Los sarcomas son tumores muy agresivos si bien relativamente infrecuentes. Suelen afectar a una población de edad bastante precoz y su tratamiento ademas de la radioterapia y cirugía es limitado , por ello se hace indispensable un estudio intensivo de su biología en busca de nuevas terapias ,como pudiera ser la respuesta inmune, para mejorar la superviviencia, que es actualmente desfavorable en estadios II y III de la enfermedad y ademas la presencia de metástasis (estadio IV) se asocia a un pronostico infausto en la mayoría de lo casos (1). Las quimiocinas comprenden una familia de aproximadamente 50 citocinas, que están implicadas en muchos procesos biológicos, tales como la migración de leucocitos , embriogénesis, angiogénesis, hematopoyesis, aterosclerosis, crecimiento tumoral, metástasis e infección por HIV (2). Estas quimiocinas se clasifican en dos grandes grupos basándose en su función y en el patrón de expresión: quimiocinas homeostáticas e inflamatorias (3). Las quimiocinas homeostáticas se expresan constitutivamente en ciertos tejidos, y juegan un papel importante y vital en el desarrollo y mantenimiento (homeostasis) del sistema inmune y hematopoyético. Por otro lado, las quimiocinas inflamatorias no se expresan constitutivamente, siendo inducibles por estímulos inflamatorios. Su expresión está estrechamente controlada por citocinas proinflamatorias que se expresan a nivel local. También las quimiocinas y sus receptores estimulan el crecimiento tumoral así como la migración e invasión neoplásica (3). Actualmente, se está estudiando la expresión de las distintas quimiocinas y sus receptores en múltiples neoplasias y entre ellas los sarcomas, en donde se encuentran logrando protagonismo notable en este campo con algunas publicaciones en revistas de alto impacto (4) Nosotros nos proponemos estudiar la expresión de tres quimiocinas relacionadas directamente en los procesos de proliferación tumoral, angiogénesis y metástasis. Para ello analizaremos el papel que desempeñan durante las primeras fases de crecimiento tumoral escogiendo un modelo mixto: sarcoma humano con crecimiento in vivo mediante xenoinjertos en ratones atímicos. Nos centraremos en el estudio de la expresión de los ligandos de las tres quimiocinas siguientes: 1.1. CXCL1/2/3 Estas quimiocinas tienen de receptor a CXCR2, y promueven la quimiotaxis de neutrófilos y es responsable de la actividad angiogénica y quimiotáctica de las células endoteliales (5). El reclutamiento de neutrófilos juega un importante papel en la actividad angiogénica del homólogo murino CXCL1/ proteína-2 inflamatoria macrofágica(MIP-2) (6). De hecho, los neutrófilos pueden sintetizar y almacenar moléculas angiogénicas, como el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF)-A. Sin embargo, estas quimiocinas no solo atraen a las células tumorales sino que también pueden contribuir directamente a la transformación y crecimiento tumoral. De hecho, las quimiocinas GRO (CXCL1/2/3) juegan un papel fundamental en la quimiotaxis y metástasis de varias líneas celulares y actuan como factores de crecimiento autocrino en el melanoma y otros tumores (7). La sobreexpresión de CXCL1/GRO-α en melanocitos se asocia a una activación constitutiva del factor κB nuclear aumentando la progresión nuclear (8). Una mutación puntual en CXCR2 genera una señal constitutiva, promoviendo la transformación celular de preneoplásica a neoplásica. Además , se ha demostrado que CXCL1/GRO-α no sólo se une a CXCR2 sino también al GPCR codificado por el tumorigénico virus herpes-8 asociado al sarcoma de Kaposi (9). Además de la anteriormente descritas CXCR1 y CXCR2, se identificó otro receptor quimiocina ligando, llamado receptor antígeno Duffy para quimiocinas (DARC) (3). 