Resumen en castellano Estudio del metabolismo de los terpenos en Lavandula latifolia Medicus Justificación y objetivos La biosíntesis de los dos precursores universales de los terpenos vegetales, el isopentenildifosfato (IPP) y el dimetilalildifosfato (DMAPP), es un proceso complejo en el que intervienen dos rutas metabólicas independientes (Rodríguez-Concepción y Boronat, 2002; Lange y Ahkami, 2013): La ruta del mevalonato (MVA) que opera en el citosol, retículo endoplasmático y peroxisomas; y la ruta del metil-D-eritritol-4-fosfato (MEP) que opera en los plastos. La primera de ellas es la principal responsable de la biosíntesis de sesquiterpenos y esteroles mientras que la segunda lo es de la producción de monoterpenos, diterpenos y carotenoides (Lichtenthaler, 1999). Esta compartimentalización no es absoluta, dado que metabolitos comunes a ambas rutas pueden ser intercambiados a través de la membrana plastidial (Eisenreich y col., 2004; Bouvier y col., 2005; Lange y Ahkami, 2013). Los mecanismos que regulan las rutas MVA y MEP no están totalmente dilucidados, aunque en ambos casos parece existir un control a nivel transcripcional de las enzimas clave (McConkey y col., 2000). La ruta MVA está regulada, principalmente, al nivel de la 3-hidroxi-3-metilgluratil-coenzima A (HMG-CoA) reductasa, HMGR (Manzano y col., 2004, Enfissi y col., 2005). De hecho, la actividad HMGR regula tanto el flujo metabólico a través de la ruta MVA como la síntesis de los productos finales (Rodríguez-Concepción, 2006). En contraste, la regulación de la ruta MEP parece ser más compleja, ya que ésta puede ser regulada por varias enzimas, incluyendo la 1-deoxi-D-xilulosa-5-fosfato (DXP) sintasa (DXS), la DXP reductoisomerasa (DXR) y la hidroximetilbutenil 4-difosfato (HMBPP) reductasa (HDR). Esta última enzima es responsable de convertir directamente el HMBPP en IPP y DMAPP en el ultimo paso de la ruta MEP. Los resultados publicados hasta la fecha demuestran que la enzima DXS regula el flujo metabólico a través de la ruta MEP en varias especies vegetales (Rodríguez-Concepción, 2006), incluyendo el espliego (Lavandula latifolia Medicus ; Muñoz-Bertomeu y col., 2006). Así mismo, la actividad de la enzima HDR es limitante para la biosíntesis de isoprenoides en varios organismos, incluyendo bacterias y plantas (Rodríguez-Concepción, 2006). En contraste, el papel regulador de la enzima DXR está sometido a controversia, aunque hay pruebas de que puede limitar la biosíntesis de algunos isoprenoides plastidiales en algunas plantas (Mahmoud y Croteau, 2001; Carretero-Paulet y col., 2006). Por lo tanto, el flujo metabólico a través de la ruta MEP está controlado por varias enzimas, siendo las principales la DXS y la HDR, que son reguladas tanto a nivel transcripcional como post-transcripcional en respuesta a cambios metabólicos, ambientales y del desarrollo (Rodríguez-Concepción, 2006). El espliego es un arbusto aromático cuyo aceite esencial, formado mayoritariamente por monoterpenos, es sintetizado y acumulado en tricomas glandulares especializados. Nuestro grupo de investigación ha sobreexpresado, por separado, en espliego los genes HMG1 y DXS de Arabidopsis, que codifican respectivamente a las enzimas HMGR y DXS (Muñoz-Bertomeu y col., 2006 y 2007a). En esta misma especie también se ha sobreexpresado el gen de la limoneno sintasa de la menta (MsLS), que convierte el geranil difosfato (GPP) en limoneno. Las contribuciones más importante de estas investigaciones previas al conocimiento de la biosíntesis de monoterpenos en espliego son: Las rutas MEP y MVA están reguladas, al menos en parte, a nivel transcripcional ya que la sobreexpresión de los genes DXS (ruta MEP) o HMG1 (ruta MVA) aumenta significativamente la producción de aceites esenciales. El contenido en aceite esencial fue siempre mayor en las plantas de espliego que sobreexpresan el gen DXS, sugiriendo que la ruta MEP es la principal donadora de precursores C5 para la síntesis de monoterpenos. No obstante, los resultados con las plantas que sobreexpresan el gen HMG1 también apoyan la participación de la ruta MVA en la biosíntesis de estos compuestos. De cualquier modo, son necesarias más investigaciones para averiguar si el incremento en la producción de aceite fue el resultado de la inducción de una ruta MVA latente, bloqueada al nivel de la HMGR, o una activación de una ruta MVA ya existente. La sobreexpresión del gen MsLS causó alteraciones cuantitativas y cualitativas en el perfil de monoterpenos