Continued population growth in the last century has created the need to increase food production. However, pests and diseases destroy about a third of crops during production, transport and storage. In these circumstances the use of pesticides that control the action of pests is essential. [1] The use of pesticides has provided indisputable economic benefits because they increase agricultural productivity and reduce labour force as well as food costs. Along with the benefits of agricultural use, the use of pesticides have also benefited the field of health, where they have contributed to the control and even eradication in some areas, vector-borne diseases [2]. All of that, coupled to their synthesis is economical, their excellent chemical stability and toxicological risk to human health and the environment has become evident relatively late, it has led to its widespread and indiscriminate use. [3] Pesticides are not selective to the pest that seek to control and affect not only the vectors associated with this, but also to other species, causing imbalances in ecosystems. According to some studies carried out in the USA, among the 500 million kilos of pesticides used annually, only 1% of the products reach the harmful organisms which they are intended. The other 99% remains in ecosystems, they are transferred to the atmosphere by volatilization, to the soil and to the groundwater [4]. While PPPs increase food production, the negative effects on the environment are undeniable. From surface water, pesticides enter the lower levels of the food chain at low concentrations, they bioaccumulate in each trophic level and they biomagnify successively up to the top of the food chain (raptors, fish or mammalian predators ), where they reach concentrations between 10 and 100 times higher than the originals. This bioaccumulation affects biodiversity causing a decline in their populations, since all members of the food chain are exposed to sublethal concentrations causing effects on individuals that can be undetected or severe damage affecting their reproduction and survival. Chemicals found in pesticides penetrate into waterways due to the diffusion of the spray. The degree and extent of diffusion depends on external climatic factors such as ambient temperature and rainfall and winds. The rain mobilizes pesticides from the place where they were applied of surface runoff or infiltration phenomena through the soil into groundwater. As rain, irrigation increases the leaching degree, decreasing the amount of pesticide that it is volatilized from the ground. Excessive irrigation can leach pesticides directly into the aquifer. Part of pesticides evaporate passing air or joining soil particles, such as dust or steam. They can be transported long distances and be deposited again on the ground or surface water through rainfall. In recent decades, there has been growing concern about the conservation of natural resources from a sustainable perspective and the availability of water has become a major issue of concern to all governments. This widespread contamination of aquatic ecosystems and soil has led to the adoption of restrictive legislative measures by the European Union: • The Water Framework Directive (WFD) (Directive 2000/60 / EC) provides the basis for regulating water resources in order to preserve, protect and improve its quality and sustainable use [5]. • Decision 2455/2001/EC, establish a list of 33 priority substances to be controlled, a third part of which are pesticides [6]. • Directive 2008/105 / EC defines environmental quality standards (EQS), the annual average (MA) and the maximum allowable concentrations (MAC) in surface waters to the list of priority substances mentioned above. Although many pesticides are currently included in this list in the regulations of the European Union (EU), many others are not still regulated [7]. • Directive 98/83/EC sets limits for pesticides in water intended for human consumption (100 ng/L for individual pesticides and 500 ng/L for the sum of all pesticides) [8]. The Mediterranean watersheds are subjected mainly to pressures from the expansion and human development in its various expressions (agricultural, industrial, urban ...). The climate change models conclude that the Mediterranean region will be the most impacted in next years and the consequences of global change will affect both the availability and the quality of water. Although these contaminants are usually found at trace levels in aquatic environments, it is important to know their distribution and evolution in the environment to control and evolution, since chronic exposure to these low doses may suppose a threat to the aquatic biota and human health [9]. Above mentioned shows that the analysis of pesticide residues is a crucial instrument for human and environmental protection. This situation creates the need for greater efforts in the development of rapid and versatile methodologies for the detection of emerging contaminants and their potential metabolites in environmental matrices [10]. Studies on the impact of emerging contaminants in the Iberian Peninsula are scarce [11-16]. In general, in Europe there are few studies that determine the occurrence of currently used pesticides in environmental compartments other than water and most of them are erratic sampling performed to demonstrate the reliability of an analytical method, but not systematic studies evaluating pesticide occurrence and levels in a River Basin [17-20]. These studies, without being many, are more prevalent in the United States [21-28]. The low number of publications related to the presence of pesticides in sediments and biota, in part is due to the lack of NCA for organic contaminants in these matrices, including pesticides and the difficulty of extraction. Sediment and fish are complex and variable matrices, due