NAGIOS: RODERIC FUNCIONANDO

Identificación y caracterización de factores implicados en la biogénesis de la RNA polimerasa II en Saccharomyces cerevisiae

Repositori DSpace/Manakin

IMPORTANT: Aquest repositori està en una versió antiga des del 3/12/2023. La nova instal.lació está en https://roderic.uv.es/

Identificación y caracterización de factores implicados en la biogénesis de la RNA polimerasa II en Saccharomyces cerevisiae

dc.contributor.advisor	Estruch Ros, Francisco
dc.contributor.author	Gómez Navarro, Natalia
dc.contributor.other	Departament de Bioquímica i Biologia Molecular	es_ES
dc.date.accessioned	2014-02-18T08:13:08Z
dc.date.available	2015-02-19T04:45:05Z
dc.date.issued	2014
dc.date.submitted	21-02-2014	es_ES
dc.identifier.uri	http://hdl.handle.net/10550/33007
dc.description.abstract	INTRODUCCIÓN La transcripción es el proceso de síntesis enzimática de un RNA a partir de una secuencia complementaria de DNA. En eucariotas, la transcripción de los genes que codifican proteínas la lleva a cabo la RNA polimerasa II (RNA pol II), junto con una gran cantidad de factores auxiliares que participan en el proceso actuando a diferentes niveles. Para que la RNA pol II inicie la transcripción se requiere la formación del complejo pre-inicio (PIC). Uno de los pasos clave en la regulación del inicio de la transcripción es la formación del PIC. En este proceso se ha visto implicado el regulador transcripcional NC2 (cofactor negativo 2), que actúa bloqueando el ensamblaje del PIC. Además de la regulación asociada al inicio de la transcripción, los mecanismos implicados en elongación proporcionan una posibilidad más de regulación. Distintas evidencias sugieren que la elongación transcripcional, en lugar de ser un proceso continuo, incluye frecuentes pausas, paradas y en algunos casos atascos irreversibles de la polimerasa. Uno de los mecanismos por los que la polimerasa es rescatada de este estado y se reactiva la transcripción lo lleva acabo el factor de elongación TFIIS o Dst1p en levadura, que induce el corte endonucleolítico del mRNA naciente permitiendo la reactivación de la RNAPII. En el caso que este obstáculo no se pueda superar y como último recurso entra en juego el proceso de ubiquitinación que tiene como resultado la degradación de la subunidad mayor de la RNA pol II, Rpb1p. En organismos eucariotas, la RNA polimerasa II es una enzima que se encarga de la síntesis de RNAs mensajeros y distintos tipos de RNAs no codificantes. Se trata de una enzima compuesta por 12 subunidades altamente conservadas entre los eucariotas, cuya estructura ha sido bien caracterizada (Cramer et al, 2008). A pesar de que se posee un conocimiento detallado de los aspectos estructurales y funcionales de las RNA polimerasas en general, y de la RNA pol II en particular, aún queda mucho por aprender sobre el "ciclo de vida" de estas máquinas celulares complejas. Debido a la elevada similitud estructural entre las RNA polimerasas bacterianas y las eucariotas (Cramer et al., 2001) y puesto que las subunidades Rpb1, 2, 3, 11 y 6 son homólogas a las subunidades bacterianas β’, β, α, α y ω, respectivamente, se ha propuesto un modelo de ensamblaje de la RNA pol II análogo al existente en procariotas (Wild y Cramer, 2012). En la biogénesis de las RNA polimerasas eucariotas intervienen además de las subunidades que forman la enzima madura, otras proteínas. Mediante la purificación de intermediarios de ensamblaje de la RNA pol II se han identificado varios factores que interaccionan específicamente con estos subcomplejos. Estos factores pueden jugar un papel en una o más fases del ciclo de vida de la RNA pol II, como el ensamblaje y/o transporte al núcleo (Boulon et al., 2010; Forget et al., 2010). En dos trabajos en los que se realizó la caracterización sistemática