del aceite esencial, especialmente un incremento de limoneno. Partiendo de los resultados anteriormente expuestos, los objetivos de esta tesis son: Obtener plantas de espliego transgénicas que sobreexpresen el gen DXR de Arabidopsis. La caracterización molecular y fenotípica de estas plantas ayudará a clarificar si la enzima DXR, que cataliza el segundo paso de la ruta MEP, controla la producción de aceite esencial en esta especie. Obtener plantas de espliego transgénicas que sobreexpresen el gen de la linalol sintasa (MsLIS) de Clarkia breweri, que convierte el GPP en linalol. Los aceites esenciales de flores de espliego más apreciados son aquellos con alto contenido en linalol. Por tanto, la generación de plantas de espliego que sobreexpresen el gen de la linalol sintasa puede ser una aproximación válida para aumentar la calidad de su aceite esencial. El linalol está presente únicamente en trazas en el aceite de las hojas, lo que puede facilitar el análisis fenotípico de las plantas transgénicas. Estudiar si la co-expresión de genes que codifican las enzimas reguladoras de las rutas MVA y MEP y de genes que codifican monoterpeno sintasas maximizaría la producción de monoterpenos concretos en el aceite de espliego; esta aproximación sería de interés para producir plantas de espliego con valor añadido. Específicamente se obtendrán las siguientes plantas doble transgénicas: 1) plantas con los genes HMGR y DXS; 2) plantas con los genes DXS y LIS (linalol sintasa). Dilucidar la posible contribución de las rutas MVA y MEP a la biosíntesis de los monoterpenos en espliego. El estudio se llevará a cabo mediante dos aproximaciones experimentales complementarias: utilizando inhibidores específicos de cada una de las rutas y con experimentos de marcaje con U-13C-glucosa, 13CO2 y 13C-mevalonato. Todo ello ayudará a diseñar nuevas aproximaciones biotecnológicas para mejorar la síntesis de terpenos en espliego. 2. Métodos 2.1 Material Vegetal El material vegetal inicial utilizado consistió en semillas de espliego (Lavandula latifolia Medicus) suministradas por Intersemillas SA (Valencia, España) u obtenidas mediante polinización manual de plantas crecidas en el invernadero. Estas semillas se germinaron in vitro para obtener plántulas de las que se usaron discos de hojas (0.5 cm2) y/o tallos (1-2 cm de longitud) como explantos primarios en los experimentos in vitro. La denominación T0 de las líneas transgénicas se refiere a plantas regeneradas de explantos infectados con Agrobacterium tumefaciens. Las plantas T1 (primera generación) se obtuvieron de semillas producidas por autopolinización o polinización cruzada de plantas T0. 2. 2. Medios de cultivo y condiciones El medio basal (BM) utilizado en los experimentos contiene sales y vitaminas MS (Murashige y Skoog, 1962), 3% de sacarosa, 0.8% de agar (Pronadisa) y un pH de 5.7. Los reguladores del crecimiento se añadieron antes del autoclavado (20 min a 120ºC, 105 Pa). Todos los antibióticos e inhibidores metabólicos se esterilizaron por filtración y fueron añadidos al medio previamente autoclavado. Si no se indica lo contrario, los cultivos in vitro se mantuvieron en cámaras de crecimiento a 25 ± 2 °C con un fotoperiodo de 16 h de luz (60 μmol.m-2.s-1 irradiancia al nivel del cultivo) proporcionado por tubos de luz blanca fluorescente Sylvania (GTE gro-lux, F36W/ GRO, Erlangen, Alemania). 2. 3. Obtención de plantas transgénicas con los genes DXR o S-Linalol sintasa Para introducir los genes DXR y S-linalol sintasa en espliego se utilizó el cocultivo con Agrobacterium tumefaciens. La cepa C58 de Agrobacterium tumefaciens que contenía el plásmido pLBI1DXR10 con el gen DXR (AF148852) de Arabidopsis thaliana fue proporcionado por el profesor Albert Boronat (Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, División III, Facultad de Química, Universidad de Barcelona) (Figura 7 del apartado “Materials and Methods”). Por otra parte, el cADN de Clarkia breweri (A.gray) Greene que contiene la secuencia codificante del gen de la S-linalol sintasa fue proporcionado por el Profesor Pichersky (Departamento de Biología Molecular, Celular y del desarrollo, Universidad de Michigan) y recibido en el plásmido pBluescript II SK (+). Antes de ser utilizado para la transformación de plantas de espliego esta secuencia tuvo que ser insertada en el plásmido pBI121, dando lugar al plásmido de 13.3 kb pBILIS (Figura 8 del apartado “Materials and Methods”), y posteriormente introducido en la cepa C58 de A. tumefaciens. 