El éxito de supervivencia de un organismo está vinculado a su habilidad para adaptarse a los cambios que suceden a su alrededor. La levadura S. cerevisiae posee mecanismos para hacer frente a las situaciones desfavorables de estrés, existiendo una respuesta común, dirigida por el factor transcripcional Msn2/4, que se activa rápidamente e independientemente del agente causante del estrés. Msn2/4 afecta a la expresión de aproximadamente 900 genes y está a su vez regulado por las vías PKA y TOR, que controlan el crecimiento celular en función de la disponibilidad de nutrientes. Además de esta respuesta común, la levadura posee mecanismos para hacer frente a las situaciones particulares de estrés. El estrés osmótico se produce cuando la osmolaridad del medio es superior a la del rango fisiológico de la levadura, puede ser causado por glucosa, sal, sorbitol o cualquier otro osmolito del medio, y activa específicamente la ruta HOG. La vía HOG consiste en una cascada de MAPK, tiene dos ramas mecanísticamente distintas pero funcionalmente redundantes que confluyen en la activación de la MAPKK Pbs2. Esta, a su vez, activa por fosforilación a la MAPK Hog1, responsable de dirigir las respuestas adaptativas que permitirán la supervivencia de la célula, entre ellas la acumulación interna de glicerol para evitar la deshidratación masiva y una reprogramación de la expresión génica para hacer frente a la situación de estrés. Respecto a esta última, Hog1 activa a una serie de factores transcripcionales no relacionados funcionalmente entre sí, como Msn1, Smp1, Hot1 y los mismos Msn2/4 de la respuesta general a estrés. El factor transcripcional Hot1 regula a su vez la expresión de una serie de genes relacionados con la biosíntesis y mobilización del osmolito compatible glicerol, aunque se desconoce el mecanismo mediante el cual és activado por la MAPK, así como diversos aspectos de su interacción con el DNA y otras proteínas relacionadas con la transcripción. Dentro del osmoestrés, el causado por glucosa presenta la particularidad de que posiciona a la levadura en un paradógico conflicto, en el que tiene abundancia de nutrientes (dado que la glucosa es la fuente de carbono fermentable favorita de S. cerevisiae) pero a su vez está su supervivencia está comprometida debido a la alta osmolaridad del medio. En presencia de glucosa se activa la vía de la PKA y el mecanismo de represión por glucosa (o catabolito de carbono), por lo que es interesante estudiar las particularidades que presenta este tipo de osmoestrés con respecto al producido por otros osmolitos como sal o sorbitol, más aún teniendo en cuenta las posibles aplicaciones, pues las levaduras se encuentran en esta situación en algunos procesos biotecnológicos, como la producción de bebidas alcohólicas. Uno de los genes más inducidos en la respuesta a estrés por glicosa és YHR087W, de función desconocida, al que se le vincula en distintos procesos de la expresión génica, pero se desconoce su función real y su relevancia en la respuesta a estrés. Presentados los antecedentes, en esta Tesis se plantean los siguientes objetivos: 1.- Análisis funcional de Yhr087w/Rtc3. Se analizará la regulación diferencial de la expresión del gen en distintas condiciones de estrés. Además, se pretende conocer las interacciones físicas que establece con otras proteínas y su función en el contexto de la respuesta a estrés osmótico. 2.- Estudio de los elementos de secuencia del factor transcripcional de respuesta a estrés osmótico Hot1 esenciales para su funcionalidad y, por tanto, para la expresión de sus genes diana. En particular, se tratará de entender el mecanismo de activación llevado a cabo por la MAPK Hog1 sobre Hot1 en condiciones de osmoestrés. En estos análisis se utilizarán YHR087W y STL1 como modelo de genes de respuesta a estrés osmótico por Hot1. 3.- Análisis de la interacción de Hot1 con el DNA. Se pretende determinar el dominio de unión al DNA del factor transcripcional, así como la secuencia de reconocimiento en los promotores de sus genes diana 4.- Profundizar en la función del factor transcripcional Hot1 en la expresión génica mediante el estudio de las interacciones físicas proteína-proteína de Hot1. 