de complejos proteicos en levadura utilizando la purificación por afinidad en tándem se identificaron interacciones entre Iwr1p y las subunidades de la RNA polimerasa II. Esta proteína, además había sido identificada en nuestro grupo en una búsqueda de supresores genéticos del defecto de crecimiento producido por la depleción del represor de transcripción NC2 (Peiró-Chova et al, 2007). También conocemos que Iwr1p interacciona genéticamente con componentes de la maquinaría transcripcional básica y juega un papel importante en la transcripción basal y regulada (Peiró-Chova et al, 2009). Y más recientemente se ha descrito a Iwr1p como una proteína implicada en la importación nuclear de la RNA polimerasa II. Dicha proteína se une la RNA polimerasa cuando esta completamente ensamblada en el citoplasma y la dirige a el núcleo celular utilizando su señal de localización nuclear (NLS) a través de la vía clásica de importación dependiente de la importina α. Una vez en el núcleo Iwr1p se libera de la RNA polimerasa II y regresa al citoplasma gracias a su secuencia de exportación nuclear (NES) mediante la exportina Xpo1p (Czeko et al, 2011). En la presente tesis se plantearon los siguientes objetivos: 1. La identificación y caracterización del gen RTP1, uno de los genes cuya mutación suprime los defectos en crecimiento causados por la ausencia de NC2. 2. El estudio detallado de la función de la proteína Rtp1p en la biogénesis de la RNA pol II. 3. La determinación de las distintas vías para la importación nuclear de la RNA pol II. 4. El estudio de la función nuclear de Iwr1p. 5. Establecer los efectos transcriptómicos de la deleción de IWR1 y RTP1. 6. La identificación, mediante estudios proteómicos, de nuevos factores que podrían estar implicados en la biogénesis de la RNA pol II. RESULTADOS Rtp1p es una proteína tipo carioferina requerida para la biogénesis de la RNA pol II Con el objetivo de identificar interacciones genéticas que contribuyan a la caracterización funcional de NC2, nuestro grupo realizó un rastreo genético en busca de mutaciones supresoras del requerimiento de NC2 para el crecimiento celular. Entre los alelos supresores identificados se encontró el gen YMR185w que hemos renombrado RTP1 (Required for nuclear transport of RNA pol II). Puesto que la estructura por homología de Rtp1p apunta hacia una proteína tipo carioferina, se llevó a cabo el estudio de la interacción de Rtp1p con las proteínas nucleoporinas, presentes en el poro nuclear, Nup100p y Nup116p. Detectamos interacción tanto en condiciones in vivo como in vitro. Así pues, se estudió la localización celular de la RNA pol II en el mutante rtp1 y se vio que distintas subunidades de la polimerasa se encontraban en el citoplasma mientras en el silvestre su localización es totalmente nuclear. El defecto observado fue específico de la RNA pol II puesto que la localización de la RNA pol I y la RNA pol III no se vio afectada. También se llevó a cabo el estudio de las interacciones entre Rtp1p y las distintas subunidades de la RNA pol II. El patrón de interacciones nos muestra una interacción no estequiométrica de Rtp1p con las distintas subunidades de la RNA pol II, siendo la interacción predominante con la región N-terminal de Rpb2p. Para ir más allá en la caracterización de la proteína Rtp1p procedimos a identificar proteínas que se unían a ella por purificación de afinidad y espectrometría de masas. Detectamos varias interacciones interesantes, entre ellas la interacción con Rpb2 y con tres de los componentes del tetrámero R2TP. El complejo R2TP ha sido implicado en distintos procesos celulares, incluyendo el ensamblaje de la RNA pol II (Kakihara et al, 2012) por tanto, esta interacción de Rtp1p con componentes del complejo R2TP refuerza el papel de esta proteína en la