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Estudio del potencial patógeno de cepas de Saccharomyces cerevisiae aisladas de suplementos dietéticos y probióticos

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Estudio del potencial patógeno de cepas de Saccharomyces cerevisiae aisladas de suplementos dietéticos y probióticos

dc.contributor.advisor	Querol Simón, Amparo
dc.contributor.advisor	Fernández-Espinar, María Teresa
dc.contributor.author	Llopis Pla, Silvia
dc.contributor.other	Departament de Bioquímica i Biologia Molecular	es_ES
dc.date.accessioned	2012-11-26T08:20:21Z
dc.date.available	2012-11-27T07:10:03Z
dc.date.issued	2012
dc.date.submitted	17-12-2012	es_ES
dc.identifier.uri	http://hdl.handle.net/10550/25127
dc.description.abstract	The yeast Saccharomyces cerevisiae is the most used from a biotechnological perspective. It is also used as a dietary supplement and probiotic agent under the name of S. cerevisiae var. boulardii. Until now, its use has been considered beneficial for biofunctional properties and intrinsic nutritional value, and on the other hand, sure, given the "GRAS" character (Generally Recognized As Safe for) that is attributed to this species of yeast; however, currently S. cerevisiae is considered within opportunistic pathogens emerging group of low virulence, mainly capable of causing infections in immunocompromised hosts. In order to know the possible role of this yeast as emerging pathogen, in this study were obtained 8 strains of S. cerevisiae from commercial dietary yeast products of a total of 22 analyzed to evaluate the pathogenic potential of said strains; firstly, once these yeasts were isolated, we applied molecular identification techniques (restriction analysis 5.8S ribosomal-ITS region) and characterization (restriction analysis of mitochondrial DNA and amplification of delta sequences by PCR). With the identification we showed that 6 of these isolates belonged to the species S. cerevisiae and 2 were interespecific hybrids (S. cerevisiae x S. kudriavzevii and S. cerevisiae x S. bayanus). With the characterization, it was shown that these 8 isolates, 4 of them were the same yeast strain, thus finally we obtained 5 yeast isolates identified as different. Secondly, once these five isolates were obtained, we carried out a study of in vitro phenotypic traits associated with the virulence of pathogenic yeast, as growth at high temperatures, secretion of extracellular enzymes (proteases and phospholipases), pseudohyphal growth and invasive growth. It was observed that the hybrids strains showed negative for most of these traits studied, whereas the remaining isolates analyzed, to which we refer as D2, D4 and D14, these phenotypic traits showed a moderate to high level, indicating that these isolates may possess infectivity independently of the host immune system. Next, was conducted a systemic infection in vivo in immunocompetent mice BALB/c, studying the accommodation of these yeasts in brain and kidney after 7, 15 and 30 days postinfection. It was shown that the hybrid strain tested, called D23, showed inability to colonize both organs, while isolates D2, D4 and D14 showed accommodation in brain and kidney, however the strain D14 showed greater pathogenic potential, since it was the only causing mortality in mice. We established a murine model of gastrointestinal infection mimicking normal clinical conditions and immunosuppression trauma to assess the ability of gut translocation and spread of strains of S. cerevisiae. This study was carried out with the virulent strain D14 and with the avirulent strain D23. It was shown that both isolates were able to cross the intestinal barrier, while only detected consisting spread to distant organs, such as liver, kidney, brain and mesenteric lymph in the case of virulent strain D14. Then, we proceeded to carry out a genomic analysis of 4 S. cerevisiae strains, which were the virulent strain D14, an avirulent laboratory strain W303, and two virulent clinical strains (60 and 102) previously studied in our group. It showed genomic variability in subtelomeric areas composition between these isolated, being higher in virulent strains (D14, 60 and 102). Furthermore, most of the genes that showed variation