NAGIOS: RODERIC FUNCIONANDO

Polymer Drug Conjugates for the Treatment of Neurodegenerative Disorders

Repositori DSpace/Manakin

Valencià Castellano

Inici
Investigació
e-prints
23 - Química
Visualitza element

IMPORTANT: Aquest repositori està en una versió antiga des del 3/12/2023. La nova instal.lació está en https://roderic.uv.es/

Polymer Drug Conjugates for the Treatment of Neurodegenerative Disorders

Mostra el registre parcial de l'element

dc.contributor.advisor	Vicent Docón, María Jesús
dc.contributor.author	Conejos Sánchez, Inmaculada
dc.contributor.other	Departament de Quimica Orgànica	es_ES
dc.date.accessioned	2013-07-29T07:43:35Z
dc.date.available	2013-08-29T06:10:03Z
dc.date.issued	2013
dc.date.submitted	30-07-2013	es_ES
dc.identifier.uri	http://hdl.handle.net/10550/29288
dc.description.abstract	Nanociencia y nanotecnología son la base de técnicas innovadoras para el transporte de fármacos con beneficios potenciales para el paciente y nuevos mercados para la industria. La obtención de nuevos sistemas de transporte de fármacos más efectivos es uno de los principales retos actuales, junto con la mejora del diagnóstico tanto in vitro como in vivo y el desarrollo de tecnologías para la ingeniería tisular y la medicina regenerativa. Además de ser necesario disponer de moléculas con actividad farmacológica para conseguir terapias efectivas se necesitan su transporte y liberación controlada para llegar a conseguir tratamientos con mayor índice terapéutico. El uso de estrategias de direccionabilidad (‘targeting’), tanto activa (unión del portador a residuos dirigentes) como pasiva (acumulación en zonas enfermas por efecto EPR, Enhanced and Permeability Retention effect) permite la acumulación del fármaco en el tejido enfermo, aumentando la actividad y reduciendo la toxicidad sistémica inherente de los fármacos. En la actualidad existen terapias muy interesantes por su actividad terapéutica o mecanismo de acción molecular pero, debido a su toxicidad, baja solubilidad del compuesto, estabilidad, capacidad de transporte intracelular o difícil farmacocinética son abandonadas antes de llegar a clínica por no disponer de un sistema de transporte celular adecuado que los solubilice, proteja o dirija a su diana molecular, ej: péptidos, proteínas o terapias basadas en ácidos nucléicos (DNA, siRNA, oligonucleótidos…). El desarrollo multidisciplinar de la química de polímeros, la biología, la física y la medicina ha dado lugar a los primeros nanofármacos poliméricos entre los que se encuentran los ‘Polímeros Terapéuticos’ (PT): nanoconstrucciones híbridas que emplean polímeros hidrosolubles, tanto de forma bioactiva como parte funcional inerte de un complejo multicomponente, donde el agente bioactivo se une de forma covalente al portador polimérico mediante un enlace que responde frente a condiciones fisiológicas específicas. Desde un punto de vista industrial, los PT son considerados como nuevas entidades químicas y no como simples sistemas convencionales de transporte de fármacos (‘depots’) . Los sistemas de transporte tradicionales simplemente atrapan, solubilizan o liberan de forma controlada el agente bioactivo sin utilizar una conjugación química. Conceptualmente, los Polímeros Terapéuticos comparten muchas características con otros fármacos macromoleculares (como proteínas, anticuerpos u oligonucleótidos) y profármacos macromoleculares, incluyendo los inmunoconjugados. Sin embargo, poseen ventajas adicionales como la versatilidad de la química sintética, que permite confeccionar el peso molecular y adicionar características biomiméticas, o la posibilidad de incluir elementos que responden a cambios fisiológicos. El término “Polímeros Terapéuticos” engloba cinco grupos de nanoconstrucciones: fármacos poliméricos (polímeros con actividad inherente), conjugados polímero-fármaco, conjugados polímero-proteína, poliplejos con aplicación como vectores no virales en transporte génico y micelas poliméricas con el fármaco conjugado de forma covalente a un polímero anfifílico . Tras la salida al mercado de los primeros conjugados polímero-proteína y el creciente número de conjugados polímero-fármaco en fase clínica, los conjugados poliméricos anticancerígenos se establecen como terapia efectiva para el tratamiento del cáncer. Actualmente, esta plataforma tecnológica se centra en obtener conjugados de segunda generación que suplan las dificultades encontradas hasta el momento y