biogénesis de la RNA pol II. También observamos que la deleción de componentes de R2TP afecta a la localización celular de la RNA pol II. Distintas vías para la importación nuclear de la RNA pol II Estudios recientes proponen que la RNA pol II debe ensamblarse en el citoplasma para posteriormente ser importada al núcleo (Boulon et al., 2010; Czeko et al., 2011). En cambio, otro trabajo muestra diferencias en la importación entre subunidades grandes y pequeñas de la RNA pol II (Forget et al., 2010). En este capítulo se estudia si existen diferencias en la importación al núcleo entre las subunidades grandes (Rpb1p y Rpb2p) y pequeñas (tomando, principalmente, como ejemplo la subunidad Rpb3p). Para ello se ha analizado la distribución de las diferentes subunidades cuando la importación y/o el ensamblaje de la RNA pol II se ve comprometido por mutaciones o drogas que interfieren en dichos procesos. Se ha observado que la localización celular de las subunidades grandes y pequeñas resulta afectada de forma distinta por mutaciones o compuestos que alteran el ensamblaje y/o la importación de la enzima. Este comportamiento diferencial sugiere la existencia de mecanismos de transporte al núcleo, independientes de Iwr1p, que permiten una importación nuclear efectiva de las subunidades pequeñas y, en menor medida, de las subunidades grandes. Estudio de la función nuclear de Iwr1p Como se ha mencionado, Iwr1p se identificó como una proteína que interacciona con distintas subunidades de la RNA pol II (Krogan et al., 2006) y que resulta necesaria para el transporte de ésta, una vez su ensamblaje ha tenido lugar en el citoplasma (Czeko et al., 2011). Además de con la RNA pol II, también se han descrito interacciones entre Iwr1p y los factores de elongación transcripcional Dst1p y Spt5p (Krogan et al., 2006), que actúan en una etapa del ciclo de transcripción en la que, según el modelo de Czeko y col., Iwr1p habría dejado de interaccionar con la RNA pol II. En nuestro trabajo hemos descrito una serie de interacciones genéticas entre IWR1 y genes implicados en la elongación transcripcional y en la estabilidad de la RNA pol II. En este capítulo se han realizado estudios de interacciones genéticas con factores de elongación, estudios de la distribución de la RNA pol II en el mutante iwr1 y estudios de estabilidad de Rpb1p. Nuestros resultados sugieren una función de Iwr1p adicional a la que desempeña en el transporte del holoenzima al núcleo y relacionada con la elongación transcripcional. La función nuclear de Iwr1p podría estar relacionada con la liberación la RNA pol II detenida en la cromatina durante la elongación transcripcional. Estudios transcriptómicos de la deleción de IWR1 y RTP1 Para profundizar en la caracterización funcional del gen RTP1 se analizaron los efectos transcripcionales que suponen la ausencia del mismo. Además, dado que nuestros resultados apuntan a que la proteína Rtp1p es necesaria para la correcta localización nuclear de la RNA pol II, se compararon los efectos causados por la ausencia de Rtp1p en los niveles de transcritos con los provocados por la deleción de Iwr1p, otro factor necesario para la importación de la RNA pol II. Nuestro objetivo es determinar si existe un perfil transcriptómico común en aquellos mutantes en los que cabe esperar una reducción en la cantidad nuclear de la RNA pol II, independientemente de si las funciones mutadas actúan en el ensamblaje o en la importación de la enzima. Los efectos transcripcionales causados por la ausencia de Rtp1p e Iwr1p indican que un nivel reducido de RNA polimerasa II en el núcleo da lugar a una transcripción preferente de genes implicados en la respiración y en la utilización de aminoácidos, a la vez que se reprimen los genes implicados en la síntesis de NAD. Este patrón de