El giro dentado es una estructura cortical que cumple una importante función en la consolidación de la memoria espacial y el aprendizaje. Ha sido objeto de numerosos estudios, debido a su especial susceptibilidad de ser dañado en procesos como epilepsia de lóbulo temporal o isquemia (para una revisión: Amaral et al., 2007). Ampliar el conocimiento de su circuitería local, así como de su modulación, es esencial para poder entender con más claridad por qué es una región tan susceptible de convertirse en foco de crisis epilépticas, así como de las consecuencias de este fenómeno. Se sabe que las interneuronas basket parvalbúmina tienen un papel esencial en la regulación del correcto funcionamiento del giro dentado. Al inervar de forma perisomática a las células granulares y presentar un umbral de disparo bastante bajo, son capaces de mantener inhibidas a una población amplia de células granulares y sincronizar su disparo. Las células granulares, células principales del giro dentado, juegan un papel muy importante en la patogénesis de la epilepsia del lóbulo temporal (Houser, 1992). Aunque en la mayoría de modelos experimentales de epilepsia estas células no sufren daño celular, sí participan en la remodelación de la circuitería local derivada de una crisis epiléptica. Los axones de las células granulares – las llamadas fibras musgosas – generan colaterales axónicas que proyectan de forma aberrante a la capa molecular interna del giro dentado, fenómeno conocido como “sprouting”. En condiciones normales, las células granulares reciben contactos sinápticos por parte de otra población de células glutamatérgicas presentes en el hilus, las células musgosas. Una de las hipótesis más aceptada para explicar la remodelación de la circuitería local del giro dentado sugeriría que la pérdida de las células musgosas (muy susceptibles de sufrir daño celular tras crisis epiléptica) y la consecuente pérdida de su inervación excitadora sobre las células granulares en la región de la capa molecular interna, favorecería el establecimiento de nuevas conexiones sinápticas entre las colaterales aberrantes de las fibras musgosas y las dendritas de las propias células granulares. De este modo, se generaría un circuito excitador recurrente difícil de controlar por el sistema inhibidor local. Por otra parte, otra de las hipótesis comúnmente aceptadas para explicar el hecho de que el giro dentado se convierta con tanta facilidad en foco de nuevas crisis epilépticas es la conocida como “hipótesis de las dormant basket cells” (Sloviter, 1991). En ella se postula que aunque en la mayoría de los modelos de epilepsia experimental no parece haber una reducción del número de interneuronas basket parvalbúmina, sí se produce una pérdida de su capacidad inhibidora debido a la pérdida del input excitador recibido de las células musgosas. Este hecho daría lugar a un fallo en la inhibición del circuito excitador recurrente de las células granulares, y por tanto facilitaría que el giro dentado se convirtiese en foco epiléptico. Sin embargo, este fenómeno no se cumple en todos los modelos de epilepsia experimental (Buckmaster et al., 2000). Se ha demostrado que esta población de interneuronas basket parvalbúmina está inervada en animales control por fibras Timm-positivas pertenecientes posiblemente a las células granulares (Blasco-Ibáñez et al., 2000), y que esta inervación aumenta en situación de epilepsia experimental (Kotti et al., 1997), por lo que no habría motivo a priori para que disminuya su función inhibidora. Una mejor comprensión de la importancia relativa de cada uno de los dos inputs excitadores que reciben las interneuronas basket parvalbúmina (de las células musgosas y de las células granulares) sería esencial para poder interpretar el funcionamiento del giro dentado en situación normal y tras las alteraciones producidas tras status epilepticus. Recientemente ha sido caracterizado con mayor detalle un tipo de célula granular que ya fue descrito originalmente por Ramón y Cajal (1911). Estas células granulares, denominadas semilunares (Williams et al., 2007; Larimer and Strowbridge, 2010), se sitúan en el borde entre el estrato molecular interno y externo, y presentan colaterales en la capa granular, como las granulares que inervan a las células parvalbúmina. Sus dendritas en la capa molecular externa son más extensas que las de las células granulares típicas. Aunque son también glutamatérgicas y excitan monosinápticamente a interneuronas del hilus y a las células musgosas, sus características electrofisiológicas son diferentes de las células granulares típicas. El número y localización de estas células las convertirían en un candidato plausible a ser el tipo de célula granular que inerva las células parvalbúmina. De acuerdo a lo expuesto anteriormente, establecemos como hipótesis de trabajo que las células granulares semilunares son las encargadas del control perisomático de las interneuronas parvalbúmina del giro dentado. Por tanto, nuestro objetivo principal es estudiar los diferentes inputs excitadores perisomáticos sobre interneuronas parvalbúmina en el giro dentado, y confirmar el origen de esta inervación por parte de las células granulares semilunares. En segundo lugar, nos propusimos integrar a