1.2. CXCL9 y CXCL10 Estas pertenecen al grupo de las quimiocinas CXC ELR-. En este grupo se encuentran las quimiocinas CXCL9/Mig, CXCL10/IP-10, CXCL11/I-TAC y su receptor CXCR3 que tienen un poder angiostático en la angiogénesis y son producidas in vitro por una gran variedad de células, incluyendo células endoteliales, fibroblastos, células mononucleares y tumorales, y su presencia ha sido confirmada en varios tipos de tejidos tumorales (10). Estas quimiocinas inhiben la actividad angiogénica de las quimiocinas CXC ELR+ en los ensayos in vitro en la quimiotaxis de células endoteliales y en el modelo in vivo en la cornea de la rata. El mecanismo responsable del bloqueo de los ligandos CXCR1 y CXCR2 por los ligandos de CXCR3 no están bien entendidos todavía. CXCR3-B y la unión GAG sobre células endoteliales están probablemente involucrados en mediar la actividad angiostática (11). Hay al menos tres variantes de ensamblaje de CXCR3, llamadas CXCR3-A, CXCR3-B y CXCR3-alt. CXCR3-A está involucrado en la actividad quimiotáctica de las quimiocinas CXC IFN-γ sobre los linfocitos T activados y células NK. Clásicamente, el reclutamiento de esas células facilita la inmunidad antitumoral produciendo una regresión tumoral (12). CXCR3-B se postula que media la actividad angiostática de CXCL4/PF-4, CXCL9, CXCL10, y CXCL11 sobre células endoteliales. La expresión de CXCR3 en células endoteliales es ciclo-celular dependiente y limitada a la fase S/G2-M. Aunque la mayoría de receptores quimiotácticos están emparejados con las proteínas toxinas-sensitiva G pertussis, se ha publicado que CXCR3-A y CXCR3-B median su función recíproca a través de diferentes proteínas G emparejadas. Algunos tejidos como el corazón, riñón, hígado y músculo esquelético expresan ambas variantes de ensamblaje CXCR3. Otros tejidos como la placenta, expresan sólo CXCR3-A, mientras que las células endoteliales vasculares expresan selectivamente CXCR3-B (13). La relativa expresión de estas dos variantes en el cáncer de mama sugiere ser importante en la regulación de su proliferación en respuesta a CXCL10. De hecho, tras la disminución de CXCR3-By CXCL10 se produce un aumento en la proliferación del cáncer de mama, lo que confirma el papel de CXCR3-B en la inhibición del crecimiento celular y sugiere la participación de CXCR3-A u otro receptor CXCL10 que promueva la proliferación celular (3). El papel de la expresión de CXCR3 en la biología tumoral ha sido investigado por otros grupos de trabajo en las metástasis. La expresión constitutiva de CXCR3 en melanomas, carcinomas de colon y mama aceleran las metástasis a ganglios linfáticos (14). Por otro lado, el antagonismo de CXCR3 produjo una inhibición de las metástasis pulmonares en el cáncer de mama en un modelo murino (15). Esto sugeriría un papel de CXCR3 en conducir células CXCR3 positivas hacia sitios donde IFN-γ es abundante, como se describió previamente en CXCL12/SDF-1 en el eje CXCR4. De hecho, CXCL10/IP-10 se detectó en sitios metastáticos en células de carcinoma colo-rectal, y promociona la invasión tumoral. Esto indica que los ligandos CXCR3 tienen efectos opuestos sobre el microambiente de las células tumorales (antimaligno) y sobre las células tumorales (promaligno). Esta dicotomía de los ligandos CXCR3/CXCR3 también sugiere que la aplicación de estos ligandos CXCR3 como potenciales agentes terapéuticos en cáncer, podrían ser problemáticos (3). Un tercer receptor CXCR3, CXCR3-alt tiene la actividad funcional reducida y media efectos quimiotácticos inducidos por CXCL11/I-TAC. Una razón mayor para reducir la actividad quimiotáctica puede ser una expresión más baja de la proteína en superficie de CXCR3-alt, comparado con la que rellena el receptor. Además, se ha sugerido la existencia de otro receptor funcional para CXCL10/IP-10 presente en células epiteliales y endoteliales que no sea CXCR3-A (16). 