propongan mejoras considerables respecto a sus características y propiedades. Se han aceptado cuatro nuevas estrategias para que esta novedosa plataforma tecnológica dé lugar a terapias más específicas y efectivas: (i) la búsqueda de nuevos soportes poliméricos (polímeros biodegradables con elevado Mw, arquitecturas poliméricas definidas y controladas), (ii) la caracterización físico-química exhaustiva de estos sistemas para una mejor comprensión de su comportamiento biológico, (iii) su aplicación a nuevas dianas terapéuticas en áreas distintas al cáncer y (iv) el uso de terapia de combinación para obtener compuestos de mayor índice terapéutico. Siguiendo estas directrices, en la presente tesis doctoral se han desarrollado varias de las nombradas aproximaciones: la síntesis de novedosos portadores poliméricos basados en el ácido poli-L-glutámico, caracterizado por su biodegradabilidad, multifuncionalidad y versatilidad; su utilización como base para obtener conjugados polímero-fármaco focalizados en el tratamiento de desordenes neurodegenerativos, diana novedosa y actualmente en crecimiento exponencial dentro del campo de PT y el uso de terapia de combinación como herramienta para una posible sinergia en el tratamiento. La propuesta de la diana terapéutica elegida responde al reto actual del aumento de la expectativa de vida en nuestra sociedad, el cual ha traído consigo un incremento de las enfermedades crónicas neurodegenerativas en la población de edad avanzada. Estas enfermedades pueden subdividirse dependiendo del sistema nervioso al que afecten, el periférico (SNP) o el central (SNC). En este último la dificultad se acentúa debido a que su tratamiento requiere atravesar una barrera biológica protectora con elevada restricción al paso de fármacos al cerebro: la barrera hematoencefálica (BHE). La estrategia propuesta en esta tesis doctoral ha sido la utilización de PT como plataforma tecnológica para el desarrollo de conjugados poliméricos multivalentes con aplicaciones para el tratamiento de la neurodegeneración, tanto a nivel periférico como central, siendo capaces de atravesar la BHE y liberar el(los) fármaco(s) conjugado(s) en el cerebro. Estos sistemas vencerían las limitaciones mostradas por agentes terapéuticos de bajo peso molecular tales como la internalización celular y aumentarían la especificidad del tratamiento. De entre las diversas metodologías existentes para cruzar la BHE, en el presente trabajo se seleccionó el transporte activo. Esta estrategia propone el uso de vehículos transportadores (sistemas de transporte de fármacos, DDS) para los nutrientes naturales, desarrollando complejos moleculares como “caballos de Troya”. Para ello, se utilizan residuos dirigentes que sean capaces de ser reconocidos por un transportador activo localizado en el área apical de la barrera hematoencefálica, como por ejemplo el receptor de transferrina (TfR). En un primer lugar y como ejemplo de enfermedad neurodegenerativa, el trabajo se ha centrado en la obtención y estudio de conjugados polímero-fármaco para el tratamiento de polineuropatías familiares amiloideas (PAF) que principalmente afectan a SNP, pero que parcialmente dañan al SNC, por tanto, también se han desarrollado sistemas poliméricos dirigidos para atravesar la BHE. Una vez este reto superado, el tratamiento diseñado para FAP podría explorarse en otro tipo de enfermedades amiloideas como la conocida enfermedad de Alzheimer. Las polineuropatías amiloidóticas familiares (PAF) son enfermedades neurodegenerativas caracterizadas por una deposición sistémica extracelular de fibrillas amiloides de la proteína transtirretina (TTR). La PAF se presenta clínicamente con neuropatía periférica, sensitivo-motora y autonómica, produciendo una afectación cardíaca, ocular o renal, provocando la muerte 10-15 años tras iniciarse los primeros síntomas. Aunque con resultados variables, el trasplante hepático es la única alternativa terapéutica actualmente disponible para prevenir la progresión de la enfermedad. Por este motivo, en el presente proyecto se han desarrollado, por primera vez en el campo de la nanomedicina, nanoconjugados con potencial terapéutico como tratamiento de este tipo de enfermedades. Como agentes bioactivos para la conjugación con el portador polimérico se han utilizado la doxiciclina y una secuencia peptídica específica de receptores RAGE (péptido RAGE) ; actividad descubierta por la colaboradora del presente proyecto M.J. Saraiva y su grupo (IBMC, Portugal).	es_ES
