NAGIOS: RODERIC FUNCIONANDO

Innovative in vitro method and permeability estimation procedure to predict drug transport across the blood-brain barrier

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Innovative in vitro method and permeability estimation procedure to predict drug transport across the blood-brain barrier

dc.contributor.advisor	Casabó Alós, Vicente G.
dc.contributor.advisor	Bermejo Sanz, María del Val
dc.contributor.advisor	González Álvarez, María Isabel
dc.contributor.author	Mangas Sanjuan, Victor
dc.contributor.other	Departament de Farmàcia i Tecnologia Farmacèutica	es_ES
dc.date.accessioned	2014-06-18T10:33:27Z
dc.date.available	2014-06-19T06:10:03Z
dc.date.issued	2014
dc.date.submitted	18-07-2014	es_ES
dc.identifier.uri	http://hdl.handle.net/10550/36219
dc.description.abstract	La Barrera Hematoencefálica (BHE) es una entidad caracterizada por su naturaleza restrictiva al paso de sustancias. Las propiedades de la barrera están determinadas por la confluencia de tres componentes principales: 1) uniones celulares endoteliales con presencia de proteínas especificas intramembrana y citoplasmáticas unidas estrechamente al citoesqueleto. Esta circunstancia restringe la difusión paracelular de compuestos. Adicionalmente a las células endoteliales, la barrera presenta una membrana basal, en la cual se localizan pericitos y astrocitos, que conforman una capa que refuerza las propiedades de la barrera; 2) la presencia de transportadores de absorción y la sobreexpresión de transportadores de secreción combinada con el escaso transporte vesicular y la falta de fenestraciones y 3) metabolismo debido a la presencia de enzimas específicas, cuya función es proteger al cerebro. Todos estos componentes de la BHE son esenciales para mantener su integridad estructural, funcionalidad y estabilidad. En el Capítulo 1 de la Tesis se revisa con detalle la anatomía y fisiología de la BHE así como los mecanismos de transporte a través de esta barrera. La BHE permite el paso de sustancias esenciales al cerebro, tales como glucosa, oxigeno, iones, aminoácidos esenciales y algunas sustancias lipídicas. En situaciones fisiopatológicas, también permite el paso de macrófagos y otras células del sistema inmune. Sin embargo, debido a su naturaleza protectora de la homeostasis del cerebro, limita el transporte de sustancias potencialmente tóxicas, como son los fármacos. Estas restricciones son necesarias para mantener un óptimo ambiente que permita el desarrollo de las funciones neuronales, aunque pueda limitar el acceso de tratamientos farmacológicos cuando son requeridos. La BHE, la Barrera Cerebroespinal (BCE) y otras estructuras son un obstáculo enorme para la administración de fármacos con finalidad diagnóstica o terapéutica en el interior del cerebro. Actualmente, existe un número creciente de patologías que afectan al Sistema Nervioso Central (SNC) y según las investigaciones más recientes en muchas de ellas existe una desregulación o disfunción de la BHE. Numerosos investigadores trabajan hoy en día para entender los principales determinantes de la velocidad y magnitud de acceso al cerebro a fin de mejorar el desarrollo de sistemas de liberación dirigidos a optimizar el paso a través de la BHE. En este sentido hay numerosas propuestas novedosas que facilitarán el desarrollo de candidatos capaces de acceder al SNC que se describen en el Capítulo 2 de la memoria. Con el fin de garantizar que los fármacos alcanzan su diana terapéutica es necesario evaluar la habilidad de los candidatos para cruzar la BHE, preferiblemente en las primeras fases de desarrollo de medicamentos. La determinación de los parámetros farmacocinéticos de los compuestos en desarrollo se ha facilitado gracias al uso de métodos experimentales in silico, in vitro e in vivo. Particularmente, los métodos in vitro basados en cultivos y co-cultivos de líneas celulares se han utilizados como métodos de cribado rápido para seleccionar los mejores candidatos en las etapas siguientes. Los modelos in vitro deben cumplir una serie de requisitos como un valor alto de resistencia transepitelial (TEER), baja capacidad permeable y la expresión de diferentes transportadores en su membrana. Mediante los coeficientes de permeabilidad obtenidos, se puede predecir la velocidad de acceso al cerebro y el momento del inicio de la acción, pero no es