2. Metodología: Para llevar a cabo la presente propuesta de proyecto de tesis doctoral será necesario llevar a cabo la siguiente metodología: - Xenotransplantes de sarcomas humanos en ratones atímicos - Estudios histológicos - Inmunohistoquímica - Inmunofluorescencia - Microscopía electrónica - ELISA - PCR cuantitativa. 2.1. Xenotransplantes de sarcomas humanos en ratones atímicos. Se llevarán a cabo implantes subcutáneos de sarcomas humanos (de 0.2-0.3 cm3 de tamaño) en la espalda de ratones atímicos (athymic Balb-c nude mice) en condiciones de esterilidad. Dichos animales se sacrificarán a las 24 h, 48, 72h (96h), 7, 14(10), 21 y 28 días del xenoinjerto. A partir de las muestras tumorales y plasma murino obtenidas se procederá a llevar a cabo los estudios histológicos, inmunofenotípicos y moleculares. 2.2. Estudios histológicos Las muestras de tejido obtenidas se fijarán en 10% de formaldehído, se incluirán en parafina, y se teñirán con hematoxilina-eosina para el estudio histológico. En este estudio se tendrán en cuenta características, como: presencia de necrosis, distribución de capilares, interacción del tumor con el tejido circundante del huésped, con la zona de necrosis y vasos sanguíneos. Se excluyen del estudio aquellas muestras que carezcan de células tumorales no necrosadas. El estudio histológico e inmunofenotípico se pretende llevar a cabo sobre los siguientes sarcomas: sarcoma de Ewing/PNET, condrosarcoma grado 2, condrosarcoma grado 3, osteosarcoma osteogénico , fibrosarcoma, sarcoma sinovial monofásico y tumor del estroma gastrointestinal (GIST). 2.3. Inmunohistoquímica La inmunohistoquímica se llevará a cabo mediante el método indirecto de peroxidasa sobre secciones de parafina. Se llevará a cabo una recuperación antigénica inducida por calor en autoclave de 1.5 atmósferas durante 3 min en una solución de tampón citrato. La reacción antígeno-anticuerpo se visualizará mediante una reacción cromogénica con un conjugado de avidina-biotina-peroxidasa (LSAB). Los controles negativos se llevarán a cabo sustituyendo el anticuerpo primario con tampón salino de fosfato. Entre los anticuerpos que se testarán se incluyen: CXCL9, CXCL10, CXCL1/2/3, VEGF, KDR, Flt1, Flt4, VE-CAD, PDGFRA, HIF-1 y Ki67. Cada uno de los anticuerpos serán testados con tejidos controles positivos en cada uno de los procedimientos. 2.4. Inmunofluorescencia Marcaremos con dos colores fluorescentes (rojo-verde), dos proteínas distintas la misma sección histológica del tumor. Uno de los colores detecta una quimiocina y otro un antígeno característico del tipo de sarcoma. Para ello, seguiremos el protocolo de la casa comercial R&D Systems. Primero, desparafinaremos las secciones en xilol y rehidrataremos con etanol y agua destilada. Realizaremos la recuperación antigénica con tampón citrato incubando 10min hirviendo en microondas. Incubaremos el anticuerpo primario durante la noche (14-20h). Lavaremos con PBS y posteriormente incubaremos el anticuerpo secundario fluorescente durante 60min. Lavaremos con PBS y cubriremos las muestras con Mowiol. Las secciones se guardarán en frío (3-4ºC) y protegidas de la luz. Finalmente, se tomarán fotografías de las áreas más representativas en el microscopio confocal de todos los planos del corte en parafina (Leica M165). 