Las lipofuscinosis ceroideas neuronales son un grupo heterogéneo de enfermedades neurodegenerativas hereditarias graves que tienen su inicio en la infancia y que se engloban dentro de las enfermedades de almacenamiento lisosomal. Las características clínicas de estas patologías son una disminución de la capacidad mental acompañada de alteraciones motoras, epilepsia y pérdida de visión. Histológicamente las células muestran una acumulación de material autofluorescente (lipofuscina) en el interior de los lisosomas de diversos tejidos, pero en especial en el cerebro y la retina. De entre todas las lipofuscinosis ceroideas neuronales, este trabajo se ha centrado en dos de ellas, la LINCL (ORPHA 168491) y la JNCL (ORPHA 79264), puesto que, conjuntamente, suponen aproximadamente el 90 % de todos los casos de lipofuscinosis ceroidenas neuronales que se diagnostican en el mundo. Estas dos variantes son consecuencia de mutaciones en los genes CLN2 (LINCL) y CLN3 (JNCL), que respectivamente codifican para una enzima lisosomal, la tripeptidil peptidasa I (TPP1), y para una proteína transmembrana, Cln3p, cuya función precisa actualmente se desconoce. No obstante, se postula que está asociada especialmente a microdominios de membrana enriquecidos en esfingolípidos y colesterol, localizados particularmente en el sistema endosomal/lisosomal. Pese a la heterogeneidad de las proteínas implicadas y a la diversidad de su localización subcelular, las similitudes entre los diferentes fenotipos de lipofuscinosis ceroideas neuronales sugieren que esas proteínas podrían jugar distintos papeles en una ruta común relacionada con los lisosomas y que sería especialmente importante en neuronas. La acumulación de material sin degradar en el interior de los lisosomas de las células de estos pacientes, que puede observarse mediante microscopía electrónica con una morfología diferente según cada variante (curvilíneas en LINCL y en forma de huella dactilar en JNCL), presenta como rasgo común elevadas cantidades de la subunidad c de la ATP sintasa mitocondrial. Esto indica que las proteínas codificadas por los genes CLN2 y CLN3 pueden estar implicadas o participar de forma directa o indirecta en la degradación de esa subunidad y que, como consecuencia de mutaciones en estos genes, se produciría esta acumulación que alteraría la actividad degradativa a través de las vías lisosomales, y en especial de la macroautofagia, puesto que esta es la principal vía lisosomal de degradación intracelular de proteínas. El objetivo principal de este proyecto ha sido investigar las bases celulares que pudieran explicar la diferente gravedad de las dos principales variantes de las lipofuscinosis ceroideas neuronales, la LINCL y la JNCL. Para ello, y puesto que ambas acumulan lipofuscina en el interior de los lisosomas, se ha realizado un análisis comparativo de similitudes y diferencias en alteraciones relacionadas con el funcionamiento normal de las principales vías de degradación intracelular de proteínas. Concretamente, hemos estudiado las posibles alteraciones en: 1. Los sistemas de degradación intracelular de proteínas, especialmente la autofagia y las vías de señalización que la regulan. 2. El tráfico vesicular, tanto en las vías endocíticas como en el transporte de enzimas lisosomales. Para estudiar las alteraciones en los sistemas de degradación intracelular de proteínas y en las vías de señalización que la regulan (Objetivo 1), hemos utilizado las siguientes aproximaciones: a) el estudio comparativo de la estructura de los lisosomas en las células de estos pacientes a través de la microscopía electrónica convencional; b) la determinación mediante un ensayo in vitro de la actividad de la enzima TPPI, mutada en la variante LINCL; c) la medida de la actividad de las diferentes vías degradativas lisosomales, estudiando la degradación de las proteínas de vida media corta y larga utilizando valina marcada radiactivamente; d) el análisis de la síntesis y maduración de los autofagosomas mediante Western-blot a través de un marcador específico de esta vía degradativa, LC3-II; e) el estudio del pH lisosomal mediante microscopía de fluorescencia, analizando la incorporación a los lisosomas de FITC-dextrano; f) el estudio de la ubicuitinación mediante Western-blot y la actividad de los proteasomas mediante un ensayo in vitro de quimioluminiscencia y un experimento de "pulso" y "caza", puesto que es la principal vía no lisosomal de degradación intracelular de proteínas, y podría modular su actividad ante defectos en las vías lisosomales; g) los niveles de ROS y sus consecuencias en el ciclo celular, ambos, mediante citometría de flujo; h) los niveles de fosforilación mediante Western-blot de diversas proteínas implicadas en la regulación por hormonas y nutrientes de la macroautofagia, como Akt, ERK1/2, p38α y de dos sustratos de la quinasa mTOR que ocupa un puesto central en esta regulación, p70 S6K y 4EBP1. Todos estos ensayos se han realizado tanto en situación de ayuno, en la que se activa la macroautofagia, como añadiendo insulina y aminoácidos (hormona y nutrientes) para disminuir esta actividad. Para estudiar las alteraciones en el tráfico vesicular (Objetivo 2), hemos utilizado las siguientes aproximaciones: a) el estudio de la macropinocitosis a través del análisis mediante citometría de flujo de la cinética de incorporación de FITC-dextrano; b) el estudio de la endocitosis mediada por receptor, analizando de forma separada los procesos de fosforilación, internalización, reciclaje y degradación del receptor de crecimiento epidérmico, utilizando técnicas de citometría de flujo y Western-blot; c) el estudio del transporte de las enzimas lisosomales desde la red trans del Golgi mediante el receptor de manosa-6-fosfato independiente de cationes, analizando la estabilidad de los componentes de dicho receptor mediante Western-blot; d) el estudio del reciclaje del receptor hacia la red trans del Golgi por parte del retrómero, analizando la estabilidad de sus componentes mediante Western-blot, así como la colocalización del receptor de manosa-6-fosfato independiente de cationes, y la red trans del Golgi mediante experimentos de colocalización, utilizando la microscopía de fluorescencia con anticuerpos específicos frente a estos componentes. Las conclusiones de este trabajo son: De las dos principales vías de degradación intracelular de proteínas, solo la macroautofagia es defectuosa en las líneas celulares de pacientes con lipofuscinosis ceroideas neuronales infantil tardía (CLN2) y juvenil (CLN3). En cuanto a las principales vías endocíticas estudiadas, solo la macropinocitosis está reducida en ambas líneas de pacientes. En los fibroblastos de pacientes se produce una menor formación de autofagosomas que coincide con una mayor activación de la vía Akt-mTOR, especialmente en los fibroblastos CLN2. En los fibroblastos CLN3, el pH lisosomal es mayor en aproximadamente 0,5 unidades que en los fibroblastos control o CLN2. Como consecuencia de esto, la maduración de autofagosomas, el transporte vesicular y la maduración de las enzimas lisosomales están disminuidos en aquellas células. Asimismo, la actividad de la enzima TPP1, cuyo pH óptimo es muy ácido, disminuye en aproximadamente un 60 % en los fibroblastos CLN3 en comparación con los controles. En los fibroblastos CLN2 están más activadas las quinasas p38α y ERK1/2, son mayores los niveles de ROS y es menor la actividad de la catalasa en comparación con los fibroblastos control o CLN3. Esto, junto a la prácticamente total ausencia de la actividad de TPP1, podría explicar la aparición más temprana de la sintomatología en la variante infantil tardía.