expresión podría actuar como mecanismo de resistencia para incrementar la supervivencia de la célula en condiciones nutricionales adversas. Estudios proteómicos para la identificación de nuevos factores implicados en la biogénesis de la RNA pol II De acuerdo a nuestras observaciones, la depleción de cualquier subunidad de la RNA pol II provoca un ensamblaje citoplasmático deficiente del holoenzima. En estas circunstancias disponemos de un procedimiento relativamente sencillo para incrementar la concentración de los complejos intermediarios que aparecen durante el ensamblaje, e identificar así aquellas proteínas que, sin estar presentes en el holoenzima maduro, podrían tener una función durante el ensamblaje del mismo. Para ello se realizaron distintas purificaciones de complejos intermediarios de ensamblaje en condiciones en las que se había restringido el ensamblaje del holoenzima por la depleción de alguna subunidad de la RNA pol II, y se procedió a identificar las proteínas presentes en dicho intermediario. Los análisis proteómicos en condiciones de ensamblaje defectuoso de la RNA pol II han permitido identificar, de manera preliminar, una serie de factores que podrían participar en el ensamblaje o en el acoplamiento del ensamblaje de la RNA pol II con otros procesos celulares. BIBLIOGRAFÍA Boulon, S., Pradet-Balade, B., Verheggen, C., Molle, D., Boireau, S., Georgieva, M., Azzag, K., Robert, M.-C., Ahmad, Y., Neel, H., et al. (2010). HSP90 and Its R2TP/Prefoldin-like Cochaperone Are Involved in the Cytoplasmic Assembly of RNA Polymerase II. Molecular Cell 39, 912–924. Cramer, P., Armache, K.-J., Baumli, S., Benkert, S., Brueckner, F., Buchen, C., Damsma, G.E., Dengl, S., Geiger, S.R., Jasiak, A.J., et al. (2008). Structure of eukaryotic RNA polymerases. Annu Rev Biophys 37, 337–352. Cramer, P., Bushnell, D.A. and Kornberg, R.D. (2001). Structural basis of transcription: RNA polymerase II at 2.8 angstrom resolution. Science 292, 1863–1876. Czeko, E., Seizl, M., Augsberger, C., Mielke, T. and Cramer, P. (2011). Iwr1 directs RNA polymerase II nuclear import. Molecular Cell 42, 261–266. Forget, D., Lacombe, A.-A., Cloutier, P., Al-Khoury, R., Bouchard, A., Lavallée-Adam, M., Faubert, D., Jeronimo, C., Blanchette, M. and Coulombe, B. (2010). The protein interaction network of the human transcription machinery reveals a role for the conserved GTPase RPAP4/GPN1 and microtubule assembly in nuclear import and biogenesis of RNA polymerase II. Mol. Cell Proteomics 9, 2827–2839. Kakihara, Y. and Houry, W.A. (2012). The R2TP complex: discovery and functions. Biochim. Biophys. Acta 1823, 101–107. Krogan, N.J., Cagney, G., Yu, H., Zhong, G., Guo, X., Ignatchenko, A., Li, J., Pu, S., Datta, N., Tikuisis, A.P., et al. (2006). Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature 440, 637–643. Peiró-Chova, L. and Estruch, F. (2007). Specific defects in different transcription complexes compensate for the requirement of the negative cofactor 2 repressor in Saccharomyces cerevisiae. Genetics 176, 125–138. Peiró-Chova, L. and Estruch, F. (2009). The yeast RNA polymerase II-associated factor Iwr1p is involved in the basal and regulated transcription of specific genes. J. Biol. Chem. 284, 28958–28967. Wild, T.T. and Cramer, P.P. (2012). Biogenesis of multisubunit RNA polymerases. Trends Biochem Sci 37, 99–105.	es_ES
dc.format.extent	226	es_ES
dc.language.iso	es	es_ES
dc.subject	Rtp1	es_ES
dc.subject	Levadura	es_ES
dc.subject	RNA polimerasa II	es_ES
dc.subject	Iwr1	es_ES
dc.subject	Transcripción	es_ES
dc.title	Identificación y caracterización de factores implicados en la biogénesis de la RNA polimerasa II en Saccharomyces cerevisiae	es_ES
dc.type	doctoral thesis	es_ES
dc.subject.unesco	UNESCO::CIENCIAS TECNOLÓGICAS	es_ES
dc.embargo.terms	1 year	es_ES