to the strong interactions between analytes and the different sample constituents (organic matter and clay sediment, fats and proteins in fish), turning both matrices into a deposit of these compounds that difficult their extraction [29]. According to the existing environmental requirements, the overall objective of this thesis was defined, based on providing an overview of the water quality from representative Mediterranean River Basins from the Iberian Peninsula, as well as toxicological risk assessment of pesticides on biota (algae and bacteria, macroinvertebrates and fish). As a result, this thesis aims to contribute to the knowledge of the Mediterranean basin functionality, and its resilience to the impact of human activities, as well as, be useful as a solid foundation for the development and planning strategies and more suitable for the recovery and protection of Mediterranean ecosystems distributed across the earth, taking as a study case the presence of pesticide residues methodologies. Therefore, the methodology used in the preparation of this thesis was: 1 To develop and validate analytical methodologies based on solid phase extraction (SPE), QuEChERS (acronym for Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe) and pressurized liquid extraction (PLE) followed by liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) using a triple quadrupole analyzer and quadrupole time of flight for the determination of pesticides in water, sediments and fish samples. 2 To study concentrations, distribution and fate of these contaminants in Mediterranean river ecosystems from the Iberian Peninsula (Guadalquivir, Llobregat and Turia) trying to determine the source and pattern of distribution of these compounds. 3 To assess the hazard derived from the presence of these pollutants for the aquatic fauna, based on the available toxicological data of pesticides. The target organisms were those belonging to the three levels of the food chain to obtain a whole picture of the potential impact of these substances to the aquatic environment. For this, publications that make up this thesis have been divided into 9 chapters that can be grouped into three blocks: • Chapters 1-5, focuses on the development of analytical methods that solve the challenges in pesticide residues analysis. • Chapters 6-8 bases on the application of the methodology previously developed on several Mediterranean riverine ecosystems from the Iberian Peninsula, through a survey in which more than 40 pesticides were analyzed during 2010 and 2011 campaigns. To evaluate the main stressors in these basins a network of representative sampling points covering the most affected areas from the point of view of the chemical, hydrological, morphological and ecological was established, as well as, reference sites in which higher quality was expected. • Chapter 9 focuses on the study of models on the behavior of pesticides in the Mediterranean basins. The purpose of each chapter is detailed below: Chapter 1 is a general introduction in which different aspects are addressed. Firstly, a critical overview of the current workflow within pesticide residue analysis by LC–MS because the many reviews that treat this topic are more general and focus not only on LC–MS but on a sort of techniques. Special attention is paid to provide comprehensive coverage of ultimate innovations in the field. Finally, possible future trends and developments in this area are briefly discussed. Chapters 2 to 9 presents the experimental work undertaken in this PhD, compiled in the form of publications, which was planned and designed in order to achieve the proposal objectives. In chapter 2, 60 samples of surface and wastewater are analyzed by LC-triple quadrupole (QqQ) MS/MS and LC-quadrupole time of flight (QqTOF)-MS/(MS) after conventional SPE to investigate whether the combined use of both systems is useful in the routine performance of the systematic determination of pesticide residues. Chapter 3 This study goes an step forward into the analytical strategies developed for quantitative and non-quantitative non-target screening of contaminants using a last generation LC–QTOF-MS (ABSciex TripleTOF™ 5600) by ion extraction in front of a database of more than 2000 compounds with accurate mass information and, if available, retention times. An information dependent acquisition (IDA) methods allow to obtain automatically MS/MS spectra of the most intense precursor ions (without previous selection) to additionally confirm the identity of the detected compounds by MS/MS library searching. Furthermore, for the first time and in order to identify relevant unexpected contaminants for the water systems and define changes in the water fingerprints, statistical data analysis using principal component analysis (PCA) and principal components variable grouping (PCVG) was combined with empirical formula calculation, online database (chemspider or other internet databases) searching, and MS/MS fragment ion interpretation to successfully detect unknown contaminants as an insight within environmental forensics. Last but not least, the quantitative capabilities of the system were explored for 42 currently used pesticides, the determination of which was validated according to the European guidelines [35]. The possibility to limit the analysis to one instrument will provide advantages in terms of saving time and cost of the determination. In Chapter 4, an analytical method is developed for in-tube solid phase microextraction (IT-SPME) coupled to ultra high pressure-chromatography electrospray - tandem mass spectrometry (UHPLC-QqQ-MS/MS) for the multi-residue analysis of nine priority substances covered by Directive 2008/105/EC in inland surface waters. This procedure has been chosen to reach selectivity and sensitivity necessary to determine organic pollutants in water