in the number of copies are placed in these regions. Aneuploidy was also observed in the clinical strain 60, which could provide a selective advantage on certain environmental conditions. We also observed changes in the copy number of genes related with the repair of bases caused by oxidative damage or glutathione metabolism genes. Moreover, we conducted a comparative study of survival in human blood with virulent strains D14 and 60 and the avirulent laboratory strain W303, which showed that the virulent strains were able to survive in human blood and the survival rate was equivalent to a pathogenic strain of the species C. albicans. Using the model of survival in human blood, was performed a transcriptomic analysis with virulent strains D14 and 60, the laboratory strain W303 and avirulent wine strain CECT 10.431. There was a specific transcriptional response by virulent isolates (D14 and 60) of genes involved in the biosynthesis and metabolism of aminoacids and genes of oxidative stress response. Furthermore, after the application of oxidative stress, virulent strains showed greater resistance than avirulent strains (CECT 10.431 and W303), suggesting a correlation between oxidative stress resistance and pathogenicity. Finally, the observed changes in genomic analysis could not be correlated with the level of expression of these genes in the transcriptome analysis. Therefore, it is conceivable that a differential expression between virulent and avirulent could be a result of adaptation of virulent strains to the blood environment. This study could be of great interest to all those food industries which include S. cerevisiae in their preparations, to avoid administration of such yeast strains to immunocompromised individuals. Since the hybrid character appears to confer no infective ability, the use of such strains in the dietary supplement preparation would be security guarantee.	en_US
dc.description.abstract	La levadura Saccharomyces cerevisiae es la especie más utilizada desde un punto de vista biotecnológico. Además, se emplea como suplemento dietético y como agente probiótico bajo el nombre de S. cerevisiae var. boulardii. Hasta ahora, su consumo se había considerado beneficioso por sus propiedades biofuncionales y su valor nutritivo intrínseco, y por otra parte, seguro, dado el carácter “GRAS” (de Generally Recognized As Safe) que se atribuye a esta especie de levadura; sin embargo, actualmente se considera a S. cerevisiae dentro del grupo de patógenos oportunistas emergentes de baja virulencia, capaz de causar infecciones principalmente en hospedadores inmunodeprimidos. Con el fin de conocer el posible papel de esta levadura como patógeno emergente, se obtuvieron en este trabajo cepas de S. cerevisiae a partir de 8 productos dietéticos comerciales con levadura de un total de 22 analizados, con el fin de valorar el potencial patógeno de dichas cepas; en primer lugar, una vez aisladas estas levaduras se aplicaron técnicas moleculares de identificación (análisis de restricción de la región ribosomal 5.8S-ITS) y de caracterización (análisis de restricción del DNA mitocondrial y amplificación por PCR de elementos delta); con la identificación se demostró que 6 de estos aislados pertenecían a la especie S. cerevisiae y 2 fueron híbridos interespecíficos (S. cerevisiae x S. kudriavzevii y S. cerevisiae x S. bayanus). Con la caracterización, se demostró que de estos 8 aislados, 4 de ellos eran la misma cepa de levadura, por tanto, finalmente se obtuvieron 5 aislados de levadura identificados como diferentes. En segundo lugar, una vez obtenidos estos 5 aislados, se llevó a cabo un estudio de rasgos fenotípicos in vitro asociados con la virulencia en levaduras patógenas, como fueron el crecimiento a altas temperaturas, secreción de enzimas extracelulares (proteasas y fosfolipasas), crecimiento pseudofilamentoso y crecimiento invasivo. Se observó que los aislados híbridos presentaron negatividad para la mayoría de estos rasgos estudiados, mientras que el resto de aislados analizados, a los cuales denominamos D2, D4 y D14 presentaron estos rasgos fenotípicos con un nivel alto a moderado, indicando que estos aislados podrían poseer capacidad infectiva independientemente del sistema inmune