de la gastroenteritis porcina transmisible) para aplicarlos como vacunas experimentales de las infecciones por rotavirus. Para ello se han desarrollado coronavirus recombinantes que expresan las proteínas VP2, VP6 y VP7 de rotavirus mediante técnicas de ingeniería genética sobre el ADNc completo de TGEV. Estos vectores se han aplicado en un modelo experimental en ratón para evaluar la respuesta inmunitaria y la protección conferidas. Para ello se ha sustituido el tropismo porcino del vector por el del ratón, mediante el cambio del dominio globular de la proteína de la espícula de TGEV por la del virus MHV (virus de la hepatitis murina) mediante técnicas de ingeniería genética. Se han desarrollado así vectores virales con tropismo murino expresando las proteínas recombinantes de rotavirus. Los análisis de susceptibilidad de distintas líneas celulares a los virus recombinantes demostraron que la línea murina LR7 ofrece los niveles de replicación más elevados. Se ha comprobado la expresión de las proteínas heterólogas en cultivo celular mediante inmunofluorescencia indirecta y la presencia del gen heterólogo mediante RT-PCR. La producción de VLPs en cultivo celular ha sido investigada mediante microscopía laser confocal y microscopía electrónica e inmunomarcaje. Se han inoculado dos líneas de ratones (ratones Balb/c inmunocompetentes y STAT1-/- inmunodeficientes) por vía intragástrica con el vector viral murinizado y se ha confirmado la replicación viral en diferentes órganos (intestino, hígado, pulmón y bazo) mediante RT-PCR e inmunofluorescencia de cortes histológicos de dichos órganos. Se han inmunizado ratones Balb/c con el vector que expresa establemente la proteína VP7 por 3 vías (intragástrica, intragástrica-intranasal e intraperitoneal) y también se han inmunizado ratones inmunodeficientes STAT1-/- por vía intragástrica. La producción específica de anticuerpos de clase IgG e IgA en muestras de sueros y heces de los ratones inmunizados se analizó mediante inmunoensayo. Se ha demostrado la producción de anticuerpos IgG séricos frente a rotavirus tras la inoculación del vector por vía intraperitoneal, y frente al propio vector por las diferentes vías ensayadas en ratones Balb/c. No se ha detectado la producción específica de anticuerpos en ratones STAT1-/-. Se ha medido el nivel de 10 citocinas en suero y en cultivo de esplenocitos de los ratones inoculados mediante inmunoensayo con microesferas fluorescentes marcadas y lectura por citometría de flujo. Se ha determinado una respuesta inmunitaria preferentemente de tipo humoral, con la producción de interleucina 10 y de bajos niveles de interferón-γ. El estudio de protección conferida en el modelo de ratón lactante se llevó a cabo con ratones recién nacidos de madres inmunizadas con el virus que expresa la proteína VP7 por las vías intragástrica e intraperitoneal, inoculados con rotavirus bovino (RF) y de ratón (EDIM). Se controló la presencia de diarrea durante los 4 días posteriores, habiéndose comprobado una protección parcial frente a la diarrea por rotavirus en las crías nacidas de hembras inmunizadas por vía intraperitoneal con el vector que expresa la proteína VP7. __________________________________________________________________________________________________