2. 4. Transformación genética de Lavandula latifolia Medicus Se siguió el protocolo descrito por Nebauer y col., (2000). Para cada experimento de transformación se utilizaron entre 300 y 500 explantos de hoja. Las plantas regeneradas se trasplantaron a macetas de 100 ml con una mezcla de turba y perlita (1/1) y tras el proceso de aclimatación fueron transferidas al invernadero. 2. 4. 3. Obtención de progenies de plantas de espliego Las progenies se obtuvieron por auto polinización o polinización cruzada manual. Se autopolinizaron plantas de las líneas transgénicas DXR y LIS. Las polinizaciones cruzadas se realizaron con líneas de espliego transgénicas para los genes DXS (Muñoz-Bertomeu y col., 2006), HMGR (Muñoz-Bertomeu y col., 2007a) y LIS mantenidas en el invernadero. La línea DXS6 se utilizó como donante de polen. Las líneas transgénicas que actuaron como receptoras fueron HMGR1, HMGR4, HMGR3, LIS1, LIS2 y LIS8. Los frutos maduros se recogieron en Octubre. Después de su aislamiento, se procedió a la germinación in vitro de las semillas. Tras 2 meses las plántulas obtenidas se cultivaron en botes con medio ½ BM y se recogieron muestras para los análisis de PCR. 4. 4. Análisis moleculares de las plantas 2. 4. 4. 1. Análisis PCR Para la extracción de ADN se utilizó el protocolo CTAB descrito por Doyle y Doyle (1990), con ligeras modificaciones. La amplificación de ADN se realizó en volúmenes de 50 μL con 75 mM Tris-HCl (pH 9.0), 50 mM KCl, 2.5 mM MgCl2, 20 mM (NH4)2SO4, 0.1 mM de cada dNTP, 0.25 mM de cada primer (ver Tabla 2 del apartado “Materials and Methods”), 50 ng de ADN y 4 U de Taq polimerasa (Biotools, España). Los parámetros de amplificación de todos los genes fueron: 3 min a 94ºC, seguido de 30 ciclos de 1 min a 94ºC, 2 min a 60ºC y 2 min a 72ºC, y finalmente 7 min a 72ºC. 2. 4. 4. 2. Southern Blot análisis El análisis Southern Blot se realizó con sondas marcadas con 11-dUTP- digoxigenina. Para la extracción de ADN se uso el protocolo CTAB descrito por Doyle y Doyle (1990), con ligeras modificaciones partiendo de una muestra de 2 g de hojas. Las endonucleasas utilizadas fueron EcoRI para los genes DXR, DXS y HMG1 y BamHI para el gen LIS. La digestión se realizó siguiendo las instrucciones del fabricante. Las muestras digeridas fueron separadas mediante electroforesis a 60 voltios en TBE 1X con 0.8% agarosa. Para transferir el ADN a las membranas, el gel se lavó con agua MilliQ, y posteriormente se incubó 40 min en 0.25 M HCl, dos veces durante 30 min en 0.5 M NaOH, 1.5 M NaCl, y dos veces durante 30 min en tampón de neutralización [0.5 M Tris-HCl (pH 8.0) + 1.5 M NaCl]. La transferencia del ADN desde el gel a la membrana de Nylon (Boehringer Mannheim) se consiguió por capilaridad durante 12-16 h usando SSC 20X como conductor. Tras la transferencia, la membrana se secó y el ADN se unió covalentemente usando radiación UV (Biolink BLX); finalmente se lavó en agua MilliQ, se secó y conservó a 4ºC. La membrana se equilibró en tampón de prehibridación y se incubó a 60ºC en tampón de hibridación con 200 ng de la sonda. Seguidamente, la membrana se lavó, se incubó con el anticuerpo, se equilibró con el tampón de detección y se añadió CSPD (1:100 de CSPD) durante 5 min. Tras este paso se secó e introdujo en una funda de plástico hasta su exposición y revelado. 2. 4. 4. 3. Northern Blot La expresión de los transgenes se determino por Northern Blot utilizando sondas de ADN marcadas con [α-32P]dCTP. La extracción del ARN se realizó siguiendo una modificación del protocolo propuesto por Tripure Isolation Reagent (Roche Applied Sciences), partiendo de 0.4 g de hojas. La electroforesis del ARN se realizó bajo condiciones desnaturalizantes en 2.2 M de formaldehido de acuerdo con Maniatis y col., (1982). La transferencia y fijación del ARN a una membrana de nylon Hybond-H (Amershan) se llevó a cabo de manera equivalente al realizado para el Southern Blot. La sonda se marcó con [α-32P]dCTP. por random printing utilizando la subunidad Klenow de la ADN polimerasa. Tras 6 horas de marcaje a temperatura ambiente, la reacción se paró añadiéndole 200 μL of 1X TE; finalmente se desnaturalizó a 95ºC durante 10 min y se mantuvo en hielo hasta su uso. La hibridación con la sonda se realizó durante 12 horas a 65ºC. Seguidamente se lavó varias veces para eliminar el exceso de sonda y finalmente la membrana se transfirió a una funda de film transparente y se colocó en una cámara oscura hasta su exposición y revelado. 2. 