del hospedador. Seguidamente, se llevó a cabo un estudio de infección sistémica in vivo en ratones inmunocompetentes BALB/c estudiando el alojamiento de estas levaduras en cerebro y riñón a los 7, 15 y 30 días postinfección. Se demostró que el aislado híbrido ensayado, denominado D23, mostró incapacidad para colonizar ambos órganos, mientras que los aislados D2, D4 y D14 mostraron alojamientos en cerebro y riñón, siendo el aislado D14 el que mostró mayor potencial patógeno , ya que fue el único que causó mortalidad en ratones. Se estableció un modelo murino de infección gastrointestinal imitando condiciones clínicas habituales de trauma e inmunosupresión para valorar la capacidad de translocación intestinal y diseminación de cepas de S. cerevisiae. Este estudio se llevó a cabo con el aislado virulento D14 y con el aislado avirulento D23. Se demostró que ambos aislados fueron capaces de atravesar la barrera intestinal, mientras que sólo se detectó diseminación consistente en órganos distantes, como hígado, riñones, cerebro y nódulos mesentéricos en el caso del aislado virulento D14. A continuación, se procedió a llevar a cabo un análisis genómico de 4 cepas de S. cerevisiae, en las cuales se incluía el aislado D14, una cepa de laboratorio avirulenta W303 y dos aislados clínicos virulentos (60 y 102) estudiados previamente en nuestro grupo. Se mostró variabilidad en la composición genómica entre las zonas subteloméricas de estos aislados, siendo ésta mayor en los aislados virulentos (D14, 60 y 102). Además, la mayoría de los genes que presentaban variación en el número de copias se situaban en estas regiones. También se observó una aneuploidía en el aislado clínico 60, la cual podría proporcionar una ventaja selectiva sobre ciertas condiciones ambientales. Se vieron también cambios en el número de copias de genes relacionados con la reparación de bases causada por daño oxidativo o de genes del metabolismo del glutation. Por otra parte, se realizó un estudio comparativo de la supervivencia en sangre humana de las cepas virulentas D14 y 60 y la cepa de laboratorio avirulenta W303, donde se demostró que las cepas virulentas fueron capaces de sobrevivir en sangre humana y el porcentaje de supervivencia fue equivalente al de una cepa patógena ensayada de la especie C. albicans. Utilizando el modelo de supervivencia en sangre humana, se llevó a cabo un análisis transcriptómico de los aislados virulentos D14 y 60, la cepa de laboratorio W303 y una cepa vínica avirulenta CECT 10.431. Se observó una respuesta transcripcional específica por parte de los aislados virulentos (D14 y 60) de genes implicados en la biosíntesis y metabolismo de aminoácidos y en genes de respuesta al estrés oxidativo. Además, tras la aplicación de un estrés oxidativo, las cepas virulentas mostraron mayor resistencia que las cepas avirulentas (CECT 10.431 y W303), sugiriendo una correlación entre la resistencia al estrés oxidativo y la patogenicidad. Por último, los cambios observados en el análisis genómico no se pudieron correlacionar con el nivel de expresión de estos genes en el análisis transcriptómico. Por tanto, cabe pensar que una expresión diferencial entre cepas virulentas y avirulentas sea resultado de la adaptación de las primeras al medio sanguíneo. Este estudio podría ser de gran interés para todas aquellas industrias alimentarias que incluyen a S. cerevisiae en sus preparados, con el fin de evitar la administración de dichas cepas de levaduras a individuos inmunodeprimidos. Puesto que el carácter híbrido no parece conferir habilidad infectiva, el uso de este tipo de cepas en la preparación de suplementos dietéticos podría ser garantía de seguridad.	es_ES
dc.format.extent	341 p.	es_ES
dc.language.iso	es	es_ES
dc.subject	productos dietéticos	es_ES
dc.subject	factores de virulencia en levadura	es_ES
dc.subject	patógeno emergente	es_ES
dc.subject	resistencia a estrés oxidativo	es_ES
dc.subject	Saccharomyces cerevisiae	es_ES
dc.title	Estudio del potencial patógeno de cepas de Saccharomyces cerevisiae aisladas de suplementos dietéticos y probióticos	es_ES
dc.type	doctoral thesis	es_ES
dc.subject.unesco	UNESCO::CIENCIAS DE LA VIDA	es_ES
dc.subject.unesco	UNESCO::CIENCIAS MÉDICAS	es_ES
dc.embargo.terms	0 days	es_ES