samples. by coupling a technique that needs relatively low pressure, and UHPLC that operates to relatively high pressure. The new coupling is compared with the previously established IT-SPME and Capillary Liquid Chromatography (CapLC). Chapter 5 describes, evaluates and compares two extraction methods −PLE and QuEChERS− to establish the most suitable technique for the extraction of 50 pesticides in soils, sediments and sludges. The determination was carried out using liquid chromatography-triple quadrupole-mass spectrometry (LC-MS/MS).The QuEChERS and LC–MS/MS were advantageous and was further applied for the first time to determine the pesticide residues in soil, sediment and sludges collected during a monitoring campaign in Turia River Basin. In Chapter 6, pesticide concentrations have been analysed in the influent, effluent and dehydrated sludge from main STPs located along the rivers Ebro, Guadalquivir, Jucar and Llobregat. With these data, removal efficiencies of such STPs have been calculated and reported. The final objective of this study is to improve the knowledge about the causes of aquatic environments contamination considering the STPs as point sources of contaminants such as pesticides. In Chapter 7, 50 currently used pesticides are monitored in two consecutive years (2010 and 2011) in water, sediment and biota (only 2010) in the Guadalquivir River Basin. This is the first extensive pilot study undertaken in this Spanish River Basin and it intends to improve the knowledge of these pesticides occurrence in the aquatic environment. The concentrations of currently-used pesticides associated with sediments and biota can also ascertain which pesticides are more likely to partition to the suspended sediment phase, or to bioaccumulate in the aquatic trophic chain, and this information will be useful for other watersheds where these compounds are applied. In chapter 8, an extensive monitoring (including 50 pesticides) has been developed in two consecutive campaigns (2010–2011) in surface water, wastewater effluents, sediment, and biota samples along the entire course of the Llobregat River and its tributaries, with the purpose of establishing pesticide occurrence and distribution. The results obtained by this monitoring were compared with historical data gathered during other monitoring programs in this river basin to describe trends in water quality status and determine potential risks for human health. This is the first time that a so extensive number of pesticides (i.e. 50 active ingredients) is determined in the basin; (ii) three environmental compartments (i.e. water/sediment/biota) were studied for the first time, because most of the previous studies were restricted to water, and (iii) the contamination levels of the Llobregat River were reviewed only once, dealing with the presence and biological effects of any type of emerging contaminants. Thus, it is also the first time that data related to pesticide occurrence in this river have been assembled and compared in a detailed way. Furthermore, the results of this study can be widely applicable to other basins that follow the hydrological pattern of the Mediterranean rivers and suffer the increasing effect of climate change. Finally, in Chapter 9 the driving forces of the processes involved in the movement of pesticides in some Italian and Spanish regions are identified. In addition, tools are being developed to simulate the behavior of pesticides at different scales in order to define pesticide use permission (or restrictions) at a regional level, planning monitoring programs, optimizing the study budget by focusing sampling in the areas where higher pesticide concentrations are likely to be found. The results of this thesis have contributed to the development of more sensitive and reliable analytical methods, as well as the advancement of knowledge about the distribution of these toxic compounds in the environment. According to the objectives of this thesis, the research carried out and the results described in the previous chapters, the following conclusions can be outlined: 1 The combination of liquid chromatography tandem mass spectrometry using a triple quadrupole (LC-QqQ-MS / MS) and quadrupole time of flight (QTOF UHPLC-MS) proved to be a feasible and efficient way the systematic pesticide residue determination. Analyzer Triple Quadrupole (QqQ) is able to detect more pesticides because of its higher sensitivity, while analyzer time of flight (QTOF MS) can identify other contaminants also present in the samples, such as pharmaceuticals ( Valsartan and Irbesartan) not selected a priori. 2 Liquid chromatography coupled with a quadrupole time-of-flight spectrum acquisition dependent information product ions (LC-MS-QqTOF on IDA-MS / MS) automated for the qualitative and quantitative analysis allowed the simultaneous determination of 43 pesticides and identification of a large number of non-target pesticides and pharmaceutically active compounds in wastewater and river water samples. The method has been demonstrated to be a very simple, fast, and viable alternative for routine monitoring of organic contaminants in waters in one run. 3 The sample preparation by solid phase extraction is suitable, simple and fast, and covers a large variety of substances with different polarity. All samples contained pesticides, some of them exceeding 0.5 mg L -1 concentration. These results highlight the consistent and good sensitivity and the high identification power that can be achieved using the developed method. 