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Resistencia a nuevos antivirales de acción directa en aislados clínicos del virus de la hepatitis C

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Resistencia a nuevos antivirales de acción directa en aislados clínicos del virus de la hepatitis C

dc.contributor.advisor	López Labrador, Francesc Xavier
dc.contributor.author	Salvatierra, Karina Alejandra
dc.contributor.other	Facultat de Ciències Biològiques	es_ES
dc.date.accessioned	2014-11-21T11:55:29Z
dc.date.available	2015-11-22T04:45:05Z
dc.date.issued	2014
dc.date.submitted	03/12/2014	es_ES
dc.identifier.uri	http://hdl.handle.net/10550/40019
dc.description.abstract	La infección crónica provocada por el virus de la hepatitis C (VHC) sigue siendo un problema de salud pública a nivel mundial y en España, ocasionando unas 10.000 muertes al año. Se estima que el 3% de la población mundial (200 millones de personas en el mundo y unas 900.000 en España) se encuentran infectadas por este virus. En España, y en el resto de países Occidentales, además de ser la principal causa de hepatitis crónica, cirrosis y carcinoma hepatocelular, la infección por VHC es la indicación más frecuente de trasplante hepático. El tratamiento convencional basado sólo en interferón pegilado más ribavirina (peg-IFN-α/RBV), provoca numerosos efectos secundarios, es de larga duración y con poco éxito en pacientes infectados con genotipo 1. Por otra parte, la reinfección del injerto post-trasplante es universal, ocasionando una hepatitis más agresiva y más difícil de tratar con peg-IFN-α /RBV, con efectos adversos muy frecuentes. Esto ha impulsado al desarrollo de fármacos más específicos, los antivirales de acción directa (AAD). Estos están dirigidos contra proteínas del virus, como la proteasa NS3, la proteína NS5A ó la polimerasa NS5B, y han mostrado una gran efectividad con mínimos efectos secundarios. A pesar de su alto precio, en pacientes con enfermedad avanzada ó trasplantados el acceso a los nuevos tratamientos con ADD es fundamental para mejorar su pronóstico y detener la progresión de la enfermedad. En España, para aquellos pacientes con infección por VHC genotipo 1, el tratamiento estándar incluye IP de primera (Telaprevir ó Boceprevir) ó de segunda (Simeprevir) generación con unas tasas de respuesta del 75-85%, aunque se espera la autorización de otros AAD (por ejemplo, Sofosbuvir y Daclatasvir) que, en combinación, aumentan la tasa de éxito del tratamiento hasta el 95% incluso en ausencia de interferón. Sin embargo, aunque estos nuevos AAD han demostrado un potente efecto antiviral in vitro e in vivo, se han descrito numerosas mutaciones del virus asociadas con el desarrollo de resistencias. Se ha observado una menor eficacia de AAD en ciertos pacientes, debido a mutaciones de resistencia del virus, bien por selección de mutaciones pre-existentes, o bien por emergencia durante la administración AAD. Además, en pacientes trasplantados inmunodeprimidos, el VHC puede estar sometido a una menor presión selectiva, y presentar una variabilidad genética diferente en relación a pacientes inmunocompetentes. Por tanto es importante determinar la variación natural del genoma del VHC y su posible impacto en el tratamiento con nuevos AAD en estos grupos de pacientes, para prevenir potenciales fallos terapéuticos y optimizar los futuros regímenes terapéuticos, escogiendo los AAD más adecuados. El objetivo en esta tesis doctoral fue analizar la variabilidad genética del VHC en los genes NS3 y NS5B, diana de AAD inhibidores de la proteasa (IP) y polimerasa viral (nucleosídicos –IAN- y no nucleosídicos –INN-), en distintos aislados naturales del subtipo 1b obtenidos de pacientes con infección crónica, partiendo de la hipótesis de que ya se