Todas las células, ya sean eubacterias, arqueas o eucariotas, están delimitadas por membranas, cuyo componente estructural básico es una fina capa de moléculas anfipáticas organizadas en dos monocapas lipídicas enfrentadas, en las que residen multitud de proteínas íntimamente asociadas a esta la bicapa de múltiples maneras. La membrana juega un papel fundamental para la supervivencia de las células, define sus límites estableciendo una barrera físico-química para moléculas polares a la vez que delimita los diferentes compartimentos celulares.A pesar de la importancia de las proteínas de membrana únicamente el 1.5% de las estructuras depositadas en el “Protein Data Bank” (PDB) (incluyendo las estructuras redundantes) corresponde a estructuras de polipéptidos pertenecientes a este grupo. Esto se debe, fundamentalmente, a las dificultades técnicas que presenta el trabajo con este tipo de proteínas, lo que convierte a las novedosas aproximaciones moleculares y a todos aquellos métodos computacionales que nos permitan obtener modelos estructurales de proteínas de membrana en grandes herramientas de trabajo, tanto por los propios resultados que ofrecen como por servir de punto de partida para el diseño de futuros experimentos.La correcta topología de una proteína de membrana (determinación del número de segmentos TM y su orientación relativa en la membrana) es fundamental para poder llevar a cabo su función biológica, y en ausencia de información estructural de alta resolución, se convierte en una herramienta imprescindible para la comprensión de los sistemas de membrana. Generalmente la topología que adquiere una proteína es única, aunque se han identificado casos en los que una misma secuencia es capaz de insertarse en la membrana con dos topologías opuestas (Rapp et al., 2006; 2007). Existen diferentes factores que determinan la topología de una proteína, la presencia de secuencia de direccionamiento a membrana (SS), entre los que hay que destacar las cargas flanqueantes al los fragmentos TM, el plegamiento de dominios estructurales N‐t y la hidrofobicidad del segmento TM.El objetivo general de esta tesis es la comprensión de la inserción y el ensamblaje en la membrana lipídica de α-hélices presentes en las proteínas de membrana. Durante el estudio intensivo de estas proteínas, en esta tesis se abordaron los siguientes objetivos concretos: - Desarrollar una nueva estrategia molecular basada en la glicosilación co-traduccional para la determinación de la topología de proteínas de membrana. - Analizar la topología en la membrana del retículo endoplasmático de la proteína viroporina 2B de Poliovirus. Describir las interacciones intramoleculares que estabilizan la estructura de la proteína en la membrana biológica. - Estudiar el efecto de los residuos polares en la inserción y plegamiento de las α-hélices de las proteínas de membrana. - Describir el papel del retículo endoplasmático en la biosíntesis de la peroxina PEX3 humana en el contexto de la biogénesis peroxisomal. R.4. CONCLUSIONES Capítulo 1 “N-Glycosylation efficiency is determined by the distance to the C-terminus and the amino acid preceding an Asn-Ser-Thr sequon” - La eficiencia de glicosilación depende de la distancia entre el residuo de Asn aceptor y el extremo C-terminal del polipéptido, aumentando gradualmente con la distancia entre ambos. - Se ha demostrado que las etiquetas de glicosilación en C-terminal necesitan un mínimo de seis residuos para una glicosilación eficiente. - La naturaleza del aminoácido que precede la Asn receptora afecta a la eficiencia de glicosilación. En concreto, los residuos de Met, Trp y Arg disminuyen significativamente la eficiencia de glicosilación. - Estadísticamente, los 20 aminoácidos naturales se han encontrado precediendo al residuo de Asn aceptor, pese a que hay diferencias significativas en las probabilidades de encontrar cada residuo. - Se validó la utilidad de las etiquetas de glicosilación para estudios de la topología de proteínas de membrana, aportando un rápido y eficiente método para su determinación. Capítulo 2 “Membrane integration of Poliovirus 2B Viroporin; a naturally occurring α-helical hairpin” - Las regiones hidrofóbicas de la viroporina 2B en el contexto de la proteína modelo Lep no se integran como segmentos TM en presencia de membranas de derivadas del ER, pero sí lo hacen conjuntamente como una horquilla α-helicoidal. - La viroporina 2B es integrada co-traduccionalmente en membrana de ER a través del translocon como una proteína de membrana con dos segmentos TM y una orientación N-/C- terminal citoplasmática. - Las regiones hidrofóbicas 1 y 2 (RH1 y RH2) interaccionan entre si para formar el motivo hélice-giro-hélice que cruza la membrana. Se ha encontrado una posible estabilización adicional del