las células granulares semilunares en la circuitería local desde un punto de vista anatómico. Finalmente, estudiamos las posibles implicaciones de esta inervación en diferentes modelos de epilepsia animal. Los objetivos parciales de esta tesis son: - Estudio del input excitador sobre las interneuronas parvalbúmina del giro dentado. Análisis cuantitativo mediante microscopía confocal del número de especializaciones postsinápticas excitadoras e inhibidoras en la región perisomática de las interneuronas parvalbúmina del giro dentado. - Estudio del input perisomático por parte de las células musgosas sobre las interneuronas parvalbúmina en el giro dentado a nivel de microscopía confocal y electrónica. - Estudio del input perisomático excitador por parte de las células granulares típicas y semilunares a nivel de microscopía óptica y electrónica. - Estudio del número de células granulares ectópicas y semilunares, y estudio de su presencia durante el desarrollo postnatal. - Caracterización morfológica de las células granulares semilunares del giro dentado. - Caracterización neuroquímica de las células granulares semilunares y las células granulares ectópicas mediante estudios de colocalización de diferentes marcadores en animales transgénicos con expresión de la proteína YFP por parte de células excitadoras. - Estudio del input excitador e inhibidor que reciben las células granulares semilunares, a nivel de microscopía óptica y electrónica. - Estudio de la supervivencia y actividad de las células granulares semilunares, células musgosas e interneuronas parvalbúmina en tres modelos diferentes de epilepsia experimental: kindling inducido con pentylenetetrazole, status epilepticus inducido con ácido kaínico y DEDTC, y status epilepticus inducido con pilocarpina. En primer lugar se estudió la inervación perisomática excitadora sobre las interneuronas parvalbúmina, primero en comparación con la inhibidora, y seguidamente por parte de dos posibles candidatos expuestos anteriormente: las células musgosas del hilus y las células granulares localizadas en la capa molecular interna del giro dentado y que por su morfología se han denominado “células granulares semilunares”. Para cumplir este objetivo parcial, se llevó a cabo un estudio del input sináptico que reciben las interneuronas basket parvalbúmina a nivel de microscopía confocal y, para evitar posibles confusiones debidas a falsos positivos, a nivel de microscopía electrónica. Nuestros resultados indican que las interneuronas parvalbúmina-positivas reciben contactos sinápticos en la capa molecular interna por parte de las células musgosas, pero no en la región perisomática. Sin embargo, sí encontramos que una misma célula granular semilunar establecía múltiples contactos sinápticos en las dendritas de la capa molecular interna y tronco dendrítico de las interneuronas parvalbúmina-positivas, lo que parece corroborar que el principal control excitador perisomático sobre esta población de interneuronas es establecido por células granulares, y más concretamente, por una subpoblación de éstas: las células granulares semilunares. Una vez hallada esta inervación, nuestro siguiente objetivo fue caracterizar a esta población de células granulares semilunares, utilizando para ello diferentes aproximaciones. En primer lugar, llevamos a cabo un estudio de sus características morfológicas. Nuestros resultados indican que las células granulares semilunares forman una población heterogénea a pesar de que comparten un patrón de arborización dendrítica mucho más extenso que las granulares típicas. Las características morfológicas más llamativas son: (1) del cuerpo celular salen varias dendritas principales, en lugar de una sola dendrita apical como es el caso de las granulares típicas; (2) las dendritas se extienden en paralelo a la capa de células granulares hasta que empiezan a dirigirse hacia la fisura hipocámpica; (3) algunas dendritas atraviesan el estrato granular; y (4) el segmento inicial del axón sale en ocasiones de una de las dendritas en lugar del soma (hecho muy poco frecuente en las granulares típicas). Sin embargo, ninguna de estas características parecía ser identificativa de las células granulares semilunares encargadas de la inervación de las interneuronas basket parvalbúmina. Un análisis de Sholl de células semilunares llenadas intracelularmente muestra un patrón de arborización muy diferente al de las células granulares típicas, como era de esperar. Sin embargo, no hemos encontrado mediante esta técnica ningún patrón que permita diferenciar inequívocamente diferentes subpoblaciones dentro de las células granulares semilunares. El estudio de estas células a nivel de microscopía electrónica no reveló ninguna diferencia significativa a nivel cualitativo respecto a los orgánulos intracelulares, si bien una mayor presencia de aparato de Golgi. Sin embargo, sí observamos la presencia puntual de pequeñas protrusiones somáticas similares a espinas, pero que sólo en un muy bajo porcentaje reciben sinapsis excitadoras. La presencia de protrusiones somáticas similares a espinas también se observó en células llenadas intracelularmente. La siguiente aproximación, dado que el análisis morfológico no había sido concluyente para distinguir la