4 The coupling of solid phase microextraction "tube" (IT-SPME) with liquid chromatography tandem mass spectrometry (UHPLC-MS / MS) for identification and quantification of organic pollutants in water samples provided good accuracy and reproducibility (RSD <20%), high enrichment factor (ca. 15) and linear response (r> 0.99). The system allows the on-line enrichment of the analytes in the range of low parts per billion as it increases sensitivity 100 times approximately compared with direct injection 5 μL water sample in chromatograph. However, it is less robust than the solid phase extraction to determine a wide range of pesticides (> 20), because extraction and determination coupling must be done manually. 5 Comparison of extraction Quechers and pressurized liquid (PLE) for simultaneous extraction of 50 pesticides in soils, sediments and sludges showed that the efficiency and efficacy of optimized Quechers for sediment demonstrated to be superior to PLE, reducing time consuming and increasing throughput. 6 The study of pesticides in influent, effluent and dehydrated sludges in wastewater treatment plants from main Spanish River Basins reveals the presence of pesticides and low efficiency in removal. Accordingly, sewage treatment plants can be considered a focal point of contamination to surface waters. 7 The presence of pesticides was monitored in samples of water, sediments and biota in the Guadalquivir and the Llobregat River Basin for two consecutive years (2010 and 2011). In both, pesticides were detected mainly in water, where they appeared almost continuously. Their presence in sediments was much more intermittent and rather scarce in biota. Organophosphorus insecticides and triazine herbicides were predominant in both river basins. 8 The study reveals that the Guadalquivir organophosphorus (malathion, chlorpyrifos, diazinon), carbamates (methiocarb) and triazines (terbuthylazine, deisopropilatrazina) families were detected with highest frequency and concentration in both periods. The transformation products of atrazine and terbuthylazine were found at higher concentration than the parent compounds, as a result of their degradation process. The spatial distribution of pesticides showed that the sampling sites located in Jaén and Córdoba are dominated by insecticides and herbicides used in olive cultivation while other provinces contain a complex mixture of all pesticides studied, which reflect differences in crop patterns. 9 The predominant pesticides in the Llobregat (in terms of frequency and concentration) were benzimidazoles (carbendazim), organophosphorus (malathion, chlorpyrifos), triazines (2-hydroxy-terbuthylazine, simazine), neonicotinoids (imidacloprid) and triazoles (tebuconazole). The levels are higher at the confluence of the rivers Llobregat and Anoia. This is an agricultural area, mainly with vineyards. 10 Comparison of the results of this study with historical data confirm the existence of background contamination in the river Llobregat in the last 20 years and periodic monitoring on the environmental quality status of the river in combination with previous data will assist in controlling the contamination of the river basin and ascertain the effect of different physicochemical parameters. 11 The temporal distribution during both sampling campaigns could be related to the river flow. Low-medium flow compared to high one produced an increasing of the concentration in water and sediments. In both River Basins several pesticides exceeded the limit of 0.1 µg L-1 for individual compounds. Sampling sites GUA-3 and ANO-3, located in Guadalquivir and Llobregat rivers respectively, exceeded the limit of 0.5 µg L-1 for the sum of pesticides under a medium-low flow. 12 Different patterns of pesticide contamination in different flow conditions were revealed that can affect toxicity to biota. Although the RQ values showed low risk of toxicity from the presence of pesticides in water, the bioaccumulation of chlorpyrifos and diazinon, lipophilic pesticides (Kow> 3) in fish, highlight the need of alternative and complementary approaches to that provided by the simple compliance with the environmental quality standards (EQS). 13 A study was conducted in the Turia River on the possible infiltration of triazines and ureas of surface water to groundwater. These data were compared with vulnerability maps obtained by the Geographic Information System (GIS) in the area for these herbicides. The studied wells are characterized by a level of vulnerability different to the GIS models predicted. The results suggest the existence of additional factors to the level of vulnerability of soils. These results were compared with those obtained in various regions from Italy on groundwater aquifer vulnerability to glyphosate (according to GIS models, this herbicide should not leach). Both studies confirm the importance of the integration between monitoring data and modeling in order to highlight cases in which the behavior does not conform to that predicted by the model and specific problems related to poor agricultural practices and territory specificities.El continu creixement demogràfic de la població en l'últim segle ha creat la necessitat d'incrementar la producció d'aliments. No obstant això, les plagues i malalties destrueixen prop de la tercera part de les collites durant la seua producció, transport i emmagatzematge. Davant aquestes circumstàncies la utilització de plaguicides que controlen l'acció de les plagues és imprescindible.