2.5. Microscopía electrónica Para llevar a cabo los estudios de microscopia electrónica, los tejidos se fijarán en gluteraldehido, se post-fijarán en una solución de tetraóxido de osmio tamponado y se incluirán en la resina Eponato 12. Los tejidos se cortarán en secciones semifinas de 1µm y se teñirán con azul de toluidina para resaltar los campos más representativos del tumor. Posteriormente se realizarán cortes ultrafinos con un ultramicrotomo Reichert Ultracut Ultramicrotome (Leica, Inc., Deinfield, Illinois) y se teñirán con acetato de citrato y uranilo, para a continuación analizar las muestras con un microscopio electrónico (JEOL JEM 1010, Tokyo). 2.6. ELISA Adicionalmente a las muestras de tejido, se recogerán muestras de suero de los animales de experimentación sobre los que se establecerán los niveles de expresión de factores de crecimiento en suero tanto de origen humano como de ratón. 2.7. PCR cuantitativa Además de los parámetros anteriormente mencionados se procederá a analizar los niveles de expresión de determinados genes de expresión mediante RT-PCR cuantitativa. Para ello, se procederá a extraer RNA de cada una de las muestras analizadas y mediante sondas TaqMan evaluar sus niveles de expresión. Se tomará como muestra calibrador el tumor antes del xenoinjerto y para realizar los cálculos de expresión el método del 2-Ct. Entre los genes a analizar destacan: -Factores de crecimiento y receptores: EFNA2 (Ephrin A2), EFNA5 (Ephrin A5), EFNB2 (Ephrin B2), EPHB4 (Ephrin B4), FGF1 (aFGF), FGF2 (bFGF), FGF4, FGF6, FGF7, FGFR1, FGFR2 (KGFR), FGFR3, FGFR4 , PDGFA, PDGFB, PDGFRA, PDGFRB, PF4 (Platelet factor 4), TGFA, TGFB1, TGFB2, TGFB3, TGFBR1, TGFBR2, TGFBR3, FIGF (VEGFD), FLK1 (KDR), FLT1 (VEGFR2), PGF, VEGF, VEGFB, VEGFC, CD36, EDG1, EGF, EGFR, GRO1, HGF (Scatter factor), IGF1, TEK (Tie-2), TIE. -Citocinas y quimiocinas: CXCL9, CXCL10, CXCL1/2/3, CSF3, IFNA1, IFNB1, IFNG, IL10, IL12A, IL8, MDK, NRP1 (neuropilin-1), PRL (prolactin), PTN (pleiotrophin), SCYA2, SPARC, TNFA, TNFSF15 (VEGI). - Factores de transcripción: ERBB2, ETS1, HIF1A, ID1, ID3, MADH1 (SMAD1) 3. Objetivos: 3.1. Estudiar la expresión de estas tres quimiocinas (CXCL1/2/3, CXCL9 y CXCL10) en diferentes sarcomas, correlacionando la inmunohistoquímica convencional con el método indirecto de peroxidasa, y la inmunofluorescencia indirecta. 3.2. Estudiar el patrón de expresión de las quimiocinas en los sarcomas xenotransplantados en ratones atímicos en los primeros días de desarrollo: entre las 24 horas y los 30 días en cortes de tiempo sucesivos señalar los cortes de sacrifico tumoral. 3.3. Observar el papel que desempeñan dichas quimiocinas en la angiogénesis y crecimiento tumoral en las primeras días del crecimiento neoplásico tras el injerto. Así como analizar el papel que desempeña la necrosis tumoral, el estroma murino peritumoral y el árbol vascular en el crecimiento de los sarcomas. 3.4. Buscar una correlación entre la expresión de quimiocinas en las técnicas inmunohistoquímicas sobre el tejido tumoral incluido en parafina, y otras técnicas de biología molecular como ELISA y PCR cuantitativa sobre dichas quimiocinas en el suero de ratones atímicos. 3.5. Observar los cambios morfológicos y ultraestructurales que se producen en los sarcomas durante los primeros días y semanas del crecimiento tumoral. 4. Bibliografía: 1. Pathology and Genetics of Tumours of Soft Tissue and Bone (WHO). Edited by Christopher D.M. Fletcher, Krisjnan Unni and Fredrik Mertens, 2002. 2. Struyf S, Proost P, Van Damme J, Regulation of the immune response by the interaction of chemokines and proteases, Adv. Immunol. 81 (2003) 1-44. 3. Vandercapellen J, Van Damme J, Struyf S, The role of CXC chemokines and their receptors in cancer, Cancer Letters. 267 (2008) 226-244. 4. 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