Introducción El trabajo de investigación de la presente Tesis doctoral realizado por Javier Gilabert Juan, ha estado centrado en el estudio de la plasticidad estructural neuronal de interneuronas en trastornos psiquiátricos, abordado desde diferentes estrategias de estudio: modelos animales, estudios en muestras de cerebro postmortem de pacientes con enfermedades psiquiátricas y estudios de asociación. Durante los últimos años, diversos trabajos han puesto de manifiesto que ciertas neuronas del sistema nervioso central (SNC) adulto son capaces de remodelar su estructura y cambiar sus conexiones. Esta plasticidad estructural subyace a fenómenos cognitivos y se produce también como respuesta a experiencias aversivas, como el miedo o la ansiedad, en animales de experimentación y en modelos animales de esquizofrenia y de depresión. Más aún, se han detectado cambios estructurales similares en el cerebro de pacientes, y los antipsicóticos comunes y los fármacos que inducen psicosis también son capaces de modular la plasticidad estructural neuronal. Estos descubrimientos han dado lugar a una nueva hipótesis, denominada hipótesis neuroplástica, para explicar el origen de diferentes trastornos psiquiátricos como la esquizofrenia o la depresión. Algunas de las regiones más afectadas en los modelos animales de esquizofrenia, depresión o estrés y en pacientes con estos trastornos son la corteza prefrontal y el sistema límbico: hay un gran número de evidencias de que estas regiones sufren remodelado dendrítico y de espinas. Estos cambios morfológicos están normalmente mediados por cambios en la expresión de proteínas de adhesión, como la molécula neural de adhesión celular (NCAM). Ésta es particularmente interesante porque es capaz de incorporar largas cadenas de ácido polisiálico (PSA) que le confiere propiedades anti-adhesivas y, por tanto, promueve la capacidad de remodelado estructural de las neuronas que la expresan o de aquellas que están en contacto con ellas. Consecuentemente, tanto la corteza prefrontal como la amígdala o el hipocampo muestran niveles elevados de expresión de PSA-NCAM en el cerebro de roedores adultos, estas estructuras son moduladas paralelamente al remodelado estructural sufrido tras la exposición a experiencias aversivas. Los objetivos de este estudio han sido: (i) Estudio del efecto del estrés crónico sobre sobre la plasticidad estructural y sobre la transmisión inhibitoria en la amígdala y la corteza prefrontal de roedores. (ii) Estudio de la plasticidad estructural en interneuronas en modelos experimentales de esquizofrenia. (iii) Análisis de la posible alteración de marcadores de plasticidad y de transmisión inhibitoria en muestras de cerebro postmortem de pacientes con diferentes enfermedades mentales. (iv) Estudio de la asociación caso-control entre la esquizofrenia y el gen ST8SIAII que codifica para una de las enzimas responsables de la polisialización de la molécula NCAM. Metodología y Resultados ARTÍCULO 1. ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN DE PSA-NCAM Y LA ARBORIZACIÓN DE INTERNEURONAS EN LA AMÍGDALA DE UN MODELO ANIMAL DE ESTRÉS CRÓNICO. El objetivo de este trabajo es estudiar si existen diferencias en la expresión de PSA-NCAM o de diferentes moléculas relacionadas con la neurotransmisión inhibitoria en la amígdala de ratones transgénicos portadores de la proteína verde fluorescente (EGFP) en una población de interneuronas (GIN) expuestos a estrés crónico, un modelo de depresión o ansiedad. RESULTADOS: Encontramos una disminución de las proteínas PSA-NCAM, GAD67 y sinaptofisina en la amígdala de estos ratones. Además, estas disminuciones en la expresión de estas moléculas