[1] La utilització de productes fitosanitaris ha aportat indiscutibles beneficis econòmics ja que augmenten la productivitat agrícola, i disminueixen la mà d'obra així com també el cost dels aliments. Junt amb els avantatges derivats del seu ús agrícola, la utilització de plaguicides també ha beneficiat el camp de la sanitat, on han contribuït al control i, fins i tot, l’eradicació en algunes zones de malalties transmeses per vectors [2]. A tot això, si afegim que la seua síntesi és econòmica, la seua estabilitat química excel•lent i el seu risc toxicològic per a la salut humana i el medi ambient s'ha evidenciat relativament tard, que, a més a més, ha provocat el seu ús massiu i indiscriminat. [3] Els plaguicides no són selectius a la plaga que pretenen controlar, i afecten no solament als vectors relacionats amb aquesta, sinó que també a altres espècies, provocant desequilibris en els ecosistemes. A partir dels estudis realitzats als Estats Units d'Amèrica (EUA), dels 500 milions de quilos de plaguicides utilitzats anualment només l'1 % dels productes arriba als organismes nocius als quals van destinats. El 99 % restant roman en els ecosistemes, es transfereixen a l'atmosfera per volatilització, al sòl i als aqüífers [4]. Si bé els productes fitosanitaris augmenten la producció d'aliments, els efectes negatius en el medi ambient són indiscutibles. Des de les aigües superficials els plaguicides entren en els nivells més baixos de la cadena alimentària en concentracions baixes, es van bioacumulant en cada nivell tròfic i es biomagnifiquen successivament fins a arribar a la part més alta de la cadena tròfica (aus rapaços, peixos o mamífers depredadors), on aconsegueixen concentracions entre 10 y 100 vegades més altes que les originals. Aquesta bioacumulació afecta la biodiversitat ocasionant una disminució en les seues poblacions, ja que tots els integrants de la cadena tròfica estan exposats a concentracions subletals que provoquen efectes en els individus que poden anar des d'indetectables fins a seriosos danys que afecten la seua reproducció i supervivència. Els productes químics que es troben en els fitosanitaris penetren en les vies fluvials per efecte de la difusió de la polvorització. El grau i extensió de la difusió depén de factors climàtics externs com la temperatura ambient i el règim de pluges i de vents. La pluja mobilitza els plaguicides del lloc on es van aplicar per fenòmens d'escolament superficial o per infiltració a través del sòl cap a les aigües subterrànies. Igual que la pluja, el reg incrementa el grau de lixiviació disminuint la quantitat de plaguicida que es volatilitza des del sòl. Un excés de reg pot percolar els plaguicides directament en l'aqüífer. Part dels plaguicides s'evaporen passant a l'aire o unint-se a les partícules del sòl, com a vapor o com a pols. Poden ser transportats grans distàncies i novament ser depositats sobre la terra o aigües superficials a través de les pluges. En les últimes dècades, ha augmentat la preocupació per la conservació dels recursos naturals des d'una perspectiva sostenible i la disponibilitat de l'aigua s'ha convertit en una qüestió important que preocupa tots els governs. Esta contaminació generalitzada dels ecosistemes aquàtics i del sòl ha obligat a l'adopció de mesures legislatives restrictives per part de la Unió Europea: • Directiva Marc de l'Aigua (DMA) (Directiva 2000/60/CE), estableix les bases per a regular els recursos hídrics amb l'objectiu de preservar, protegir i millorar la seua qualitat i el seu ús sostenible [5]. • Decisió 2455/2001/CE, estableix una llista de 33 substàncies prioritàries que han de ser controlades, la tercera part de les quals són plaguicides [6]. • Directiva 2008/105/CE defineix les normes de qualitat ambiental (NQA), mitjana anual (MA) i concentracions màximes admissibles (CMA) en les aigües superficials per a la llista de substàncies prioritàries abans mencionades. Encara que diversos plaguicides estan inclosos actualment en esta llista en els reglaments de la Unió Europea (UE), molts altres encara no estan regulats [7]. • Directiva 98/83/CE, estableix límits per als plaguicides en les aigües destinades al consum humà (100 ng/L per als plaguicides individuals i 500 ng/L per a la suma de tots els plaguicides) [8]. Les conques hidrològiques mediterrànies estan sotmeses principalment a pressions que provenen de l'expansió i el desenvolupament humà en les seues diferents expressions (agrícola, industrial, urbà...). Els models de canvi climàtic conclouen que les regions mediterrànies seran les més impactades en els pròxims anys i les conseqüències del canvi global afectaran tant a la disponibilitat com a la qualitat de l'aigua. Encara que aquests contaminants es troben generalment a nivell de traça en els ambients aquàtics, és important conéixer la seua distribució i evolució en el medi ambient per al seu control i evolució, ja que l'exposició crònica a aquestes dosis baixes pot suposar una amenaça per a la biota aquàtica i la salut humana [9]. Tot el que hem dit fins ara posa de manifest que l'anàlisi de residus de plaguicides representa un instrument fonamental per a la protecció humana i del medi ambient. Aquesta circumstància, crea la necessitat de realitzar un major esforç en el desenvolupament de metodologies ràpides i versàtils que permeten la detecció de contaminants emergents i els seus possibles metabòlits en matrius mediambientals [10]. Els estudis sobre la incidència dels contaminants emergents en la Península Ibèrica són escassos [11-16]. En general, a Europa hi ha pocs estudis que determinen l'aparició dels plaguicides utilitzats en l'actualitat en els distints compartiments ambientals diferents de l'aigua i la majoria d'ells són mostrejos erràtics realitzats per a demostrar la fiabilitat d'un mètode d'anàlisi, però no estudis sistemàtics que avaluen la incidència i els nivells de plaguicides en una conca hidrogràfica [17-20]. Aquests estudis, tot i que no tenim molts antecedents, són més freqüents als EUA [21-28]. L'escàs nombre de publicacions relacionades amb la presència de plaguicides en sediments i biota són a conseqüència, en part, de la falta de NQA per als contaminants orgànics en aquestes matrius, inclosos els plaguicides i a la dificultat de la seua extracció. Els sediments i els peixos són matrius variables i molt complexes, a causa de les fortes interaccions que enllacen els anàlits amb els diferents constituents de la mostra (matèria orgànica i argiles en sediments; greixos i proteïnes en els peixos), convertint a aquestes