subpoblación de células semilunares de nuestro interés, fue un estudio fenotípico de estas células. Para ello, utilizamos un animal transgénico en el que la proteína YFP se expresa bajo el promotor Thy1, resultando en un marcaje específico de neuronas principales, incluidas las semilunares. El análisis de colocalización a nivel de microscopía confocal de las células semilunares YFP-positivas con marcadores de células principales (CAMKII), células granulares (Prox1), y dada su diferente dinámica del calcio respecto a las granulares típicas, con proteínas ligantes de calcio (PV, CB y CR) tampoco nos permitió una distinción inequívoca de esta población de células. El péptido CART tampoco nos permitió definir la población de células granulares semilunares. A continuación, dado que se ha descrito que las células granulares semilunares reciben mayor inervación por parte de las células musgosas, comprobamos si este hecho se traduce en una mayor expresión del marcador de actividad celular pan-Fos en condiciones normales. Nuestros resultados indican que hay una mayor proporción de células semilunares c-Fos-positivas respecto al total de semilunares, que células granulares típicas c-Fos positivas respecto al total de células granulares. La presencia de botones perisomáticos parvalbúmina-positivos sobre las células granulares semilunares nos hicieron establecer como nuevo objetivo el estudio de la inervación perisomática que éstas reciben. Para ello, combinamos estudios a nivel de microscopía óptica, confocal y electrónica, así como trazado de conexiones mediante la inyección intracraneal del trazador anterógrado BDA10KDa. Nuestros resultados indican que hay una inervación perisomática inhibidora sobre las células granulares semilunares por parte de las interneuronas parvalbúmina y CCK, así como una inervación perisomática excitadora por fibras procedentes principalmente de los núcleos supramamilares. Dada la elevada expresión de c-Fos por parte de las células granulares semilunares, y la inervación perisomática excitadora que reciben, planteamos si después de una sobreexcitación moderada se produce una activación selectiva de la población de células granulares semilunares. Para ello, analizamos de forma separada la acción de diferentes fármacos pro-convulsivos a dosis subconvulsivas: pentylenetetrazole, DEDTC y ácido kaínico. Nuestros resultados indican que hay una inducción de la expresión de c-Fos en las células semilunares en condiciones de excitación moderada. Otro de los objetivos parciales planteados inicialmente en el proyecto de tesis era estudiar el comportamiento de las interneuronas parvalbúmina, células musgosas y células granulares semilunares en modelo de epilepsia experimental. Para ello, estudiamos la supervivencia de estas poblaciones celulares mediante los siguientes modelos de epilepsia experimental: status epilepticus inducido por ácido kaínico, status epilepticus inducido por pilocarpina, y modelo de kindling inducido por pentylenetetrazole. Los resultados obtenidos indican que hay una pérdida de células musgosas (pequeña y progresiva en el caso de kindling mediante pentylenetetrazole), pero no de células granulares semilunares ni de interneuronas parvalbúmina. DISCUSIÓN El presente trabajo intenta profundizar en los conocimientos existentes de la circuitería local del giro dentado. Ya existían datos previos de la existencia de una inervación sobre las interneuronas basket parvalbúmina por parte de fibras zincérgicas (Blasco-Ibáñez et al., 2000). Sin embargo, en el presente estudio se ha caracterizado por primera vez la fuente de esta inervación, que corresponde a las células granulares semilunares. Dado su escaso número y su localización ectópica, las células granulares semilunares han sido obviadas en la mayor parte de estudios anatómicos y funcionales del giro dentado. Recientemente han aparecido estudios centrados en sus propiedades fisiológicas (Williams et al., 2007; Larimer and Strowbridge, 2010). Estos trabajos permiten entender la implicación de las células semilunares en la circuitería local del giro dentado, resaltando que son capaces de mantener su frecuencia de disparo durante largos periodos de tiempo, induciendo estados activados del hilus y aumentando la excitación de las células musgosas (Larimer and Strowbridge, 2010). Además se ha comprobado que durante estos estados también ocurre una inhibición persistente en las células granulares, pero no hay datos relativos a la posible circuitería responsable de este hecho. Nuestros resultados evidencian a nivel anatómico que las células granulares semilunares controlan perisomáticamente a la población de interneuronas basket parvalbúmina del estrato granular. Esta inervación podría ser la responsable de la inhibición persistente encontrada en las células granulares. Además, el control de las interneuronas basket parvalbúmina del giro dentado también tendría como consecuencia la regulación del disparo de las células granulares y por tanto del primer paso en la vía trisináptica del hipocampo. La supervivencia de las células semilunares en modelo de epilepsia, junto con la muerte de las células musgosas, implicaría que las células granulares perderían el circuito excitador establecido con las células