posible determinar la cantidad de fármaco que se alcanzaría en estado estacionario. Sólo la fracción de fármaco libre en plasma es capaz de atravesar las barreras biológicas, tales como la BHE, y alcanzar la diana terapéutica. Por ello son necesarios nuevos modelos in vitro experimentales capaces de considerar todos los factores mencionados y predecir velocidad y cantidad de fármaco que alcanza la diana terapéutica, en este caso en el cerebro. Otro objetivo de los modelos in vitro consiste en reproducir las condiciones fisiopatológicas de la BHE. La morfología, la fisiología y consecuentemente la permeabilidad de la BHE se ven alteradas en numerosas enfermedades y todavía no se conoce claramente como esos cambios afectan al acceso de fármacos al SNC. Modelos in vitro de condiciones patológicas podrían ser muy útiles para encontrar soluciones aplicables a estas situaciones. En este sentido, el aislamiento de capilares se ha utilizado para estudiar ciertas condiciones patológicas y, recientemente, se están investigando con este propósito modelos de redes de fibras en 3D, modelos de chip de microfluidos y otros modelos de cultivos celulares. Los diversos métodos in silico, in vitro e in vivo se discuten en cuanto a ventajas y limitaciones en el Capítulo 3 y se justifica la necesidad del desarrollo de un nuevo sistema de predicción como objetivo central de esta Memoria. Durante las fases preclínicas del desarrollo de medicamentos, los experimentos para la determinación de la permeabilidad son esenciales a la hora de seleccionar moléculas candidatas para su posterior desarrollo clínico. La estimación del valor de permeabilidad de estas moléculas es un punto crítico que permitirá incorporar o descartar a los candidatos para las fases posteriores, por lo que el valor de permeabilidad obtenido debe ser lo más exacto y preciso posible. Para ello es necesario controlar los factores pre-experimentales, experimentales y post-experimentales que pueden influir en la obtención de dicho valor. En el Capítulo 4 se revisan estas metodologías de cálculo y se propone un nuevo método de estimación. Tavelin y col. habían propuesto en 2002 una nueva ecuación para calcular la permeabilidad cuando el experimento de transporte no cumplía las condiciones sink o sumidero. También describieron la presencia de perfiles atípicos en los que la velocidad inicial está alterada debido a factores propios del investigador, o factores asociados a las características fisicoquímicas del compuesto, así como condicionantes propios del diseño experimental. El modelo non-sink clásico presenta una infra- o sobreestimación del valor de permeabilidad en situaciones de perfiles atípicos, es por ello que surgió la necesidad de diseñar una nuevo modelo para calcular la permeabilidad que se ha llamado MNS (modificación de la ecuación non-sink.). Mediante la simulación de experimentos de transporte, se ha explorado la capacidad predictiva del nuevo modelo MNS, para diferentes perfiles de cantidad-concentración frente al tiempo, incluyendo aquellos en los cuales la permeabilidad se ve alterada en las primeras fases del ensayo experimental y se ha comparado frente a los métodos clásicos sink y no-sink. El modelo se ha probado considerando diferentes niveles de variabilidad experimental y, finalmente se ha explorado su utilidad para la clasificación de fármacos según el sistema BCS (Biopharmaceutical Classification System). Los resultados han demostrado que el método MNS es preciso y exacto para el cálculo de la permeabilidad en cualquier tipo de perfil y en diferentes escenarios de variabilidad, bajo condiciones sink y no-sink, mientras que el modelo estándar No-Sink presenta una peor capacidad predictiva en aquellas situaciones dónde se ve alterado el paso de fármaco a través de la monocapa en las fases iniciales del ensayo experimental. Los modelos de regresión lineal, Sink y Sink corregida, no son válidos en condiciones no-sink, debido a que no se cumplen las asunciones necesarias para su utilización, pero tampoco en condiciones sink donde hay una alta variabilidad experimental. Otros factores que pueden afectar el valor de permeabilidad calculado son los relativos a los protocolos o procedimientos normalizados de trabajo de la técnica experimental. Este aspecto se aborda en el Capítulo 5. En esta tesis doctoral se ha realizado un estudio