4. 4. 4. Western Blot La detección de la proteína codificada por el transgén DXR se realizó mediante Western Blot. El anticuerpo policlonal usado fue proporcionado por el Dr Michael H. Walter del Leibniz-Institut für Planzenbiochemie, Alemania. El extracto de proteínas se obtuvo de una muestra de 1 g de hojas homogeneizada en nitrógeno líquido. El extracto se centrifugó dos veces a 25000 rpm, 30 min y 4ºC y se resuspendió en tampón de extracción con un coctel de inhibidores de proteasas (Sigma, P-9599). La concentración de proteínas se determinó mediante recta patrón utilizando la tinción de Bradford. Finalmente los extractos se diluyeron a una concentración final igual con el tampón de extracción y tampón de carga 5X Laemmli. La electroforesis tuvo lugar a 50 voltios en un tampón de 1.92 M glicina y 1% SDS a pH 8.3 en un gel doble: el gel empaquetador (125 mM Tris-HCl, pH 6.8, SDS 0.1%, 3.3% acrilamida/bisacrilamida, 0.14% persulfato amónico y 12 mM Temed), y el de separación (375 mM Tris-HCl, pH 8.8, SDS 0.1%, 8% acrilamida/bisacrilamida, 0.066% persulfato amónico y 5.7 mM Temed). Las proteínas del gel se transfirieron a una membrana Immune-Blot de polifluoruro de vinilideno (PVDF) de BioRad usando el Mini Tran-Blot Cell (BioRad) según instrucciones del fabricante. La detección inmunológica se realizó mediante el ECL Western Blotting Analysis System kit (Amersham Biosciences) siguiendo las instrucciones del fabricante. 4. 5. Análisis fenotípico 2. 4. 5. 1. Análisis del aceite esencial con hexano como solvente El análisis de aceite esencial se realizó según lo descrito en Muñoz- Bertomeu y col., (2006 y 2008), tanto en muestras frescas de los distintos verticilos (Figura 9 del apartado “Materials and Methods”) como en muestras secas de los verticilos 4 a 10. 2. 4. 5. 1. Contenido de clorofilas y carotenoides El análisis del contenido en clorofilas y carotenoides de las hojas se llevó a cabo siguiendo el protocolo descrito en Muñoz-Bertomeu y col., (2006). 2. 5. Contribución de las rutas MVA y MEP a la biosíntesis de monoterpenos en espliego Para dilucidar la contribución relativa de las rutas MVA y MEP a la biosíntesis de terpenos en espliego se utilizaron dos aproximaciones experimentales: 1) Tratamiento con inhibidores específicos de las rutas. En estos experimentos, explantos aislados de plantas control y transgénicas, crecidas in vitro o en invernadero, fueron tratadas con MEV o FSM. También se estudió el efecto del mevalonato sobre la recuperación fenotípica de plantas tratadas con inhibidores. 2) Experimentos de marcaje con 13CO2 , [U-13C6]glucosa y [1,2-13C2]mevalonato. En estos experimentos se utilizaron plantas crecidas in vitro y en invernadero. 2. 5. 1. Efectos de MEV y FSM en espliego 2. 5. 1. 1. Ensayos de germinación Semillas de espliego, previamente esterilizadas, se cultivaron en tubos de vidrio con 15 ml de medio BM suplementado con MEV (0, 0,5, 1, 2 y 5 μM) o FSM (0, 10, 20, 30 o 40 μM). Para cada tratamiento se utilizaron 48 semillas. Tras 50 días de cultivo, se anotó el porcentaje de germinación, el número de hojas, la longitud de tallos y raíces y el contenido de clorofilas y carotenoides. Para la cuantificación de los pigmentos fotosintéticos se utilizaron 9 plántulas para cada concentración de inhibidor. 2. 5. 1. 2. Ensayos con tallos in vitro y ex vitro Para los ensayos in vitro, se utilizaron ápices con 3 verticilos (1.5 cm), aislados de plántulas control de 2 meses de edad crecidas in vitro. En un primer experimento, los explantos se cultivaron durante 45 días en medio BM suplementado con las mismas concentraciones de MEV y FSM empleadas en los ensayos de germinación. Para cada tratamiento se utilizaron 24 tallos. En un segundo experimento, se estudió si el MVA, precursor de la biosíntesis de terpenos, revierte el efecto de MEV y FSM. En este experimento, los tallos se cultivaron durante 28 días en medio BM suplementado con concentraciones crecientes de MVA (0; 0,3; 0,6; 1,2; 2,4 y 3,5 mM) sólo o en combinación con 1 μM MEV o 30 μM FSM. En el último experimento, se testó el efecto de MEV y FSM sobre plantas transgénicas de espliego. Se emplearon tallos de la línea HMGR5, que contenía 8 insertos del gen HMGR de Arabidopsis thaliana. Se cultivaron 24 explantos durante 42 días en medio BM suplementado con 1 μM MEV o 30 μM FSM. Como control se utilizaron ápices de plantas no transformadas. En todos los experimentos, los cultivos se mantuvieron en la cámara de crecimiento y se determinó la longitud