Las infecciones por rotavirus afectan principalmente en la edad pediátrica y constituyen la primera causa de gastroenteritis en niños. La importancia de estos estudios radica en el conocimiento de las variaciones de los tipos antigénicos circulantes y la aparición o emergencia de nuevos genotipos, lo cual puede influir en las estrategias de vacunación. El G9 de rotavirus genotipo fue reportado por primera vez en 1983 en los Estados Unidos, llegando a ser uno de los genotipos más frecuentes en todo el mundo. La proteína NSP4 tiene un interés especial, ya que tiene un papel importante en el proceso de maduración de los viriones, actuando como receptor intracelular para VP6. Por otra parte, esta proteína actúa como una enterotoxina, siendo capaz por sí sola de producir diarrea en el ratón. En el presente estudio se analizó la epidemiología molecular de la infección por rotavirus en el periodo 2005-2009 en tres ciudades de la Comunidad Valenciana (Valencia, Sagunto y Castellón), así como un análisis filogenético de la variación de secuencias de dos proteínas virales, VP7 y NSP4. Los pacientes con gastroenteritis aguda por rotavirus diagnosticados en los Servicios de Microbiología del Hospital General de Castellón (HGC), Hospital de Sagunto y Hospital Clínico Universitario de Valencia (HCUV) desde octubre de 2005 hasta septiembre de 2009. Se realizó los análisis moleculares de las muestras, mediante la extracción del ARN vírico por el método de fenol-cloroformo y purificación con celulosa CF11; fueron identificados los genes de VP7, VP6 y NSP4 por RT-PCR. Posteriormente fueron secuenciados los genes de VP7 y NSP4, realizándose la alineación de las secuencias con CLUSTAL X, y construcción de los árboles filogenéticos con 1.000 (bootstrap) usando el método neighbor joining. El polimorfismo de las secuencia de ADN y el nivel de divergencia de nucleótidos se analizaron con el software DnaSP. La infección por rotavirus se observó en niños menores de 4 años, con mayor afectación de los menores de 1 año, e igual distribución entre ambos sexos. Predominó el genotipo G9 durante los periodos 2005-06 y 2006-07, con un descenso brusco en 2007-08, no habiéndose detectado ninguna cepa G9 en 2008-09. Todas las cepas de rotavirus G9 analizadas desde 2005 hasta 2009 presentan el genotipo P[8], a diferencia de las cepas estudiadas en otras áreas geográficas. Las cepas de rotavirus G9 circulantes en Valencia y Castellón pertenecen al linaje III y al sublinaje IIId, observándose una alta similitud entre ellas. Se han encontrado diferencias en los aminoácidos en cuatro de las cinco regiones antigénicas de la proteína VP7 de las cepas de rotavirus. Todas las cepas de rotavirus G9 detectadas en el periodo 2005-2009 presentan el genotipo E1(B) de NSP4 encontrándose muy escasa variabilidad genética. Las secuencias deducidas de aminoácidos de NSP4 se mantienen altamente conservadas en las tres zonas hidrofóbicas, observándose algunos cambios en la región carboxi-terminal, en el dominio variable entre especies y en los dominios de unión a VP6 y a VP4. El análisis filogenético de los genes codificantes de VP7 y de NSP4, realizado tanto en forma individual como conjunta de ambos genes, demuestra que las secuencias se agrupan en tres “clusters”. Los estudios filogenéticos de los genes de VP7 y de NSP4 de cepas del genotipo G9 han permitido detectar 3 cepas (5,7%) con reordenamientos genómicos (“reassortments”) intra-genotipo.Rotavirus infections affect mainly in children and are the leading cause of gastroenteritis in children. The importance of these studies lies in understanding changes in antigenic types circulating and the appearance or emergence of new genotypes, which may influence vaccination strategies. The rotavirus G9 genotype was first reported in 1983 in the United States, becoming one of the most common genotype worldwide. The NSP4 protein is of particular interest because it has an important role in the maturation process of virions, acting as intracellular receptor for VP6. Furthermore, this protein acts as an enterotoxin and is able by itself to cause diarrhea in mice. In the present study was analyzed the molecular epidemiology of rotavirus infection in 2005-2009 in three cities of Valencia (Valencia, Sagunto and Castellón) and a phylogenetic analysis of sequence variation of two viral proteins, VP7 and NSP4. The patients with acute rotavirus gastroenteritis were diagnosed in the microbiology services of the Hospital General de Castellón (HGC), Hospital de Sagunto and Hospital Clinico Universitario de Valencia (HCUV) from October 2005 to September 2009. Molecular analyzes were performed on the samples by extraction of viral RNA by phenol-chloroform method and purification CF11 cellulose, genes were identified from VP7, VP6 and NSP4 by RT-PCR. They were then sequenced the genes of VP7 and NSP4, performing the alignment of the sequences with CLUSTAL X, and construction of phylogenetic trees with 1,000 (bootstrap) using the neighbor joining method. Polymorphism of DNA sequence and the level of nucleotide divergence were analyzed using the DnaSP software. Rotavirus infection was observed in children under 4 years, with greater involvement of children under 1 year, and equal distribution between both sexes. Genotype G9 predominated during the periods 2005-06 and 2006-07, with a sharp decline in 2007-08, not having detected any G9 strain in 2008-09. All G9 rotavirus strains analyzed from 2005 to 2009 have the genotype P [8], unlike the strains studied in other geographic areas. G9 rotavirus strains circulating in Valencia and Castellón are of the lineage III and IIId sublineage, showing a high similarity between them. Differences were found at amino acid in four of the five antigenic regions of the VP7 protein of rotavirus strains. All G9 rotavirus strains detected in the period 2005-2009 have the genotype E1 (B) of NSP4 found very little genetic variability. The deduced amino acid sequences of NSP4 remain highly conserved hydrophobic in all three zones, observing changes in the carboxy-terminal region in the variable domain between species and the binding domains VP4 and VP6. Phylogenetic analysis of the genes encoding VP7 and NSP4, conducted both individually and in combination of two genes, shows that the sequences are grouped into three "clusters". Phylogenetic studies VP7 genes and NSP4 G9 genotype strains have identified three strains (5.7%) with genomic rearrangements ("reassortments") intra-genotype.