para comparar los resultados obtenidos utilizando distintos protocolos que se diferenciaban fundamentalmente en la edad de las monocapas utilizadas (pases) y en la distinta maduración de las células antes de realizar el experimento (días post-sembrado), así como en el uso de insertos recubiertos o no con colágeno. Los resultados obtenidos demostraron diferencias estadísticamente significativas en el valor de permeabilidad según las distintas condiciones ensayadas. Es por ello que, la estandarización y la demostración de la idoneidad de los métodos experimentales son pasos necesarios para la utilización de los valores de permeabilidad con fines regulatorios o de predicción del comportamiento in vivo durante el desarrollo clínico. Generalmente, se ha prestado más atención a la validación de los procesos experimentales y menos al análisis matemático de los resultados, aunque los modelos matemáticos estándar presenten una serie de asunciones que no siempre se mantienen experimentalmente. Una vez controlada la fiabilidad en la obtención de la permeabilidad para fármacos candidatos a atravesar la BHE se procede al cálculo de los parámetros que rigen dichos procesos. Los parámetros más relevantes para la predicción de la velocidad y cantidad que atraviesa la BHE son: fu, plasma (fracción de fármaco libre en plasma), Kpuu, brain (relación entre la concentración de fármaco libre en plasma y cerebro) y Vu, brain (volumen de distribución en el cerebro). Su estimación requiere todavía de modelos in vivo y de experimentos in vitro de cribado rápido conjuntamente, lo cual dificulta el cribado rápido de moléculas candidatas a actuar en el SNC en las fases iniciales de desarrollo clínico. El objetivo principal de este trabajo es el desarrollo de un nuevo método in vitro de cribado rápido para la predicción de la velocidad y cantidad de fármaco que atraviesa la BHE y se discute en el Capítulo 6. El sistema permite estimar los parámetros anteriormente descritos en un único método experimental, utilizando monocapas celulares in vitro bajo diferentes condiciones. A partir de relaciones entre los valores de permeabilidad obtenidos bajo cada condición y con el adecuado análisis matemático, se estiman todos los parámetros relevantes. Se seleccionaron diez compuestos y se estimaron sus valores de permeabilidad utilizando líneas celulares MDCKII y MDCKII-MDR1 en ausencia o presencia de albúmina y homogeneizado de cerebro. Los ratios entre las permeabilidades obtenidas en presencia y ausencia de albúmina permiten estimar la fracción libre en plasma in vitro. Por otro lado, los ratios entre las permeabilidades en presencia y ausencia de homogeneizado de cerebro permiten la estimación de la fracción libre en cerebro in vitro. Kpuu, brain y Vu, brain se estiman a partir de la relación entre las permeabilidades apical y basal en condiciones estándar. Los parámetros in vitro se correlacionaron con los parámetros de los mismos compuestos obtenidos en experimentos in vivo. Con ello, se ha demostrado una alta capacidad predictiva del comportamiento in vivo de los compuestos utilizando el sistema experimental propuesto. La línea celular MDCKII presentó un mayor nivel de correlación frente a los valores in vivo de fu, plasma, Kpuu, brain y Vu, brain (R=0.93, R=0.85 y R=0.99, respectivamente). Debido a su sencillez, destaca notablemente el nivel de correlación obtenido, a pesar del número reducido de compuestos con características fisicoquímicas y mecanismos de transporte asociados tan diversos. Modificaciones experimentales posteriores serán necesarias, con el fin de optimizar el método, pero los resultados obtenidos hasta el momento demuestran su viabilidad. Del mismo modo que otros modelos de cultivos celulares in vitro, el sistema es adecuado para la miniaturización y robotización con el objetivo de establecer mecanismos de cribado rápido de candidatos en el desarrollo de medicamentos.	es_ES
dc.format.extent	339 p.	es_ES
dc.language.iso	en	es_ES
dc.subject	permeability	es_ES
dc.subject	in vitro	es_ES
dc.subject	blood-brain barrier	es_ES
dc.title	Innovative in vitro method and permeability estimation procedure to predict drug transport across the blood-brain barrier	es_ES
dc.type	doctoral thesis	es_ES
dc.subject.unesco	UNESCO::CIENCIAS MÉDICAS::Farmacodinámica::Absorción de medicamentos	es_ES
dc.embargo.terms	0 days	es_ES