encuentran en circulación virus resistentes a estos nuevos fármacos. Se logró poner a punto la secuenciación de la proteasa NS3 y la polimerasa NS5B del VHC, y el estudio de mutaciones minoritarias de resistencia a AAD mediante clonación y secuenciación. En la región de la proteasa NS3, se identificaron variaciones de aminoácidos responsables de resistencia moderada a IP, con baja prevalencia, entre el 1,67% (V36L, V55A, A87T, R117H, S122G y V170T) y el 5% (S122T/N). Sin embargo, no se identificaron las principales mutaciones de resistencia alta a boceprevir o telaprevir (R155K/T, A156V/T y V170A). En cuanto a la región de la polimerasa NS5B, se identificaron las variaciones asociadas con resistencia moderada a IAN L159F y I239L en el 25% y 1,67% de los aislados, respectivamente, pero no se identificaron las principales mutaciones de resistencia alta a IAN (S96T, N142T, S282T y L320F) en ningúno de los aislados analizados. Con respecto a las variaciones asociadas a resistencia a INN, se identificaron en todos los aislados analizados al menos un polimorfismo o mutación relacionada con resistencias, localizándose en todos los distintos sitios alostéricos de la polimerasa viral, por lo que afectarían a la acción de las distintas subfamilias de INN, según su diana. En particular, la mutación C316N (asociada con resistencia a los INN dirigidos a los sitios alostéricos C y D de la polimerasa), se encontró en un 50% de los aislados. Su localización cercana al sitio activo sugiere que podría también afectar a la efectividad de IAN como el sofosbuvir en algunos pacientes infectados por VHC subtipo 1b. En el análisis intrapaciente de clones moleculares de ambas regiones, NS3 y NS5B, se detectaron variantes minoritarias en la cuasiespecie del VHC no detectables mediante secuenciación directa estándar, algunas de ellas asociadas con resistencia a IP, IAN e INN. De acuerdo al número y tipo de sustituciones nucleotídicas encontradas asociadas a resistencia a AAD en NS3 y NS5B, la mayoría de ellas están asociadas a una barrera genética baja, ya que sólo con una sustitución de nucleótidos en el codón correspondiente se ha podido generar el cambio de aminoácido, tanto en variantes mayoritarias detectadas por secuenciación convencional como en variantes minoritarias intraindividuo en la cuasiespecie del virus. De acuerdo a nuestros resultados y las observaciones anteriores, todo parece apuntar a que lo más probable es que en la mayoría de individuos tanto inmunocompetentes como inmunodeprimidos, se estén dando fenómenos de selección purificadora o selección de fondo de las poblaciones virales, aunque más marcada en la proteasa NS3 y en pacientes inmunodeprimidos, lo que es bastante plausible, conociendo el papel fundamental de esta proteína para el ciclo de vida del virus. Alternativamente, esta situación se podría haber producido en los pacientes inmunodeprimidos por un aumento del tamaño poblacional de la “cuasiespecie” del virus debido a dos factores: i) el cuello de botella que representa la infección del nuevo hígado trasplantado y ii) el aumento de la replicación del virus gracias a la inmunosupresión. A nivel de codones individuales, todos los codones de la proteasa NS3 y la mayoría de los de la polimerasa NS5B parecen sometidos a selección negativa ó purificadora, de acuerdo a su función imprescindible en el ciclo de vida del virus. De los 12 codones de NS5B que se encuentran bajo selección positiva, dos (300 y 556) se encuentran implicados en resistencia a INN, por lo que la fijación de mutaciones en estas dos posiciones podría verse favorecida en presencia de estos fármacos. A nivel intrapoblacional en la cuasiespecie (clones moleculares), dos codones de la polimerasa NS5B implicados con resistencia a INN (M426 y R531) presentan