OBJETIVOS Objetivo general: Obtener células madre de pulpa dental, optimizar el método de obtención y de cultivo de estas células, y estudiar su interacción con el biomaterial β-fosfato tricálcico. Objetivos específicos: 1- Obtener células madre de pulpa dental. 2- Optimizar el método de obtención de células madre de pulpa dental. 3- Caracterizar células madre de pulpa dental usando microscopía confocal. 4- Estudiar el crecimiento de células madre de pulpa dental a distintas presiones de O2 para optimizar su cultivo. 5- Estudiar la adhesión y el crecimiento de células madre de pulpa dental sobre el biomaterial β-fosfato tricálcico. MATERIAL Y MÉTODOS Se realizó un estudio prospectivo, in vitro, no controlado. Los dientes fueron extraídos por odontólogos de la Unidad de Cirugía de la Clínica Odontológica de la Facultad de Medicina y Odontología de la Universidad de Valencia, entre Mayo de 2008 y Marzo de 2012. Para obtener células madre de pulpa dental: 1- Se seccionó la pulpa dental mecánicamente con una hoja de bisturí nº10. 2- Se recogieron los fragmentos y se realizó la digestión de estos con 2 mg/mL de colagenasa tipo I durante 90 minutos (Método A) en condiciones de 37°C, 5% CO2 y 3% O2 Se centrifugó a 1000 g durante 2 minutos y se recogió el precipitado y cultivó en medio de cultivo completo a 37°C, 5% CO2 y 3% O2. En base a este protocolo se realizaron 8 protocolos más con distintos agentes digestivos, disgregantes o combinándolos. Se estudió el rendimiento para la obtención y el tiempo mínimo necesario para obtener las células. También se caracterizaron las células con marcadores de superficie, se cultivaron a distintas presiones de oxígeno y se realizazó una curva de crecimiento. Por último, se estudió la ahesión y crecimiento de CMPD a β- fosfato tricálcico. RESULTADOS Se obtuvieron CMPD con todos los métodos menos con la fragmentación mecánica de la pulpa. Las células fueron positivas para los marcadores de superficie de células mesenquimales y negativos para los de células hematopoyéticas. Las CMPD proliferaron más en condiciones tisulares de O2 (3%) que en condiciones ambientales (21%) y fueron capaces de proliferar sobre el biomaterial de regeneración ósea biomaterial β-fosfato tricálcico. CONCLUSIONES 1- En nuestro grupo hemos obtenido células madre de pulpa dental, permitiéndonos así, determinar las condiciones óptimas para su aislamiento y cultivo. 2- De todos los métodos empleados para su obtención, la digestión de la pulpa con EDTA, colagenasa/dispasa, termolisina y sonicación, fue el que demostró mayor velocidad de aislamiento de las células. 3- Las células obtenidas de la pulpa dental fueron positivas para los marcadores CD-133, Oct4, Nestin, Stro-1, demostrando sus características de células madre mesenquimales. Además fueron negativas para el marcador de células madre hematopoyéticas CD-45. El marcador CD-34 fue positivo en un caso y negativo en otro. 4- Las células madre de pulpa dental mostraron una tasa de proliferación mayor al ser cultivadas bajo condiciones fisiológicas de O2 (3%) que bajo condiciones ambientales (21% O2). 5- Las células madre de pulpa dental tienen la capacidad de adherirse y proliferar sobre el biomaterial de regeneración ósea β-fosfato tricálcico