dues matrius en un dipòsit d'aquests compostos i dificultant la seua extracció [29]. Atenent a les necessitats mediambientals existents es va definir l'objectiu global d'aquesta tesi doctoral, basada en oferir una visió general de la qualitat de les aigües de les conques mediterrànies representatives de la Península Ibèrica, així com l'avaluació del risc toxicològic dels plaguicides sobre la biota (algues i bacteris, macroinvertebrats i peixos). Tot i això, aquesta tesi doctoral pretén contribuir al coneixement de la funcionalitat de les conques mediterrànies, i de la seua capacitat de recuperació enfront de l'impacte de les activitats humanes, a més a més, de ser útil com una base sòlida per al desenvolupament i la planificació d'estratègies i metodologies més adequades per a la recuperació i protecció dels ecosistemes mediterranis distribuïts per tot el planeta, prenent com a cas d'estudi la presència de residus de plaguicides. Per tant, la metodologia utilitzada en l'elaboració d'aquesta tesi és: 1. Desenvolupament i validació de metodologies analítiques basades en l’extracció en fase sòlida (SPE), la metodologia QuEChERS (acrònim de Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe) i l’extracció amb líquids pressuritzats (PLE) seguida de cromatografia líquida acoblada a espectrometria de masses en tàndem (LC-MS/MS), utilitzant un analitzador de triple quadrupol així com quadrupol temps de vol, per a la determinació de plaguicides en mostres d'aigua, sediments i peixos. 2. Estudiar les concentracions, distribució i destí d'aquests contaminants en ecosistemes fluvials mediterranis de la Península Ibèrica (Guadalquivir, Llobregat i Túria) tractant de determinar l'origen i el patró de distribució d'aquests compostos. 3. Avaluar l'amenaça que suposen aquests compostos per a la fauna aquàtica, basat en les dades toxicològiques disponibles de plaguicides. Els organismes diana pertanyien als tres nivells de la cadena tròfica, per a obtindré una imatge completa del potencial d'impacte d'aquestes substàncies per al medi aquàtic. Per al seu desenvolupament, les publicacions que conformen aquesta tesi s'han distribuït en 9 capítols que es poden agrupar en tres blocs: • Capítols 1-5, enfocats a la posada a punt dels mètodes analítics que resolguen els reptes que dificulten l'anàlisi de residus de plaguicides. • Capítols 6-8, basats en l'aplicació de la metodologia anteriorment desenvolupada sobre diversos ecosistemes fluvials mediterranis de la Península Ibèrica, a través d'una enquesta de seguiment realitzada en les campanyes 2010 i 2011, en què es van analitzar més de 40 plaguicides emprats en l'actualitat. Per tal d’avaluar els principals factors d'estrés d'aquestes conques es va establir una xarxa de punts de mostreig representatius que cobrien les zones més afectades des del punt de vista de la indústria química, hidrològic, morfològic i ecològic, així com els llocs de referència en els quals s'esperava major qualitat. • Capítol 9 se centra en l'estudi de models sobre el comportament dels plaguicides en les conques mediterrànies. A continuació, detallrem l'objectiu de cada capítol: El capítol 1 és la introducció general en la qual abordarem diferents aspectes. En primer lloc oferirem una visió crítica de l'actual flux de treball dins de l'anàlisi de residus de plaguicides per LC-MS, perquè moltes de les revisions que tracten aquest tema són més generals i se centren en altres tipus de tècniques, a més de LC-MS. També prestarem especial atenció a proporcionar una cobertura completa de les últimes innovacions dins d´aquest camp. Finalment, analitzarem breument les possibles tendències futures i desenvolupaments en aquesta àrea. Dels capítols 2 al 9 recollirem el treball experimental realitzat durant el doctorat, recopilats en forma de publicacions, el qual va ser planificat i dissenyat per tal d’aconseguir els objectius proposats. En el capítol 2 analitzarem més de 60 mostres d'aigües superficials i residuals per LC-triple quadrupol (QqQ)-MS/MS i LC-quadrupol temps de vol (QqTOF)-MS/(MS) després d'una SPE convencional, per tal d´investigar si l'ús combinat dels sistemes és útil en la realització rutinària de la determinació sistemàtica de residus de plaguicides. En el capítol 3 farem un pas endavant en les estratègies analítiques desenvolupades per a l’anàlisi no dirigit quantitatiu i no quantitatiu de contaminants utilitzant l'última generació LC-QqTOF-MS (ABSciex TripleTOFTM5600) mitjançant l'extracció dels ions amb una exactitud de massa de 20 mDa d'acord a una base de dades de més de 2.000 compostos amb informació de massa exacta i, si estan disponibles, els temps de retenció. Un mètode d'informació d'adquisició depenent (IDA) permet obtenir automàticament espectres MS/MS dels ions precursors més intensos (sense selecció prèvia). D'altra banda, per primera vegada, i amb la finalitat d'identificar contaminants rellevants inesperats per als sistemes d'aigua i definir canvis en les empremtes dactilars d'aigua, anàlisi de dades estadístiques utilitzant l'anàlisi de components principals (PCA) i els components principals agrupació variables (PCVG), es va combinar amb càlcul de la fórmula empírica, cercada en base de dades en línia (chemspider o altres bases de dades d'Internet), i la interpretació de fragments d'ions MS/MS per a detectar amb èxit contaminants desconeguts com una visió dins dels forenses ambientals. Finalment, les capacitats quantitatives del sistema van ser explorades per a 42 plaguicides utilitzats en l'actualitat, la determinació dels quals va ser validada d'acord amb les directrius europees. La possibilitat de limitar l'anàlisi a un sol instrument proporcionarà avantatges en termes d'estalviar temps i costos. En el capítol 4, desenvoluparem un mètode analític per microextracción fase sòlida “en tub” acoblat a cromatografia d'ultra alta pressió- electrospray - espectrometria de masses tàndem (UHPLC-QqQ-MS/MS) per a l´anàlisi multiresidu de nou substàncies prioritàries incloses en la Directiva 2008/105/CE en aigües superficials continentals. Es mostra per primera vegada un procediment que permet aconseguir la selectivitat i la sensibilitat necessària per a determinar contaminants orgànics en mostres d'aigua, mitjançant l´acoblament d´una tècnica que necessita una pressió relativament baixa [prèviament microextracció en fase sòlida en-tub (IT-SPME)], i una altra que opera a una pressió relativament alta (UHPLC). El nou acoblament es compara amb l’establert IT-SPME i Cromatografia Líquida capil•lar (CapLC). En el capítol 5 descriurem, avaluarem i compararem els procediments PLE i QuEChERS per a l'extracció de 50 plaguicides en sòls, sediments i fangs i la seua posterior determinació mitjançant LC-MS /MS. La combinació QuEChERS amb LC-MS/MS, va ser la més avantatjosa i es va aplicar per primera vegada per a determinar els residus de plaguicides en sòls, sediments i fangs de la conca del riu Túria. En el capítol 6 analitzarem les concentracions de plaguicides en l’influent, efluent i fangs deshidratats de les principals estacions depuradores d’aigües residuals (EDARs) situades al llarg dels rius Ebre, Guadalquivir, Xúquer i Llobregat a Espanya. Amb aquestes dades, es calculen i relaten les eficiències d'eliminació d´aquestes EDARs. L´objectiu final d'aquest estudi és millorar el coneixement sobre les causes de la contaminació dels ambients aquàtics considerant les EDARs com a fonts puntuals de contaminants com són els plaguicides. En el capítol 7 monitoritzem la concentració de plaguicides en aigua, sediments i biota (només 2010) de la Conca Hidrogràfica del Guadalquivir. Aquest és el primer estudi pilot dut a terme en aquesta extensa conca hidrogràfica espanyola i té la intenció de millorar el coneixement de la incidència d'aquests plaguicides en el medi ambient aquàtic. Les concentracions dels plaguicides utilitzats en l'actualitat associats als sediments i la biota també poden determinar quins plaguicides tenen més probabilitat de repartir-se en la fase de sediments en suspensió, o de bioacumular-se en la cadena tròfica aquàtica, i aquesta informació serà útil per a altres conques on aquests compostos són aplicats. En el capítol 8 analitzarem les concentracions de plaguicides en mostres d'aigua superficial, efluents d'aigües residuals, sediments i biota (només) al llarg de tot el curs del riu Llobregat i els seus afluents, amb la finalitat d'establir la incidència dels plaguicides i la seua distribució. Els resultats obtinguts en aquest seguiment es van comparar amb les dades històriques recopilades durant altres programes de monitoreig en aquesta conca per a descriure les tendències en l'estat de la qualitat de l'aigua i determinar els riscos potencials per a la salut humana. Aquesta és la primera vegada que (i) es determina un nombre tan elevat de plaguicides a la conca, (ii) s´estudien tres compartiments ambientals (aigua / sediments / biota) i (iii) les dades relacionades amb la incidència dels plaguicides en aquest riu s'han recopilat i comparat d'una manera detallada. A més a més, els resultats d'aquest estudi són àmpliament aplicables a altres conques que segueixen el patró hidrològic dels rius mediterranis i que pateixen l'efecte del canvi climàtic en augment. Finalment, en el capítol 9 identificarem les forces impulsores dels processos involucrats en el moviment de plaguicides en algunes regions italianes i espanyoles. A més a més, es desenvolupen eines per a simular el comportament dels plaguicides a diferents escales amb l´objectiu de definir els permisos d'ús de plaguicides (o restriccions) a nivell regional, planificant programes de seguiment, optimitzant el pressupost dels estudis al centrar el mostreig en les àrees on és probable que es troben les concentracions de plaguicides més altes. Els resultats d'aquesta tesi han contribuït al desenvolupament de mètodes analítics més sensibles i fiables, així com, a l'avanç en el coneixement sobre la distribució d'aquests compostos tòxics en el medi ambient. D'acord amb els objectius de la present tesi doctoral, la recerca duta a terme i els resultats descrits en els capítols previs, podem destacar les següents conclusions: 1. La combinació de cromatografia líquida espectrometria de masses en tàndem utilitzant un triple quadrupol (LC-QqQ-MS/MS) i/o un quadrupol temps de vol (UHPLC-QTOF MS) va resultar viable i eficient per a la determinació sistemàtica de residus de plaguicides. L'analitzador de triple quadrupol (QqQ) és capaç de detectar més plaguicides en les mostres a causa de la seua major sensibilitat, mentre que l'analitzador temps de vol (QTOF MS) permet identificar altres contaminants també presents en les mostres, com són els productes farmacèutics (valsartan i irbersartan), no seleccionats a priori com a compostos diana del mètode. 2. La cromatografia líquida combinada amb un quadrupol temps de vol amb adquisició de l'espectre dels ions producte depenent de la informació (LC-MS-QqTOF en IDA-MS/MS) automatitzada per a l'anàlisi qualitatiu i quantitatiu va permetre la determinació simultània de 43 plaguicides i la identificació d'un gran nombre d'altres plaguicides i compostos farmacèuticament actius no seleccionats en l'anàlisi dirigida en mostres d'aigües residuals i de riu. El mètode és una alternativa simple, ràpida i viable per al control rutinari de contaminants orgànics en aigües, útil per a la detecció d'un nombre il•limitat de contaminants sense necessitat de realitzar diverses anàlisis. 3. La preparació de la mostra mitjançant extracció en fase sòlida és convenient, simple i ràpida i cobreix una gran varietat de substàncies amb diferent polaritat. Totes les mostres analitzades contenien plaguicides, alguns d'ells en concentració superior a 0,5 µg L-1. Aquests resultats posen de manifest la coherència, bona sensibilitat i l'alt poder d'identificació del mètode desenvolupat. 