van acompañadas de un descenso en la expresión de los genes de la polisialiltransferasa St8SiaII y de GAD67. En cuanto a la arborización dendrítica de las interneuronas, encontramos que existe una menor arborización en individuos estresados respecto a la de individuos control. Publicación: Chronic stress induces changes in the structure of interneurons and in the expression of molecules related to neuronal structural plasticity and inhibitory neurotransmission in the amígdala of adult mice. Gilabert-Juan J, Castillo-Gomez E, Pérez-Rando M, Moltó MD, Nacher J. Experimental Neurology 2011 Nov;232(1):33-44. ARTÍCULO 2. ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN DE PSA-NCAM Y LA ARBORIZACIÓN DE INTERNEURONAS EN LA CORTEZA PREFRONTAL DE UN MODELO ANIMAL DE ESTRÉS CRÓNICO. En este trabajo se ha estudiado la arborización dendrítica de interneuronas de la corteza prefrontal. Además, se ha realizado una comparación de la expresión génica de diferentes marcadores de neurotransmisión inhibitoria y plasticidad neuronal, junto con recuentos de somas neuronales que expresan GAD67 y PSA-NCAM. RESULTADOS: Encontramos una disminución del número de somas que expresan GAD67, sin detectar cambios en el número de somas PSA-NCAM inmunoreactivos. Además, estas disminuciones en el número de somas van acompañadas de un aumento en la arborización dendrítica de interneuronas. En lo que respecta a la expresión génica, vemos un aumento de expresión de NCAM, sinaptofisina y la subunidad alfa del receptor A de GABA. Publicación: Chronic stress alters inhibitory networks in the medial prefrontal cortex of adult mice. Gilabert-Juan J, Castillo-Gomez E, Guirado R, Moltó MD, Nacher J. Brain Structure and Function. 2012 Nov 21. ARTÍCULO 3. ANÁLISIS DE MARCADORES RELACIONADOS CON LA NEUROTRANSMISIÓN INHIBITORIA Y LA EXPRESIÓN DE PSA-NCAM EN LA AMIGDALA DE UN MODELO ANIMAL DE ESQUIZOFRENIA: AISLAMIENTO SOCIAL PROLONGADO TRAS EL DESTETE. El este caso, el objetivo general ha sido determinar las posibles alteraciones en la expresión de diversos genes relacionados con la neurotransmisión inhibitoria y la plasticidad estructural en la amígdala de ratas aisladas socialmente después del destete. RESULTADOS: En la amígdala de ratas sometidas a aislamiento encontramos un aumento de la expresión de las proteínas NCAM, PSA-NCAM y GAD67, sin cambios en expresión de ARNm. Publicación: Post-weaning social isolation rearing influences the expression of molecules related to inhibitory neurotransmission and structural plasticity in the amígdala of adult rats. Gilabert-Juan J, Moltó MD, Nacher J. Brain Research. 2012 Apr 11;1448:129-136. ARTÍCULO 4. ANÁLISIS DE CAMBIOS ESTRUCTURALES Y FUNCIONALES EN UN MODELO ANIMAL “DE DOBLE IMPACTO” DE ESQUIZOFRENIA. Este estudio ha consistido en la valoración de diferentes cambios estructurales y bioquímicos en la corteza prefrontal medial y el hipocampo de ratas sometidas a aislamiento social perinatal y a antagonistas de receptores NMDA durante el desarrollo. RESULTADOS: En el modelo doble observamos reducción del volumen de la corteza prefrontal y el hipocampo, diferencias de peso entre los individuos, alteraciones en la expresión génica de calbindina, calretinina y ErbB4 en la corteza prefrontal y reducción del número de células parvalbumina positivas. También se detectan disminuciones en el número de células inmaduras que expresan la proteína doblecortina en el hipocampo y activación de neuronas excitadoras en la corteza prefrontal medial. Publicación: A “double hit” murine model for schizophrenia shows alterations in the structure and neurochemistry of the medial prefrontal cortex and the hippocampus. Gilabert-Juan J, Belles M, Saez AR, Carceller H, Moltó MD, Nacher J. Neurobiology of disease. En revisión ARTÍCULO 5. ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN DE MARCADORES DE TRANSMISIÓN INHIBITORIA EN LA CORTEZA PREFRONTAL DE PACIENTES CON DEPRESIÓN GRAVE, ESQUIZOFRENIA Y DESORDEN BIPOLAR, PROCEDENTES DEL STANLEY NEUROPATHOLOGY CONSORTIUM. El objetivo de este estudio es analizar si existen diferencias en la expresión de la molécula PSA-NCAM en la corteza prefrontal de cerebros postmortem procedentes de pacientes psiquiátricos y controles cedidos por el Stanley Neuropathology Consortium de la Fundación Stanley. Este análisis implicó el estudio de la expresión y distribución de PSA-NCAM y otras moléculas relacionadas con la plasticidad neuronal, tanto en somas neuronales como en el neuropilo. RESULTADOS: Encontramos una disminución de la expresión de las proteínas sinaptofisina y GAD67 en los pacientes de esquizofrenia, que es similar a la encontrada en los pacientes con desorden bipolar. En cuanto a los individuos que cursan con depresión mayor, hay una disminución en la expresión de PSA-NCAM, sinaptofisina y GAD67, junto con un aumento en la expresión del marcador de sinapsis excitadoras VGLUT1. Publicación: Alterations in the expression of PSA-NCAM and synaptic proteins in the dorsolateral prefrontal cortex of psychiatric disorder patients. Gilabert-Juan J, Varea E, Guirado R, Blasco-Ibáñez JM, Crespo C, Nácher J. Neuroscience Letters. 2012 Nov 14;530(1):97-102. ARTÍCULO 6. ESTUDIO DE ASOCIACIÓN CASO-CONTROL ENTRE LA ESQUIZOFRENIA Y EL GEN ST8SIAII. Este trabajo de asociación caso-control pretende replicar las asociaciones encontradas previamente en dos poblaciones asiáticas entre la esquizofrenia y el gen ST8SIAII. Este gen codifica para una de las enzimas responsables de la polisialización de la molécula NCAM. Asimismo, otro objetivo del presente estudio ha sido identificar nuevos alelos, genotipos y haplotipos de ST8SIAII que puedan constituir factores de vulnerabilidad genética en la esquizofrenia. Se ha partido de una muestra de 508 pacientes diagnosticados de esquizofrenia según criterios DSMIV (36.4% mujeres y 63.6% hombres) y 428 controles sanos sin antecedentes familiares de enfermedad mental (30.8% mujeres y 69.2% hombres). Resultados: Se encuentra diferente asociación de polimorfismos de un solo nucleótido (Single Nucleotide Polimorphisms, SNPs), situados en el promotor del gen, en hombres y mujeres con esquizofrenia. Además se identifica un haplotipo de riesgo en hombres afectados por la enfermedad. Dicho haplotipo se construye a partir de varios polimorfismos del promotor y un SNP de la región codificante del gen. Publicación: Sex-specific Association of the ST8SIAII Gene with Schizophrenia in a Spanish population. Gilabert-Juan J, Nacher J, Sanjuan J, Molto MD. American Journal of Medical Genetics part B. En revisión. Discusión De acuerdo a los resultados obtenidos en este trabajo, la expresión de la molécula PSA-NCAM se encuentra alterada en los diferentes modelos de enfermedades psiquiátricas estudiados y en las diferentes áreas del cerebro implicadas en la etiopatología de estos desordenes. Además, como hemos comprobado, esta molécula implicada en la plasticidad estructural neuronal se haya estrechamente ligada a las alteraciones en el sistema de neurotransmisión inhibitoria. Por lo tanto podemos afirmar que existe una estrecha relación entre el correcto funcionamiento de este sistema y su plasticidad. Asimismo, vemos que los resultados obtenidos en los modelos animales estudiados en esta tesis son en cierto modo similares a los que se obtienen en los estudios de muestras post-mortem de