5.- Entender las peculiaridades que presenta el estrés osmótico causado por elevadas concentraciones de glucosa en comparación con el producido por otros osmolitos estudiados tradicionalmente, como sal o sorbitol. Análisis molecular de la implicación de los factores transcripcionales de respuesta a estrés Msn2/4 y Hot1 en respuesta a alta glucosa. Se determinarán las implicaciones fisiológicas a nivel celular del estrés causado por elevadas concentraciones de glucosa. Resultados A lo largo de esta Tesis Doctoral se han obtenido los siguientes resultados, desarrollados en 5 Capítulos, cada uno referente a uno de los objetivos descritos en el apartado anterior. Capítulo 1 La primera aproximación al estudio funcional del gen YHR087W/HGI1 consiste en analizar la regulación de su expresión en respuesta a estrés. El gen HGI1 se induce en condiciones de estrés causado por choque térmico (37ºC) y, más significativamente, por estrés osmótico provocado por altas concentraciones de glucosa (20% (p/v)). El análisis de los resultados de los experimentos de Northern Blot demuestran que la regulación de la expresión del gen es distinta en cada caso, siendo Hot1 y Sko1 los efectores principales en caso de osmoestrés, y Msn2/4 en choque térmico. También presenta interacciones genéticas diferenciales en una u otra condición, demostrándose una supresión parcial del fenotipo deletéreo del mutante bcy1 en el doble mutante bcy1hgi1 en condiciones de estrés debido a altas temperaturas. Además, un estudio más detallado de las particularidades de la regulación de la expresión de HGI1 en condiciones de osmoestrés por alta glucosa, estudiada mediante análisis de ChIP (Chromatin Inmunoprecipitation) demuestran que la unión de Hot1 al promotor de HGI1 es dependiente de la presencia de Hog1, tal como sucede en algunos otros genes regulados por Hot1, como CTT1 y HSP12. Además, la alta y mantenida expresión de HGI1 (de 20 minutos a más de 2 horas) en estas condiciones hace de este gen un buen modelo para el estudio de otros regulados parcialmente por el factor transcripcional de respuesta a osmoestrés Hot1, siendo el complemento perfecto del gen STL1, controlado exclusivamente por dicho factor transcripcional. Con respecto a la función de la proteína Hgi1 en el contexto de la respuesta a osmoestrés, el estudio de Tandem Affinity Purification (TAP) muestra que Hgi1 interacciona físicamente con proteínas implicadas en el proceso de (inicio) de la traducción, como Cdc33, Tif32 y Tif4631, y además se purifica con la fracción ribosomal, indicando que también se asocia (al menos parcialmente) con los ribosomas. El mutante hgi1 presenta sensibilidad a cicloheximida y de forma débil a higromicina, al igual que otros muchos mutantes implicados en distintas etapas del proceso de traducción. En esta última condición también interacciona genéticamente con Cdc33. Todo esto sugiere un papel postranscripcional de la proteína, reforzado por el hecho de que varios experimentos adicionales realizados con el mutante hgi1 descartan la implicación de la proteinna en ningún proceso transcripcional. Finalmente, estudios de perfiles de polisomas muestran que el mutante hgi1 presenta una recuperación de la traducción general en respuesta a estrés osmótico más lenta que la cepa silvestre, debido a los defectos en la traducción de mensajeros concretos de respuesta a estrés, como GPD1, HSP104 y HSP78, lo que explica que el mutante presente niveles inferiores de proteína, al menos en los dos últimos casos. Se atribuye por primera vez, por tanto, una funcionalidad a Hgi1 relacionada con la respuesta a estrés en la traducción de mensajeros específicos. Capítulo 2 Con respecto al estudio del factor transcripcional Hot1, el primer aspecto a determinar és como es activado por la MAPK Hog1, dado que la fosforilación del factor transcripcional no es esencial para la expression de sus genes diana. En este trabajo se demuestra que es la interacción con la MAPK Hog1 (y no la fosforilación por la misma) es el punto clave para activar al factor transcripcional de respuesta a osmoestrés Hot1. Estudios de Doble Híbrido, CoIP y fosforilación demuestran que el docking site de la quinasa está