4. L'acoblament de microextracció en fase sòlida “en tub” (IT-SPME) amb cromatografia líquida espectrometria de masses en tàndem (UHPLC-MS/MS) per a la identificació i quantificació de contaminants orgànics en mostres d'aigua va proporcionar bona precisió i reproductibilitat (RSD < 20%), alt factor d'enriquiment (ca. 15) i resposta lineal (r > 0.99). El sistema permet l'enriquiment on-line dels anàlits en el rang de ppt (ng L-1), ja que augmenta la sensibilitat aproximadament 100 vegades en comparació de la injecció directa en el cromatògraf. No obstant això, atés que l'acoblament de l'extracció i la determinació s'ha de realitzar manualment, és menys robust que l'extracció en fase sòlida quan es vol aplicar a la determinació d'un ampli rang de plaguicides (>20). 5. La comparació de l'extracció amb QuEChERS i amb líquids pressuritzats (PLE) per a l'extracció simultània de 50 plaguicides en sòls, sediments i fangs va demostrar que l'eficiència i l'eficàcia del mètode QuEChERS optimitzat per a sediments es superior a la de PLE, permetent reduir el temps i el cost de l'anàlisi, així com augmentar el rendiment. 6. L'estudi de la presència de plaguicides en influents, efluents i fangs deshidratats en les plantes de tractament d'aigües residuals de les principals conques hidrogràfiques espanyoles posa de manifest la presència de plaguicides i la baixa eficàcia en la seua eliminació. A causa d'aquestes baixes eficiències d'eliminació es poden considerar un focus de contaminació puntual de les aigües superficials a causa d'aquests compostos. 7. Es va monitoritzar la presència de plaguicides en mostres d'aigües, sediments i biota en les conques hidrogràfiques del Guadalquivir i el Llobregat durant dos anys consecutius (2010 i 2011). En ambdues, els plaguicides es van detectar principalment en aigua, on van aparéixer quasi contínuament. La seua presència en sediments va ser molt més intermitent i en biota més aviat escassa. Els insecticides organofosforats i els herbicides triazínics van ser els plaguicides predominants en ambdues conques. 8. L'estudi realitzat en el Guadalquivir revela que organofosforats (malatió, clorpirifos, diazinó), carbamats (metiocarb) i triazines (terbutilazina, deisopropilatrazina), van ser les famílies detectades amb major freqüència i concentració en tots dos períodes. Els productes de transformació de la atrazina i la terbutilazina es van trobar en concentracions més altes que els compostos originals, com a resultat del seu llarg procés de degradació. La distribució espacial dels plaguicides va mostrar que els punts de mostreig localitzats a Jaén i Còrdova estan dominats pels insecticides i herbicides utilitzats en el cultiu de l'olivera mentre que els de les altres províncies contenien una mescla complexa de tots els plaguicides estudiats, que reflecteixen les diferències en els patrons de cultiu. 9. Els plaguicides predominants en el Llobregat (en termes de freqüència i concentració) eren bencimidazols (carbendazim), organofosforats (malatió, clorpirifos), triazines (terbutilazina-2-hidroxi, simazina), neonicotinoids (imidacloprid) i triazols (tebuconazol). Els nivells són majors en la confluència dels rius Anoia i Llobregat. Aquesta zona és eminentment agrícola i dedicada al cultiu de la vinya. 10. La comparació dels resultats d'aquest estudi amb dades històriques confirmen l'existència d'una contaminació de fons en la zona del riu Llobregat en els últims 20 anys i demostren que el seguiment periòdic de l'estat de la qualitat ambiental dels rius ajudarà al control de la contaminació i a determinar l'efecte de diferents paràmetres físic-químics. 11. L'estudi de la distribució temporal durant els dos anys del seguiment indica que podria estar relacionada amb el cabal del riu. El flux mitjà-baix comparat amb un flux alt produeix un augment de la concentració en l'aigua i els sediments. En ambdues conques hidrogràfiques diversos plaguicides excedien el límit de 0,1 µg L-1 per als compostos individuals. Els punts de mostreig GUA-3 i ANO-3, localitzats en els rius Guadalquivir i Llobregat respectivament, van excedir el límit de 0,5 µg L-1 per a la suma dels plaguicides en règim de cabal baix-mitjà. 12. Els diferents patrons de contaminació per plaguicides en diferents condicions de flux van revelar que pot afectar a la toxicitat per a la biota. Encara que els valors del quocient de risc (RQ) van mostrar un baix risc de toxicitat per la presència de plaguicides en l'aigua, la bioacumulació de clorpirifos i diazinó, plaguicides lipofíls (Kow> 3) en peixos, destaca la necessitat d'enfocaments alternatius i complementaris als previstos pel simple compliment de les normes de qualitat ambiental (NQA). 13. Es va realitzar un estudi en el riu Túria sobre la possible infiltració de les triazines i urees de les aigües superficials a les aigües subterrànies. Aquestes dades es van confrontar amb els mapes de vulnerabilitat obtinguts pel Sistema d´Informació Geogràfica (GIS) en la zona per a aquests mateixos herbicides. Els pous analitzats es caracteritzen per tenir un nivell de vulnerabilitat diferent a l'establert mitjançant l'aplicació de models GIS. Els resultats obtinguts apunten a l'existència de factors addicionals al nivell de vulnerabilitat dels sòls. Aquests resultats es van comparar amb els obtinguts en diverses zones d'Itàlia sobre la vulnerabilitat dels aqüífers subterranis al glifosat (herbicida que d'acord amb els models de GIS no hauria de lixiviar). Tots dos estudis confirmen la importància de la integració entre les dades de la vigilància i el model per a subratllar els casos en els quals el comportament no s'ajusta al predit pel model i els problemes específics vinculats a males pràctiques agrícoles i a les especificitats territorials.