motivo por los residuos localizados en el giro que conecta ambas hélices. - La topología encontrada para la viroporina 2B fue demostrada en cultivos celulares, donde se mantuvó su capacidad permeabilizante. - El residuo cargado negativamente (Asp74) es crítico para la integración de la horquilla. - Los modelos moleculares obtenidos usando el protocolo “Rosseta” claramente resaltaron la preferencia de las Lys46 y Lys42 para interaccionar con el residuo Asp74. - El plegamiento nativo de la proteína 2B puede estar favorecido por interacciones electroestáticas entre Lys-Asp localizadas en los fragmentos TM adyacentes. - Los resultados sugieren que la formación de la α-helice horquilla se produce en los estadíos iniciales de la biogénesis de la proteína, en concreto en el translocon, permitiendo las interacciones polares entre TM consecutivos, estabilizando estos residuos en el polipéptido naciente. Capítulo 3 “Polar/Ionizable Residues in Transmembrane Segments: Effects on Helix-Helix Packing” - Se analizó la distribución de los residuos ionizables (Asp, Glu, Lys y Arg) en los segmentos TM a partir de estructuras de alta resolución de proteínas de membrana, estando presente en una frecuencia baja. - A partir de nuestros experimentos en micelas de SDS, se concluye que las sustituciones de un residuo no polar por un residuo ionizable en la interfase de interacción de las hélices compromete severamente la formación del dímero. Por el contrario, si el motivo de dimerización (la secuencia GxxxG) no es afectado y la sustitución se produce alejada de la interfase de interacción, dichas sustituciones no impiden la dimerización. - Un puente salino intra-helice o interacciones mediante puentes de hidrogeno entre Lys y Asp localizados en la mismo lado de la hélice del segmento TM pueden facilitar la inserción del TM en membranas biológicas debido a la reducción del coste de la energia libre que requiere su reparto entre la membrana y la fase acuosa. - Nuestros resultados indican que la presencia de residuos ionizables no impiden la inserción en la membrana y permiten la formación de dímeros tanto in vitro como en membranas de células bacterianas. Capítulo 4 “Human Peroxisomal Membrane Protein PEX3: SRP-dependent Co-translational Integration into and Budding Vesicle Exit from the ER Membrane” - La primera región hidrofóbica de PEX3 (RH1) es reconocida y unida por la SRP cuando emerge del ribosoma, indicando que actúa como secuencia señal. - RH1, pero no RH2 de PEX3, es integrada eficientemente en la membrana del ER. Además, la RH1 es necesaria y suficiente para la integración estable de PEX3 en la membrana del ER. - Los foto-aductos covalentes entre Sec61α y cadenas nacientes de PEX3 son sólo observables en presencia de SRP. Además, la SRP es requerida para dirigir la cadena naciente al translocon. - La RH1 interacciona secuencialmente con Sec61α y TRAM durante su biogénesis. Estos resultados demuestran que PEX3 se inserta co-traduccionalmente en la membrana del ER mediante la ruta dependiente de SRP y del translocón. - Hemos demostrado en este capítulo que una proteína peroxisomal humana (PEX3) es selectivamente extraída de la membrana del ER mediante la formación vesículas en un proceso dependiente de ATP. Este trabajo define el papel del ER en la biogénesis de los peroxisomas desde los estadios iniciales hasta el final.Most of the processes in a living cell are carried out by proteins. Depending on the needs of the cell, different proteins will interact and form the molecular machines demanded for the moment. A subset of proteins called integral membrane proteins are responsible for the interchange of matter and information across the biological membrane, the lipid bilayer surrounding and defining the cell. Molecular traffic and information flow across biological membranes are mediated by the channel, transporter, and receptor activities of the proteins embedded within them. These proteins are characterized by the presence of transmembrane domains (TMDs), polypeptide sequences uniquely adapted to insert, fold, and function in the complex solvent environment of cellular membranes. TMDs may be divided into two broad classes based on their secondary structure: β-barrels that are resident in the outer membranes of bacteria, mitochondria, and chloroplasts and α-helical bundles that traverse the cytoplasmic membranes of archaeal, bacterial, and eukaryotic cells.In this thesis we focus on the α-helical membrane proteins, a class of molecules that represents 20–30% of all open reading frames in fully sequenced genomes (Krogh et al., 2001). However, our understanding of their biosynthesis and folding lags far behind our understanding of water-soluble proteins, due to the complexity of their purification and membrane characteristics.