de la raíz y del tallo, el número de verticilos, el peso fresco y seco de la raíz y del tallo, y el contenido en clorofilas y carotenoides. En los experimento con MVA, también se analizó el contenido en aceite esencial, utilizando el hexano como agente extractor. Los ensayos ex vitro se llevaron a cabo con tallos (5 cm de longitud y con 5 verticilos) de las líneas transgénicas de espliego HMGR, DXS, y HMGR-DXS crecidas en el invernadero. Una línea transgénica que sobreexpresa el gen nptII se empleó como control. En un primer experimento, los tallos aislados fueron colocados en macetas que contenían una mezcla 1:1 de turba y perlita. Antes de trasplantar, las bases de los tallos se sumergieron en talco que contenía 5000 ppm de IBA para inducir el enraizamiento. Tras un mes, las macetas con tallos enraizados se regados una única vez con la solución nutritiva Hoagland (Hoagland y Arnon, 1950). Al día siguiente las macetas se regaron con una solución acuosa de 1 μM MEV, 30 μM FSM o agua; este tratamiento se repitió cada dos días durante 15 días. Las plantas fueron muestreadas después de otros 15 días. En un segundo experimento, los tallos se regaron 2 veces a la semana durante 2 meses con las soluciones anteriormente indicadas. En ambos experimentos se analizó la longitud de la raíz y del tallo, el número de verticilos, el peso fresco, el peso seco, el contenido de pigmentos fotosintéticos y el aceite esencial. Se utilizaron al menos 10 tallos para cada línea y tratamiento. 2.5.2. Experimentos de marcaje El cineol y el alcanfor son los monoterpenos mayoritarios en el aceite esencial de las hojas de espliego (Muñoz-Bertomeu y col., 2006). Por esta razón, estos dos compuestos fueron seleccionados para los análisis de NMR y GC/MS en los experimentos de marcaje. Los precursores utilizados fueron 13CO2, [U-13C6]glucosa y [1,2-13C2]mevalonato. Los experimentos fueron realizados con plantas control y la línea transgénica HMGR5, crecidas in vitro o en invernadero. 2. 5. 2. 1. Experimentos de marcaje con 13CO2 Se utilizaron plantas de espliego control y transgénicas (línea HMGR5). Las plantas control procedían de semillas germinadas in vitro y las plántulas obtenidas fueron transferidas a bandejas con una mezcla de turba y perlita (7:3) y mantenidas en el invernadero en Dürnast (Weihenstephan, Technische Universität München, Alemania). Tras un mes, las plántulas se pasaron a macetas (15 cm) con el mismo sustrato y se mantuvieron en el invernadero durante 4 meses. Las plantas de la línea HMGR5 (de 3 meses de edad y aproximadamente 15 cm de altura) procedían de plantas crecidas in vitro y aclimatadas a condiciones de invernadero. Para el marcaje con 13CO2, las plantas (crecidas en maceta) se colocaron en una cámara de incubación cerrada (Biobox; GWS, Berlín, Alemania) a 25ºC e iluminada con luz blanca (Figura 10 en el apartado “Materials and Methods”). Antes del periodo de marcaje (fase de pulso), la cámara se llenó con aire sintético que contenía 700 ppm de 13CO2. Durante este periodo de pulso la concentración relativa de 13CO2 y 12CO2 fue de aproximadamente 9:1. Después las plantas se transfirieron al laboratorio y se mantuvieron en las condiciones ambientales imperantes en el mismo. Los tiempos de pulso de cada experimento se presentan en el Apéndice. El patrón de marcaje del cineol y el alcanfor se determinó mediante técnicas de NMR y/o GC/MS. Los experimento de marcaje con 13CO2, así como los análisis de NMR y GC/MS fueron realizados en el laboratorio del Dr. Wolfgang Eisenreich en la the Technische Universität München, Departamento de Química (Garching, München). 2. 5. 2. 2. Experimentos de marcaje con [U-13C6]glucosa En una primera serie de experimentos, se utilizaron plantas de espliego crecidas in vitro, tanto en medio líquido como sólido. Para los experimentos en medio sólido, plántulas procedentes de semillas germinadas in vitro fueron cultivadas en botes de 200 ml (58 mm de diámetro, 92,5 de altura) con 20 ml de medio BM estéril (Sigma-Aldrich) con 30g/L de sacarosa, 7,5 g/L de agar (Sigma) y 2 g/L de [U-13C6]glucosa y pH 5,7. Se sembraron 4 plántulas por bote y se prepararon un total de 80 botes. Los botes se incubaron en una cámara de crecimiento a 25ºC con un fotoperiodo de 16h. Tras 55 días, las plántulas se recogieron, se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenaron a -20ºC hasta su uso. Para los experimentos en medio líquido, las plántulas se colocaron en matraces de 100 ml (10 por matraz) con 30 ml de