evidencia de diversificación episódica a lo largo de las ramas de la filogenia, lo que podría indicar que los cambios de aminoácidos en esos codones le confieren una ventaja adaptativa a estas variantes dentro de la cuasiespecie, y se podrían fijar en la cuasiespecie en presencia de esta clase de AAD. El análisis filogenético de las secuencias NS3 y NS5B localiza a nuestros aislados cercanos a las secuencias de referencia similares a la del replicón Con1, subtipo 1b. No hay grupos filogenéticos concretos que relacionen los aislados del VHC-1b según su perfil de mutaciones de resistencia a IP, IAN ó INN. Aunque en el caso de las resistencias a INN se pueden clasificar a la mayoría de los aislados en dos grupos diferenciados por poseer o no unas pocas mutaciones, estos grupos no se diferencian filogenéticamente. Lo mismo ocurre a nivel intrapaciente con las variantes mayoritarias y minoritarias presentes en la cuasiespecie (clones moleculares) ó población viral. Estos resultados sugieren que no hay clados de virus resistentes definidos en la población infectada. Algunos aminoácidos relacionados con resistencia a IP (NS3 87, 117) y a INN (NS5B 300, 426, 451) coevolucionan con otros, bien a nivel intraproteína ó a nivel interproteína, posiblemente para mantener el fitness viral. Podemos especular que, en alguna medida, ciertas mutaciones de resistencia a IP en NS3 podrían favorecer la selección de mutaciones de resistencia a INN en NS5B, ó viceversa. Los aislados del VHC subtipo 1b de pacientes con infección crónica en nuestra área geográfica tienen una alta prevalencia de polimorfismos naturales en posiciones relacionadas con resistencia a AAD, en especial a INN (con efecto desconocido), aunque no hay diferencias significativas entre aislados de pacientes inmunocompetentes del Hospital La Fe y del HUGTIP ó inmunodeprimidos del Hospital La Fe en cuanto al número ó porcentaje de cambios de aminoácido en posiciones asociadas a resistencia a IP, IAN, ó INN, ni en cuanto a su agrupación filogenética. Por tanto, no hay una prevalencia distinta de estas mutaciones ó polimorfismos, ni una diferenciación filogenética significativa, entre pacientes de Valencia ó Badalona, ni entre pacientes inmunocompetentes ó inmunodeprimidos. Finalmente, podemos decir que la determinación de mutaciones de resistencia por secuenciación estándar antes del tratamiento con AAD, podría ser útil para escoger la mejor pauta de AAD en cada caso, en particular qué subfamilia de INN. Por otra parte, no se conoce si las variantes minoritarias resistentes podrían ser seleccionadas y persistir a largo plazo en mayor ó menor proporción de la cuasiespecie en todos los pacientes ó sólo en algunos, y su control durante el tratamiento será conveniente realizarlo en los casos de fallo terapéutico. Sin embargo, la caracterización del perfil de resistencias minoritarias a los AAD utilizando el método “patrón oro” de alta sensibilidad usado en esta tesis (secuenciación de clones moleculares) no es aplicable a la práctica clínica, aunque existen otros métodos alternativos de análisis exhaustivo de secuencias, tales como PCR específica, y métodos basados en secuenciación masiva, cuya aplicabilidad está aun por determinar.	es_ES
dc.format.extent	356 p.	es_ES
dc.language.iso	es	es_ES
dc.subject	inhibidores de la polimerasa	es_ES
dc.subject	resistencia	es_ES
dc.subject	antivirales de acción directa	es_ES
dc.subject	inhibidores de la proteasa	es_ES
dc.subject	virus de la hepatitis c	es_ES
dc.title	Resistencia a nuevos antivirales de acción directa en aislados clínicos del virus de la hepatitis C	es_ES
dc.type	doctoral thesis	es_ES
dc.subject.unesco	UNESCO::CIENCIAS DE LA VIDA::Virología	es_ES
dc.subject.unesco	UNESCO::CIENCIAS DE LA VIDA	es_ES
dc.embargo.terms	1 year	es_ES