dc.description.abstract	The design of second generation polymer conjugates is directed towards four main research areas: the synthesis of novel polymeric carriers with defined architectures, an exhaustive physico-chemical characterization through leading techniques, the use of combination therapy pursuing synergism and improved treatments and their application on novel molecular targets other than cancer, including the crossing of different biological barriers. These guidelines have been addressed in this thesis in which the main purpose was to build polymer-drug conjugates (PDCs) for the treatment of neurodegenerative disorders. Based on the well established properties of the poly-glutamic acid (PGA) as polymer carrier, a versatile and simple methodology for the preparation of well-defined polyglutamate nanocarriers has been described. For the first time non-nucleophilic tetrafluoroborate anions were used as NCA initiators allowing a multigram scale polyglutamate synthesis with defined molecular weight (up to 1200 units), low polydispersity (<1.2) and controlled end-chain functionality. Systems obtained encompass homopolymers (PGAn), diblocks (DB, PEGm-PGAn, PGAn-PEG-X) and triblock copolymers (TB, PEG-PGAn-PEG-X). The reason behind this design is based on: (i) the availability of points for site-specific conjugation (group X) ( for peptide, protein, antibody, etc binding), (ii) the study of the different cell trafficking and (iii) in vivo fate depending on polymer solution conformation and its effect on the expected biological output. In addition, deprotection methodology of PBLG (poly-benzyl-L-glutamates) was optimised yielding 100% benzyl removal without damaging co-polymers structure as well as maintenance of the adequate stereoselectivity. Then, post-polymerisation modification on the PGA block enabled specific and orthogonal conjugation of different bioactive molecules such as targeting ligands, labelling probes or drugs. Cytotoxicity of the novel nanocarriers was evaluated in HUVEC cells to secure their cell viability. Continuing with the in vitro assays,investigation of the precise mechanism of internalisation in the same cell model was performed aiming to explore possible differences based on the size and shape in solution of the different carriers. In all cases endocytosis was the preferred cell uptake mechanism and a lysosomotropic drug delivery was observed. Historically, many studies with PDCs have been focused on cancer treatment. Once the clinical benefits of these systems have been demonstrated, their use in other diseases has been also encouraged, in particular in the area of tissue regeneration and repair. In the present work, neurodegenerative disorders have been faced up. When damage in the central nervous system (CNS) is involved, drug must surpass a biological obstacle known as blood-brain barrier (BBB). Conjugation of a targeting ligand for blood-brain barrier (BBB) crossing though receptor-mediated endocytosis was the strategy selected for drug delivery into the brain. Ligands towards the transferrin receptor (TfR) (e.g. transferring (Tf), monoclonal antibody OX26 (mAbOX26), iron-mimicking cyclic peptide (cPEP) or Angiopep-2) were covalently linked to our polyglutamates trying to favor the BBB entry by active targeting. Molecular probes for fluorescence optical imaging, contrast agents for MRI or tracers for positron emission tomography (PET) were conjugated to our systems, with and without targeting ligands in order to monitor conjugate biodistribution comparing their BBB crossing capability. In most of the cases, the polymer platform linkage with the ligand was a disulphide bond. The bioreversible union allows the ligands to be released following transcytosis. All of the polyglutamate systems proved to have an appropriate biodistribution, where non-specific accumulation in any organ was observed and body elimination followed renal excretion. Regarding the targeted systems, TB-Tf was found in rat brain after tissue homogenation although in very low percentage. Aiming to increase the percentage, the natural ligand Tf which presents receptor saturation under physiologic conditions was substituted by an antibody able to selectively target this receptor with greater efficiency. mAbOX26 was successfully linked to the carrier but issues related to solubility issues limited a proper detection in