medio estéril (Medio BM con 30 g/L de sacarosa, y 2 g/L de [U-13C6]glucosa). Los cultivos se incubaron en una agitador (100 rpm) a 25ºC, con un fotoperiodo de 16 h. Tras 15 días de cultivo, las plántulas se trasfirieron a un nuevo matraz con medio fresco (100 ml) y se mantuvieron en las mismas condiciones durante otros 15 días. Tras 55 días, las plántulas enteras se recogieron, se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenaron a -20ºC hasta su uso. En un segundo experimento, tallos de espliego (1,5 cm de longitud) procedente de plántulas crecidas in vitro (control y línea transgénica HMGR5) se cultivaron en botes de 200 ml que contenían medio BM estéril con 30g/L de sacarosa, 7,5 g/L de agar (Sigma) y 2 g/L de [U-13C6]glucosa y pH 5,7. Se prepararon al menos 25 botes por línea con 4 tallos cada uno. Tras 7, 14, 21 y 28 días se anotó la longitud del tallo y número de verticilos. En cada uno de esos periodos se recogieron las plántulas de 5 botes y se almacenaron a -80ºC hasta la extracción del aceite esencial. Previamente se anotó el peso, número de raíces y longitud de la raíz. 2. 5. 2. 2. Experimentos de marcaje con [1,2-13C2]mevalonato Tallos de 1 cm de longitud, aislados de plántulas procedentes de semillas germinadas in vitro, fueron cultivados en botes de 200 ml con 20 ml medio BM estéril con 30 g/L de sacarosa, 7.5 g/L de agar (Sigma) y 2 g/L de [1,2-13C2]mevalonato. Se prepararon al menos 25 botes con 4 tallos cada uno. Tras 7, 14, 21 y 28 días se anotó la longitud del tallo y número de verticilos. En cada uno de esos periodos se recogieron las plántulas de 5 botes y se almacenaron a -80ºC hasta la extracción del aceite esencial. Previamente se anotó el peso, número de raíces y longitud de la raíz. 2. 5. 2. 4. Extracción del aceite esencial Dependiendo del método analítico (GC/MS o 13C NMR), se utilizaron dos métodos de extracción diferentes. Para los análisis GC/MS, muestras de entre 100- 200 mg se introdujeron en tubos de vidrio de 10 ml con 2 ml de cloroformo-d (CDCl3). Después de una suave agitación, los tubos se mantuvieron a temperatura ambiente durante 15 min, se añadió una punta de sulfato de sodio anhidro y se dejo reposar una hora. Finalmente, 1 ml del extracto en cloroformo se traspasó a un vial de 1,5 ml para su medida en el GC/MS. Para los análisis 13C NMR, el material vegetal (600-1000 mg) se separó en 3 tubos de vidrio. Se añadieron 2 ml de cloroformo deuterado (CDCl3) al primer tubo, se agitó suavemente y se mantuvo a temperatura ambiente durante 15 min. Después, el extracto clorofórmico se transfirió al segundo tubo y se repitió el proceso, transfiriéndose el extracto al tercer tubo. Seguidamente, se añadió una punta de sulfato de sodio anhidro y se dejó reposar 1 hora. Finalmente 0,6 ml del extracto clorofórmico se traspasaron a un tubo de NMR para los análisis de 1H y 13C. 2. 5. 2. 5. Medidas GC/MS El cromatografo de gases (GC-17A y GC-2010), espectrómetro de masas (QP-5000 y GCMS-QP 2010 Plus), auto-inyector (AOC-20i) y software (Class 5000 y GCMSsolution) utilizados para estas medidas fueron adquiridos a Shimadzu (Duisburg, Alemania). Se empleó una columna capilar de sílice Equity TM-5 (30 m x 0,25 mm x 0,25 μm de grueso) de Supelco Inc. (Bellefonte, PA, USA). La temperatura del inyector y de la interface fueron de 230ºC y 250ºC respectivamente. Los ajustes de temperatura del horno fueron: 70ºC por 2 min, una rampa de 70-90ºC de 2ºC/min, 90-130 ºC con 5ºC/min y finalmente 250ºC por un min. EL programa de presión empezó a 76,1kPa con una velocidad lineal de 40,0 cm/sec. El control de flujo utilizado fue el de velocidad lineal. El flujo total fue de 16,1 ml/min mientras que el flujo de la columna permaneció a 1,19 ml/min. El ratio del Split fue de 1:10. Los voltios del detector fueron de aproximadamente 0,8 keV. El solvent cut se ajustó a 4 min y la velocidad de sampling fue de 0,15 sec. La anchura del escaneo se fijó en 0,1 u. Cada muestra se analizó tres veces en modo SIM (monitorización de un único ión). Las intensidades relativas de los estándares (alcanfor y cineol) y las muestras obtenidas del análisis GC/MS (integración de picos) se procesaron siguiendo publicaciones previas (Lee y col., 1999; Pickup y McPherson 1976; Braumann 1966; y Korzekwa, 1990). Esta evaluación resulta en el exceso molar de los isotopólogos de carbono de cineol y alcanfor únicamente debidos al enriquecimiento producido por el precursor 13C. 2. 5. 2. 