musgosas, pero no el circuito inhibitorio debido a las células basket parvalbúmina (mediada por las células semilunares). De este modo, en estadíos iniciales tras status epilepticus, el giro dentado permanecería silente. Solo cuando aparece el fenómeno de sprouting, el circuito inhibidor local perdería su capacidad de controlar el loop excitador recurrente y el giro dentado acabaría convirtiéndose en foco epiléptico. De forma paralela, nuestros datos indican que las células granulares semilunares reciben una inervación perisomática diferente a las células granulares típicas. La inervación aferente de otras estructuras corticales, como es el caso de los núcleos supramamilares, de forma selectiva sobre subpoblaciones de células semilunares, parece estar relacionada con una función diferente de las células semilunares respecto a las granulares. Las células semilunares se encuentran, por tanto, en una ubicación única para regular el correcto funcionamiento del giro dentado, modulando los circuitos feed-back y feed-forward que se establecen. Nuestro intento por dilucidar si todas las células semilunares participan en el control excitador de las interneuronas parvalbúmina, o bien si solo una pequeña subpoblación de células semilunares es la encargada de establecer esta inervación, ha resultado infructuoso. Las técnicas de que disponemos no nos han permitido distinguir inequívocamente diferente subpoblaciones dentro de las células semilunares. La inexistencia de un marcador característico conocido para esta subpoblación de células dificulta su estudio, así como las conclusiones que podemos extraer de los resultados obtenidos. Sin embargo, sí hemos logrado obtener una caracterización morfológica y fenotípica general, así como una primera piedra en su integración en la circuitería del giro dentado. Las conclusiones derivadas de la tesis se resumen en: 1. Las interneuronas parvalbúmina reciben un input perisomático excitador importante a nivel cuantitativo. 2. La inervación perisomática excitadora sobre las interneuronas parvalbúmina por parte de las células musgosas es despreciable en comparación con el input perisomático excitador total que reciben. 3. El input excitador mayoritario sobre interneuronas parvalbúmina en el giro dentado proviene de fibras Timm-positivas. 4. Las células parvalbúmina situadas en el estrato granular reciben mayor inervación Timm positiva que las situadas en el estrato molecular. 5. Las células granulares semilunares son la fuente de la inervación Timm-positiva sobre las interneuronas parvalbúmina del giro dentado. 6. Las células granulares semilunares presentes en la capa molecular interna y en el borde con la capa granular representan aproximadamente un 2% de la población total de células granulares del giro dentado. Son más frecuentes en el ápex del giro dentado, así como a medida que avanzamos a niveles más ventrales. Además, dentro de un mismo nivel, son más abundantes en la capa suprapiramidal respecto a la infrapiramidal. 7. Las células granulares semilunares presentan características morfológicas que las diferencian de las células granulares típicas: su cuerpo celular se encuentra en la capa molecular interna, y extienden sus dendritas ocupando una región más amplia en la capa molecular. Sus axones viajan a través de la capa molecular interna, en paralelo al estrato de somas hasta que lo atraviesan hasta llegar al hilus, donde establecen varias colaterales axónicas en su camino al estrato lucido de CA3. Presentan además colaterales axónicas en la capa granular. Una subpoblación de células granulares presentan dendritas que atraviesan el hilus, en otras ocasiones el axón parte de una dendrita principal, y en general presentan espinas somáticas con mayor frecuencia que las granulares típicas. 8. Las células granulares semilunares expresan marcadores de células principales (CAMKII) y de células granulares maduras (calbindina y Prox1). No expresan selectivamente CART o proteínas ligantes de calcio como parvalbúmina o calretinina. 9. Las células granulares semilunares están más activas en general, según muestran marcadores de actividad celular c-Fos y pan-Fos. 10. Las células granulares semilunares reciben inervación inhibidora de las dos poblaciones de interneuronas cuya diana es la región perisomática: parvalbúmina y CCK. 11. Las fibras procedentes de los núcleos supramamilares, inervan a las células granulares semilunares de forma selectiva, independientemente de su situación en la capa molecular. 12. La inducción de sobreexcitación moderada en el giro dentado mediante el quelante de Zn+2 DEDTC induce la expresión de c-Fos por parte de las células granulares semilunares sin inducir de modo generalizado la activación de las células granulares. 13. Las células granulares semilunares y las interneuronas parvalbúmina son resistentes al daño celular en modelos de epilepsia inducidos por pilocarpina, ácido kaínico o pentylenetetrazole. 14. Los cambios observados en el modelo de kindling inducido con pentylenetetrazole son lentos y progresivos. Se produce una pérdida de células musgosas, y un aumento de la expresión de parvalbúmina por parte de las interneuronas de los cestos. La población de interneuronas somatostatina no se ve afectada en estas condiciones.