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Toujani, Walid
Ros Palau, Roc (dir.); Muñoz Bertomeu, Jesús (dir.) Departament de Biologia Vegetal |
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Aquest document és un/a tesi, creat/da en: 2013 | |
Plant primary metabolism is a complex process where many interacting
pathways must be finely coordinated and integrated in order to achieve proper plant
development and acclimation to the environment. An example of such complexity
is the biosynthesis of the amino acid L- serine which takes place in at least two
different organelles and by different pathways. In spite of the crucial role of serine
in plants, the biological significance of the coexistence of several biosynthetic
pathways, and also how they interact to maintain amino acid homeostasis in cells is
not yet understood. Three different serine biosynthesis pathways have been
described in plants: The glycolate pathway associated with photorespiration, and
two others non fotorespiratory pathways denominated glycerate pathway and
phosphorylated pathway. The phosphorylated pathway of serine biosynthesis
(PPSB) has been po...
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Plant primary metabolism is a complex process where many interacting
pathways must be finely coordinated and integrated in order to achieve proper plant
development and acclimation to the environment. An example of such complexity
is the biosynthesis of the amino acid L- serine which takes place in at least two
different organelles and by different pathways. In spite of the crucial role of serine
in plants, the biological significance of the coexistence of several biosynthetic
pathways, and also how they interact to maintain amino acid homeostasis in cells is
not yet understood. Three different serine biosynthesis pathways have been
described in plants: The glycolate pathway associated with photorespiration, and
two others non fotorespiratory pathways denominated glycerate pathway and
phosphorylated pathway. The phosphorylated pathway of serine biosynthesis
(PPSB) has been poorly studied, probably because it was considered of minor
importance compared to the glycolate pathway.
The main objective of this thesis is to elucidate the role of PPSB in plants,
using Arabidopsis thaliana as a model. Specifically, the functional characterization
of genes coding for the first enzyme of the PPSB, 3-phosphoglycerate
dehydrogenase (PGDH) has been elucidated. We have identified three genes
coding for putative PGDHs named PGDH, 3-PGDH and EDA9 (Embryo Sac
Developmenal Arrest9) respectively. While PGDH have already been cloned and
biochemically characterized, 3-PGDH and EDA9 have not been studied to date. 3-
PGDH and EDA9 have a high percentage of amino acid identity as compared to
PGDH. Therefore they were grouped within a gen family called “PGDH family”.
All three genes displayed a different expression pattern indicating that they are not
functionally redundant. The mutants of PGDH and 3-PGDH presented no drastic
visual phenotypes, but the mutant eda9.1eda9.1 is lethal showing delayed embryo
development that led to aborted embryos. The embryo-lethal phenotype of the
mutant eda9.1eda9.1 was complemented with EDA9 cDNA under the control of
35S promoter (Pro35S:EDA9) and its own promoter (ProEDA9:EDA9). However,the construct that carries the 35S promoter, which is poorly expressed in the anther
tapetum, did not complement mutant fertility. Microspore development in
eda9.1eda9.1 Pro35S:EDA9 was arrested at the polarized stage. Pollen from these
lines lacked tryphine in the interstices of the exine, the extern layer of pollen grain,
and displayed shrunken and collapsed forms that were unable to germinate when
cultured in vitro. A metabolomic analysis of PGDH mutant and overexpressing
plants revealed that all three PGDH family genes can regulate serine homeostasis,
with PGDH being quantitatively the most important in the process of serine
biosynthesis at the whole plant. By contrast, the essential role of EDA9 could be
related to its expression in very specific cell types. In this thesis, we evidence the
crucial role of EDA9 in embryo and pollen development, suggesting that the PPSB
is an important link connecting primary metabolism with development.El metabolismo primario de las plantas es un proceso complejo, en el que
las vías que participan deben estar perfectamente coordinadas e integradas con el
fin de lograr el desarrollo adecuado de las plantas y su aclimatación al medio
ambiente. Un ejemplo de tal complejidad es la biosíntesis del aminoácido L- serina,
que se lleva a cabo en al menos dos orgánulos diferentes y por rutas distintas. A
pesar del papel crucial de la serina en las plantas, no se conoce cuál es la
importancia biológica de la coexistencia de varias rutas biosintéticas; tampoco se
conoce cómo interactúan estas rutas para mantener la homeostasis de dicho
aminoácido en las células. Se han descrito tres rutas diferentes de biosíntesis de
serina en las plantas: la ruta del glicolato, asociada a la fotorrespiración, y dos rutas
no fotorrespiratorias denominadas ruta del glicerato y ruta fosforilativa. La ruta
fosforilativa de biosíntesis de serina (RFBS) se ha estudiado relativamente poco,
probablemente debido a que se consideró de menor importancia en comparación
con la ruta del glicolato.
El objetivo principal de esta tesis doctoral ha sido contribuir a dilucidar el
papel de la RFBS en las plantas, utilizando como modelo Arabidopsis thaliana.
Específicamente se ha procedido a la caracterización funcional de genes que
codifican para la 3-fosfoglicerato deshidrogenasa (PGDH), primera enzima de la
RFBS. Se han identificado tres genes que podrían codificar para la enzima PGDH,
denominados PGDH, 3-PGDH y EDA9 (Embryo Sac Developmenal Arrest9).
Mientras que PGDH ya había sido clonado y la enzima que codifica caracterizada
bioquímicamente, 3-PGDH y EDA9 no habían sido estudiados hasta la fecha. A
nivel de su secuencia aminoacídica, 3-PGDH y EDA9 presentan un alto porcentaje
de identidad con PGDH, por lo que se les agrupó dentro de una familia génica que
denominamos “familia PGDH”. Los tres genes mostraron un patrón de expresión
diferente, indicando que no son funcionalmente redundantes. Los mutantes de los
genes PGDH y 3-PGDH no presentan fenotipos visuales drásticos, pero el mutante
eda9.1eda9.1 es letal, mostrando un retraso en el desarrollo embrionario que conduce al aborto de los embriones. El fenotipo de letalidad del embrión del
mutante eda9.1eda9.1 se complementó con el cDNA del gen EDA9 bajo el control
del promotor 35S (Pro35S:EDA9) y de su propio promotor (ProEDA9:EDA9). Sin
embargo, la construcción que lleva el promotor 35S, que muestra baja expresión en
el tapete de las anteras, no complementó la fertilidad del mutante. El desarrollo de
las microsporas en eda9.1eda9.1 Pro35S:EDA9 se detiene en la etapa de
microspora polarizada. El polen de estas líneas carece de trifina en los intersticios
de la exina, la capa más externa del grano de polen, mostrando formas colapsadas y
deformadas que no fueron capaces de germinar cuando se cultivaron in vitro. Un
análisis metabolómico de los mutantes de la familia PGDH y de las líneas que
sobreexpresan estos genes, reveló que los tres genes de la familia pueden regular la
homeostasis de la serina, siendo PGDH el más importante cuantitativamente en el
proceso de biosíntesis de serina en toda la planta. Por el contrario, el papel esencial
de EDA9 podría estar relacionado con su expresión en tipos celulares muy
específicos. En esta tesis, ponemos de manifiesto el papel crucial de EDA9 en el
desarrollo del embrión y del polen, lo que sugiere que la RFBS es un importante
nexo de unión entre el metabolismo primario y el desarrollo.
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