6. Medidas NMR Para los espectros de 1H se usó un Avance I 500 (UltraShield 500 MHz, SEI 500 S2 (5 mm, inverso con gradiente Z), Autosampler B-ACS 60) y un software TopSpin 2.1, de Bruker Instruments (Karlsruhe, Alemania). Para los espectros 3C se utilizaron un Avance DXR 500 (Cryomagnet BZH 500 MHz, Autosampler B-ACS 60), o un Advance III 500 system con imán UltraShield PLUS 500 MHz y una cabeza de congelación para muestras (5 mm CPQNP, 1H/13C/31P/19F/ 29Si (Z-gradient), Autosampler B-ACS 120) de Bruker Instruments. El software instalado fue XwinNMR 3.1 y TopSpin 3.0, respectivamente (ambos de Bruker Instruments). Las medidas se realizaron en campos magnéticos de 11,5 Tesla. Las frecuencias de resonancia de 1H y 13C fueron de 500,13 MHz y 125,77 MHz respectivamente y la temperatura fue de 300 ºK. El análisis de los datos se realizó con el software de MestReNova Software (Mestrelab Research, Santiago de Compostela, España), TOPSPIN o XWIN NMR. Los espectros unidimensionales de 1H y 13C y los de dos dimensiones COSY, HSQC, HSQC-DEPTeditado, HSQC-TOCSY, NOESY (con 1 sec de mezcla), TOCSY (con 60 ms de mezclado) y HMBC fueron medidos siguiendo los sets de parámetros estándar de Brucker. 2. 6. Análisis estadístico La significación de la variación en los parámetros fenotípicos entre los grupos control y los transgénicos, así como de los efectos de los distintos tratamientos se determinó mediante análisis de la varianza (ANOVA, SPSS 19 versión for Windows, SPSS Inc.). Las diferencias significativas entre medias se determinaron usando el test de Tukey (1953). Así mismo, y cuando se consideró apropiado se calcularon las desviaciones estándar (SD) y los errores estándar de la media (SE). La herencia de los transgenes se analizó mediante un análisis de chi-cuadrado con corrección de Yates (Zar, 1996). Conclusiones 3.1 Sobreexpresión del gen DXR en plantas transgénicas de Lavandula latifolia - Se han obtenido plantas transgénicas (T0) de espliego que sobreexpresan el gen DXR de Arabidopsis thaliana que codifica la segunda enzima de la ruta MEP. Así mismo y por autopolinización controlada de las líneas T0, que florecieron tras varios años en el invernadero, se han obtenido progenies T1 de dos de las líneas. - Una de las líneas transgénicas T0 (línea DXR2) acumula significativamente más aceite esencial que los controles en las hojas más jóvenes. No obstante, el incremento en aceite esencial es menor que el observado en la línea DXS6, obtenida anteriormente en nuestro laboratorio, y que sobreexpresa el gen DXS, que codifica la primera enzima de la ruta MEP. - El contenido en clorofila total y carotenoides en las plantas T0 aumenta significativamente en las hojas más jóvenes en todas las líneas transgénicas en comparación a los controles, excepto en la línea DXR4 que no muestra diferencias y en la línea DXR5 que es menor. - Todas las plantas transgénicas presentan un fenotipo visual idéntico al de los controles en términos de morfología, a excepción de la línea DXR1, que presenta características juveniles. - Nuestros resultados sugieren que en el espliego la enzima DXR juega un papel menos relevante que la enzima DXS en el control de la biosíntesis de precursores de los monoterpenos a través de la ruta MEP. 2 Sobreexpresión del gen LIS en plantas transgénicas de Lavandula latifolia - Se han obtenido plantas transgénicas (T0) de espliego que sobreexpresan el gen LIS de Clarkia breweri que codifica la enzima linalol sintasa, responsable de la formación de linalol. Así mismo, y por autopolinización controlada de las líneas T0, que florecieron tras varios años en el invernadero, se han obtenido progenies T1 de varias de dichas líneas. - Los análisis de hojas de las plantas T0 recogidas en distintos estados de desarrollo muestran que las hojas más jóvenes, tanto de plantas transgénicas como control, acumulan más linalol que las hojas maduras. Además, en las plantas transgénicas, estas hojas acumulan más linalol que las plantas control, lo que se correlaciona con los mayores niveles de transcritos del gen LIS. - El fenotipo de contenido elevado en linalol observado en las hojas más jóvenes, se mantiene en las progenies T1 que heredan el transgén LIS. 3 Sobreexpresión simultanea de genes que codifican enzimas de la ruta de biosíntesis de terpenos en plantas transgénicas Lavandula latifolia - La polinización cruzada de plantas transgénicas de espliego ha permitido la obtención de doble transgénicas que co-expresan los genes DXS-HMGR y DXS-LIS. - Las plantas doble transgénicas DXS-LIS tienen un contenido inferior de aceite esencial que la planta T0 DXS6 de la que descienden. El contenido del monoterpeno linalol es también inferior, posiblemente debido a efectos de co-supresión ligados a las estructuras de las construcciones utilizadas. 