pacientes, lo cual apoya el uso de estos modelos en el estudio de las enfermedades psiquiátricas de las que pretenden reproducir algunos aspectos. Finalmente, se ha comprobado que en la población caucásica también se encuentra asociación entre el gen ST8SIAII y la esquizofrenia, en los polimorfismos situados en el promotor. Este resultado indica, por un lado que variaciones en la expresión del gen ST8SIAII pueden ser críticas para el buen funcionamiento del sistema nervioso, y por otra parte, que dicho gen puede presentar alelos que confieran vulnerabilidad a la esquizofrenia. Conclusiones 1. Las células que expresan la proteína verde fluorescente (EGFP) en la corteza prefrontal medial (CPM) de ratones GIN adultos corresponden principalmente a una subpoblación de interneuronas Martinotti. 2. El estrés crónico en ratones GIN adultos induce hipertrofia dendrítica en interneuronas que expresan EGFP en la CPM. 3. El estrés crónico en ratones GIN adultos disminuye el número de interneuronas que expresan GAD67 y GAD-EGFP en la CPM. 4. El estrés crónico provoca hipotrofia dendrítica en las interneuronas que expresan EGFP en el núcleo basomedial de la amígdala de ratones GIN adultos. 5. El estrés crónico induce una disminución en la expresión de distintos marcadores moleculares de plasticidad estructural neuronal y de neurotransmisión inhibitoria (NCAM, sinaptofisina y receptor GABAA alfa) en la amígdala de ratones GIN adultos. 6. El aislamiento social prolongado tras el destete en ratas Lister Hooded induce aumentos en la expresión de las proteínas GAD67, PSA-NCAM y NCAM en los núcleos amigdalinos. 7. La combinación de una inyección perinatal del antagonista del receptor de NMDA, MK-801 y el aislamiento social prolongado tras el destete en ratas Lister Hooded, es un modelo animal de esquizofrenia “de doble impacto”, que reproduce un espectro más amplio de alteraciones estructurales y moleculares que cualquiera de los modelos individuales por sí mismo. 8. El modelo animal de esquizofrenia “de doble impacto” desarrollado en esta tesis presenta reducciones en el volumen de la CPM y el hipocampo. 9. El modelo “de doble impacto” muestra una reducción en el número de interneuronas que expresan parvalbúmina, altera la expresión génica de calbindina, calretinina y ErbB4 y reduce la expresión de PSA-NCAM y GAD67 en la CPM. La expresión de PSA-NCAM también se encuentra reducida en el hipocampo en este modelo. 10. El modelo “de doble impacto” muestra un aumento en el número de neuronas granulares inmaduras que expresan la proteína doblecortina en el hipocampo. 11. El modelo “de doble impacto” presenta un aumento del número de neuronas que coexpresan el gen de expresión temprana “c-fos” y el marcador de neuronas excitadoras “CaMKII” en la CPM. 12. La expresión de distintos marcadores sinápticos y de plasticidad estructural neuronal se encuentra alterada en la corteza prefrontal dorsolateral de pacientes con trastornos psiquiátricos. Concretamente está reducida la expresión de PSA-NCAM se encuentra reducida en pacientes esquizofrénicos, la de sinaptofisina en pacientes de depresión mayor, la de VGLUT1 en pacientes con trastorno bipolares y en pacientes con depresión, y la de GAD67 en todos los grupos de pacientes estudiados. 13. El polimorfismo rs3759916 del gen ST8SIAII, situado en su región promotora, se encuentra asociado a esquizofrenia en la población femenina española, y un haplotipo de este gen también se asocia a la enfermedad en la población masculina española, sugiriendo que ST8SIAII podría representar un factor de riesgo genético en el desarrollo de la esquizofrenia, afectando de forma diferente dependiendo del sexo del individuo.