Los glucocorticoides y su receptor Los glucocorticoides (GCs) son hormonas esteroideas que se sintetizan y secretan en las glándulas adrenales como respuesta a señales de estrés externas y cuya síntesis está regulada por el eje hipotálamo-pituitaria-adrenal (HPA) (Taves et al., 2011). Los GCs, cortisol en humanos y corticosterona en ratones, regulan numerosos procesos fisiológicos como el metabolismo de glucosa y lípidos, la respuesta inflamatoria e inmune, el desarrollo fetal y la proliferación y supervivencia celular. Además, son importantes para la maduración de órganos como el pulmón, el riñón y la epidermis entre otros (Pérez, 2011). Además de las funciones básicas fisiológicas anteriormente descritas, los análogos de GCs son los compuestos más prescritos como tratamiento en clínica por sus propiedades anti-inflamatorias, anti-proliferativas e inmunosupresoras. También es frecuente su uso como tratamiento en enfermedades cutáneas y como co-adyuvante en tratamientos de quimioterapia, especialmente en casos de leucemia, dadas sus propiedades anti-proliferativas y pro-apoptóticas (Tissing et al., 2003). Los GCs ejercen su función a través del denominado receptor de glucocorticoides (GR). GR es un factor de transcripción dependiente de ligando que se expresa de manera ubicua y pertenece a la superfamilia de receptores hormonales nucleares (NHR) (Gronemeyer et al., 2004). Existen múltiples isoformas y variantes obtenidas por splicing alternativo y sitios alternativos de inicio de la traducción respectivamente. Las dos isoformas mejor caracterizadas, son GRα y GRβ, que se obtienen por splicing alternativo (Nicolaides et al., 2010). La piel La piel es la capa más externa de los vertebrados y se considera el órgano más grande del cuerpo. La piel es esencial para la supervivencia, ya que constituye la primera línea de defensa frente al medio ambiente, protegiendo de infecciones, radiaciones UV y heridas, entre otros. Además, evita la pérdida de agua, actúa como termoregulador, contiene receptores sensitivos y sintetiza vitamina D. La piel está compuesta por 2 capas principales: la epidermis y la dermis, que presentan estructuras y funciones diferentes (Fuchs y Raghavan, 2002). La epidermis de ratón deriva de una única capa de ectodemo embrionario que se puede observar a día de desarrollo embrionario (E)8.5-E10. Esta monocapa comienza a estratificar para dar lugar al peridermo (E9-E12). Alrededor del día E12-E15, se produce la formación de las capas intermedias. Las células de estas capas comienzan a diferenciar, expresando marcadores específicos (K1 y K10) para dar lugar a los estratos espinoso y granular (E15). Alrededor del día E16, la diferenciación terminal se completa y aparece el estrato córneo. A día E19 la epidermis es completamente madura y funcional (Byrne et al., 2003). Trabajos previos en el grupo, usando ratones transgénicos de ganancia y pérdida de función, nos han permitido estudiar y conocer el papel de GR en la fisiopatología de la piel (Pérez et al., 2001; Bayo et al., 2008). Para profundizar más en el estudio de GR y su importancia en el desarrollo de la piel, hemos generado y caracterizado los ratones transgénicos con pérdida específica de la función de GR en epidermis (Epidermal-specific GR knock-out, GREKO). RESULTADOS DE LA TESIS DOCTORAL En primer lugar quisimos investigar si la inactivación de GR en la epidermis afectaba a la formación de la barrera epidérmica durante el desarrollo embrionario. En los embriones control la epidermis maduró siguiendo el patrón establecido y esperado, comenzando a día E16.5 y finalizando a día E18.5. Sin embargo, los embriones GREKO mostraron un patrón de desarrollo alterado, con múltiples sitios de iniciación y un claro retraso en la maduración. El análisis histológico mostró que la epidermis de los embriones E17.5 GREKO era más fina que la de los controles y que en algunas regiones estaba compuesta por pocas capas de células. A día E18.5 se seguía observando esta diferencia en el grosor epidérmico. Además, se apreciaba una disminución de los estratos granular y córneo y la separación de este último del resto de la epidermis. Por el contrario, después del nacimiento (P0 y P2) los ratones GREKO presentaban una epidermis hiperplásica con defectos en la diferenciación de los queratinocitos. El estudio y expresión de marcadores de diferenciación epidérmica (filagrina, loricrina y corneodesmosina) reveló alteraciones en el patrón de expresión de los mismos, mostrando regiones parcheadas, negativas para la tinción, en la epidermis de los ratones GREKO recién nacidos. Para investigar los efectos que de manera generalizada provocó la pérdida de GR en la epidermis de los ratones GREKO, realizamos un análisis de microarrays de expresión a partir de RNA de muestras de epidermis dorsal de ratones recién nacidos. Los genes identificados con una expresión diferencial entre ambos genotipos se agruparon según su función, siendo el grupo más representado el que agrupa los genes que participan en el proceso de diferenciación de los queratinocitos. Además, muchos de los genes que se inducían en la epidermis de los ratones GREKO pertenecen al complejo de diferenciación epidérmica, compuesto por genes tanto de diferenciación de la epidermis como de defensa frente a patógenos. Para determinar si los cambios observados en la epidermis de los GREKO ocurrían de manera autónoma-celular llevamos a cabo el cultivo de los queratinocitos primarios. El análisis de expresión génica mediante qRT-PCR mostró el mismo perfil que obtuvimos en los microarrays, realizados a partir de epidermis dorsal. Es importante mencionar que tanto el fenotipo como los cambios transcriptómicos observados en la piel de ratones GREKO recién nacidos correlacionan con alteraciones características de patologías inflamatorias cutáneas como la dermatitis atópica y psoriasis (pej, Krt6/16, S100a8/a9, Tslp, Slpi). Los datos indican una respuesta epidérmica intrínseca a la pérdida de barrera epidérmica y permiten postular el uso de los transgénicos GREKO como modelo animal de estas enfermedades humanas. La pérdida de GR en la epidermis afecta a las vías de señalización por MAPKs. El análisis por inmuhistoquímica reveló un patrón de expresión normal de p-ERK en la epidermis de los ratones control de E18.5 y P0. Sin embargo, en los ratones GREKO observamos una expresión ectópica. Además, dado que GR interfiere con la actividad AKT, evaluamos la expresión y actividad de esta proteína. El análisis por Western Blot mostró un incremento en la actividad de AKT en la epidermis de los ratones GREKO, causante, al menos en parte, de los defectos en la barrera que presentan estos ratones. A pesar de que los ratones GREKO llegan a la edad adulta con normalidad, son más susceptibles que los ratones control frente a las agresiones del medio. Experimentos de carcinogénesis de piel demostraron dicha susceptibilidad. Los ratones GREKO desarrollaron un mayor número de papilomas (tumores benignos) y en un menor tiempo que los ratones control. Además, el 30% de los papilomas de los ratones GREKO (y ninguno de los controles) mostró expresión de keratina 13, un marcador que indica una posible malignización temprana de estos papilomas.