4 Contribución de las rutas MVA y MEP a la síntesis de monoterpenos en espliego - La mevinolina (1 µM) afecta negativamente a la germinación y reduce el desarrollo de las plántulas de espliego. Por el contrario, no altera el contenido en pigmentos fotosintéticos y aceite esencial en hojas maduras. - La fosmidomicina (30 µM) no reduce la germinación pero afecta negativamente el desarrollo de la parte aérea de las plantas de espliego. Además, disminuye significativamente el contenido de pigmentos fotosintéticos y aceite esencial, especialmente en las hojas más jóvenes. - Concentraciones elevadas de mevalonato (3.5 mM) inhiben el desarrollo de tallos y raíces de espliego. Estas concentraciones también disminuyen el contenido en aceite esencial aunque incrementan el de pigmentos fotosintéticos en hojas jóvenes. Dependiendo de la concentración empleada, el mevalonato atenúa los efectos tóxicos de la fosmidomicina o revierte los de la mevinolina. - Los tallos de las plantas transgénicas línea HMGR5 y dobles transgénicas DXS-HMGR presentan mayor tolerancia que los controles al tratamiento con 30 µM de fosmidomicina, especialmente en relación a su contenido en pigmentos fotosintéticos. - El enriquecimiento del medio de cultivo con 13C-mevalonato no incrementa el porcentaje en 13C de los monoterpenos cineol y alcanfor, aunque promueve un aumento del contenido de estos dos monoterpenos, lo que sugiere una activación de la ruta MEP a otro nivel. - El marcaje con [U-13C6]-Glucosa en plantas crecidas durante 55 días in vitro en medio sólido, produce porcentajes de exceso de abundancia de 13C de 4,8 a 6,5 y de 5,3 a 6,1 para cineol y alcanfor, respectivamente. Los ratios M+2/M+3 y M+2/[(M+2) + (M+3)] obtenidos son superiores a los esperados si la síntesis de cineol y alcanfor fuera realizada exclusivamente a través de la ruta MEP. Después de 28 días de cultivo in vitro en medio sólido, el marcaje en tallos cultivados con [U-13C6]-Glucosa produce porcentajes de exceso de abundancia de 13C de 1,10 y 1,35 para cineol y alcanfor respectivamente en los controles, y de 1,53 y 1,63 para cineol y alcanfor, respectivamente, en la línea transgénica HMGR5. Los ratios M+2/M+3 y M+2/[(M+2) + (M+3)] de la línea HMGR5 fueron superiores a los de la línea control para ambos monoterpenos. Estos datos apoyan la existencia de una interconexión entre las rutas MEP y MVA, sugiriendo que los precursores derivados de la ruta MVA contribuyen a la síntesis de alcanfor y 1,8-cineol en Lavandula latifolia. - El marcaje con [U-13C6]-Glucosa en plántulas cultivadas durante 30 días en medio liquido produce porcentajes de exceso de abundancia de 13C de 10,6 y de 13,3 para cineol y alcanfor respectivamente. Los ratios M+2/M+3 y M+2/[(M+2) + (M+3)] obtenidos son exactamente los esperados en el caso de que la síntesis de cineol y alcanfor fuera realizada exclusivamente a través de la ruta MEP, lo que indica que en estas condiciones la síntesis de monoterpenos se realiza exclusivamente a través de esta ruta. - El periodo óptimo de marcaje con 13CO2 para conseguir incorporaciones significativas de 13C en cineol y alcanfor en plantas de Lavandula latifolia debe ser superior a 5 horas. Así mismo, la incorporación de 13C es genotipo dependiente, existiendo grandes diferencias de incorporación entre distintas plantas en las mismas condiciones. Los ratios M+2/M+3 y M+2/[(M+2) + (M+3)] obtenidos en plantas control son muy parecidos a los esperados en el caso de que la síntesis de cineol y alcanfor fuera realizada exclusivamente a través de la ruta MEP, lo que apunta a una contribución muy pequeña de la ruta MVA en la biosíntesis de estos monoterpenos en plantas cultivadas ex vitro. - El análisis por RMN del aceite esencial de las hojas de plantas control de Lavandula latifolia confirma que sus componentes mayoritarios, los monoterpenos cineol y alcanfor, se sintetizan principalmente a partir de precursores procedentes de la ruta MEP. No obstante, el marcaje con 13CO2 de plantas transgénica HMGR5 producen ratios M+2/M+3 y M+2/[(M+2) + (M+3)] para cineol y alcanfor superiores a los de la línea control en un tercio de las plantas estudiadas. Estos datos apoyan la existencia de una interconexión entre las vías MEP y MVA en Lavandula latifolia.