situado en las posiciones 381-385 de Hot1 y comprende los residuos básicos KRRRR. Además este element KR4 es necesario para la expression de los genes diana HGI1 y STL1, y por tanto, para la correcta funcionalidad del factor transcripcional. Otro elemento clave para que Hot1 sea funcional son los aminoácidos ácidos EDDDDD situados en posición 541-546, cuya deleción impide la unión de Hot1 a los promotores de los genes que regula. Experimentos adicionales de Un Híbrido demuestran, además, que no se puede descartar que el dominio ED5 esté también implicado en la actividad transactivadora del factor transcripcional. La importancia de los elementos KR4 y ED5 de Hot1 no solo radica en que son necesarios para la funcionalidad de la proteína, (y sin ellos, la expresión de los genes diana del factor transcripcional es la misma que en el mutante por deleción hot1). Además, ambos elementos se requieren para la adquisición de osmotolerancia en S. cerevisiae dependiente de Hot1 y KR4, además, es necesario para la integridad de la ruta HOG. Estudios de CoIP y Crosslinking demuestran que Hot1 puede interaccionar consigo mismo y formar dímeros, y ni el dominio ED5 ni el dominio de unión al DNA (del que se habla en el siguiente Capítulo) son imprescindibles para dimerizar. El hecho que sin la copia genómica los truncados de Hot1 posean mucha menos actividad transactivadora sugiere que Hot1 es un factor de transcripción atípico que no presenta una gran capacidad transactivadora, y refuerza la posibilidad que el dímero sea la forma funcional del factor transcripcional, aunque no se puede descartar que se una al DNA también como monómero. Capítulo 3 En este apartado de Resultados se estudia la interacción del factor transcripcional Hot1 con el DNA. Aunque como se ha comentado anteriormente, sin el dominio ácido ED5 Hot1 no puede unir sus promotores diana, estudios de Un-Híbrido y de Retardo en Gel (EMSA) realizados en este tranajo demuestran que el motivo de unión al DNA de Hot1 está situado en la parte carboxi-terminal de la proteína, abarcando los residuos 610-710. Esta región, que no incluyen ED5, es capaz de unir por si misma in vitro e in vivo secuencias diana en el DNA, aunque no se puede descartar que ED5 también sea relevante en la union al DNA, afectando por ejemplo a la afinidad de unión. Arrays realizados en el mutante hot1 en condiciones de osmoestrés demuestran que, además de HGI1 y STL1, Hot1 regula la expresión de varios genes de respuesta a estrés osmótico: GPD1, DIA3, STL1, GPP2, SPI1, NQM1, HGI1, GRE1, CTT1 y HSP12. Estudios de ChIP confirman además que, efectivamente, el factor transcripcional puede unir el promotor de estos genes, aunque con intensidades muy distintas. El análisis in silico de las secuencias de sus promotores revela una serie de posibles secuencias consenso candidatas a ser reconocidas por Hot1. De entre ellas, en este trabajo se demuestra que la secuencia GGGACAAA puede ser unida in vitro e in vivo por el factor transcripcional, por lo que se propone como UAS de Hot1. La unión diferencial de Hot1 a los promotores de los genes que regula viene determinada por las particularidades y variaciones de esta secuencia UAS consenso, de modo que cuando esta presente en forma íntegra, Hot1 se une en altos niveles y en ausencia de estrés al promotor (STL1, GPD1 y GPP2). Cuando está presente GGGACAA (HGI1, HSP12 y NQM1) sólo puede unirse en presencia de estrés, y en niveles más bajos que en la original. En promotores que contienen secuencias que se diferencian en dos posiciones de la UAS la capacidad de interacción de Hot1 es mucho menor. Finalmente, el análisis de la localización de la secuencia consenso revela que las secuencias GGGACAAA y GGGACAA se encuentran (considerando un cambio) repetidas dos veces y en posiciones cercanas dentro de los promotores de los genes diana de Hot1. Esto sugiere que Hot1 podría unirlas, bien mediante dos motivos hélice-vuelta-hélice que serían la supuesta estructura (4 hélices) del dominio de unión al DNA o bien en forma de dímero, pues como ya se ha comentado en el Capítulo anterior, Hot1 puede interaccionar consigo mismo, aunque se desconoce por el momento si la dimerización es un