brain.Consequently, peptide ligands were used instead. cPEP was directed to TfR and Angiopep-2 to the lipoprotein receptor-related protein-1 (LRP1). This last peptide is the most advanced for BBB crossing in phase II clinical trials. After the results obtained, PGA homopolymer and DB were the carriers selected for further studies. Monitoring of these targeted systems did not show BBB crossing may be due to low availability of the peptide motifs for receptor recognition. Currently other polyglutamates with different structures are being tested to surpass this inconvenience. When CNS is not involved but peripheral nervous system (PNS), brain entering is not a major problem. FAP (familiar amyloidotic polyneuropathy) is a rare amyloidotic disease where PNS is the main organ affected. A mutation in the protein transthyretin (TTR) promotes its aggregation ending up in fibril formation whose deposits promote organ failure. As a first proof of concept, treatment of FAP by means of PDCs was proposed. Continuing with the polymeric platforms exploited in this work, PGA and PEG were selected for conjugation of two bioactive molecules able to disrupt amyloid fibrils (doxycycline) and to suppress cytotoxicity promoted for the early aggregates (RAGE peptide). Two families of conjugates were synthesised following a rational design based on the extracellular target of the compounds and the properties and requirements of each drug. Total drug loading was varied as well as the linkage alternating biodegradable (disulphide) and non-biodegradable (amide) bonds. After in vitro screening in appropriate FAP models, Doxy conjugates showed higher activity than the parent drug at same concentration and RAGE peptide conjugates maintained the original activity. The best candidate of each library (PGA-CONH-Doxy and PEP1-PEG-PEP1) was selected and a full physico-chemical characterisation was performed in order to explain the activity found. Both conjugates proved by LCMS or HPLC techniques to be stable under the in vitro conditions used implying non requirement of drug release to achieve activity while the others not. Furthermore, the conjugates demonstrated stability in plasma and non haemolytic activity confirming their suitability for intravenous administration. Studies on solution conformation by dynamic light scattering (DLS) showed marked differences in the RAGE peptide conjugates where more stable and smaller conjugates (Rh=0.6-3nm) corresponded to the most active ones. Regarding the PGA-Doxy, different ωt% loading did not show major differences in conformation in SANS (small angle neutron scattering) analysis corroborating the similar activity found with the selected conjugates. Previous to in vivo activity evaluation, biodistribution of the conjugates were performed resulting in non-specific organ accumulation and elimination via the kidney. Finally, combination therapy was proposed as a helpful tool due to the target species of the TTR aggregation cascade coexist in the advance stages of the disease. Initially, conjugation of both agents in the same polymer matrix (PGA homopolymer, DB or TB) was suggested but due to the unknown space among respective targets, individual PDCs were first tried and combination of the single conjugates was suggested as alternative. Thus, preliminary in vitro and in vivo studies with both conjugates (PGA-CONH-Doxy and PEP1-PEG-PEP1) were performed. Comparing the obtained results of immunohistochemistry analysis from single conjugates administration and their combination (without control samples) it could be concluded that the combination group showed lower deposition of non-fibrillar TTR. Histological analysis of the organs evidenced normal patterns in morphological tissue structures implying the safety of the administered conjugates. In any case, PGA-Doxy effect is planned to be evaluated in old FAP mice as well as a dose optimisation study should be performed in order to finally proved conjugates effectiveness in FAP.	en_US
dc.format.extent	586 p.	es_ES
dc.language.iso	en	es_ES
dc.subject	conjugados poliméricos	es_ES
dc.subject	polymer conjugates	es_ES
dc.subject	polymer therapeutics	es_ES
dc.subject	polímeros terapéuticos	es_ES
dc.subject	neurodegenerative disorders	es_ES
dc.subject	enfermedades neurodegenerativas	es_ES
dc.title	Polymer Drug Conjugates for the Treatment of Neurodegenerative Disorders	es_ES
dc.type	doctoral thesis	es_ES
dc.embargo.terms	1 month	es_ES