requisito funcional. Capítulo 4 Este es el último punto de estudio del factor transcripcional Hot1. Los resultados obtenidos demuestran que Hot1 no solamente interacciona consigo mismo y con la MAPK Hog1, sino también con una serie de proteínas relacionadas con la elongación transcripcional, como Sub1, Spt5 y Rpb6. Estas interacciones han sido reveladas de Nuevo por un studio de TAP, y confirmadas posteriormente por CoIP. Además, se ven reforzadas por el hecho que Hot1 también presenta interacciones genéticas con Sub1, Spt4 y Spt5, siendo en todos los casos el doble mutante más sensible a 6-AU. Estudios de ChIP revelan que el reclutamiento de Sub1 a los promotores de respuesta a estrés es dependiente de Hot1, y esta dependencia se mantiene también a lo largo de toda la ORF. La distribución de Hot1 y Sub1 a lo largo del gen STL1 es también parecida. Este dato, unido a las interacciones físicas y genéticas con el complejo Spt4/5, sugiere un papel para Hot1 más allá del inicio transcripcional, al menos en la fase de elongación temprana. Finalmente, el studio de interacciones físicas mucho más transitorias, como las que pueden ejercer las quinasas, muestran mediante estudios de fosforilación que la quinasa CK2, (que une y fosforila Hot1), tiene también un papel en su regulación en ausencia de estrés, pues en el mutante cka1 y cka2 Hot1 se muestra fosforilado en condiciones fisiológicas, lo que sugiere que CK2 determinaría, mediante su acción sobre una o varias fosfatasas, el estado no fosforilado del factor transcripcional en ausencia de estrés. Capítulo 5 El ultimo bloque de resultados de esta Tesis hace referencia al studio de las partucularidades del estrés osmótico causado por elevadas concentraciones de glucosa, con respecto al ejercido por otros osmolitos como sal o sorbitol. La respuesta a estrés osmótico específica causada por elevadas concentraciones de glucosa implica una mayor expresión del factor transcripcional Hot1, así como una regulación diferencial del mismo (orquestrada por Msn2/4 y Skn7) cuando se compara con el estrés equivalente causado por sal o sorbitol. Aunque, al igual que en las otras condiciones, Msn2/4 sigue siendo el factor transcripcional que regula la expresión de la mayoría de genes, lo hace de manera más parcial en osmoestrés por glucosa, condición en la que muestra una activación (entendida como fosforilación y localización nuclear) más transitoria. Microarrays realizados en este trabajo demuestran que la levadura S. cerevisiae sobreexpresa diferencialmente en condiciones de osmoestrés por alta glucosa genes implicados en la biosíntesis de la pared celular, lo que aporta importantes resultados a nivel fisiológico, pues repercute en un aumento de la presencia de quitina en este compartimiento y una menor resistencia a calcofluor white. Por el contrario, en presencia de sorbitol como osmolito aparecen diferencialmente sobreexpresados genes implicados en la biosíntesis y movilización de glucogéno, lo que se traduce en una mayor resistencia de las levaduras a la aplicación posterior de otra condición de estrés. Discusión Durante el desarrollo de esta Tesis Doctoral se ha profundizado en algunos aspectos relacionados con la respuesta a estrés hiperosmótico, particularmente al causado por elevadas concentraciones de glucosa. De este modo se ha podido avanzar en el conocimiento de la función, relacionada con la traducción de transcritos particulares, de uno de los genes cuya expresión experimenta un fuerte incremento en dichas condiciones, YHR087W/HGI1. Por otro lado se ha profundizando en el conocimiento del factor transcripcional Hot1 entendiendo mejor cómo interacciona con la MAPK Hog1 y con el DNA. Además se han identificado interacciones que no se habían descrito previamente con el factor Sub1 y con el complejo de elongación Spt4/5. Aunque todavía existen muchos aspectos desconocidos, se intentan aportar nuevos importantes aspectos sobre como la levadura S. cerevisiae modifica su programa transcripcional en diferentes condiciones de estrés osmótico, y concretamente en el causado por glucosa, donde Hot1 contribuiría al control de la expresión de los genes diana contemplados en este trabajo: STL1 y HGI1.