RESUMEN DE TESIS DOCTORAL Hipótesis: El fallo de implantación (FI) se define como la ausencia de gestación en pacientes con ≥ 3 ciclos previos de fecundación in vitro (FIV) con transferencia en fresco de al menos 2 embriones en cada ciclo. En el FI podrían jugar un papel importante tanto factores embrionarios como endometriales. Se han utilizado distintas estrategias de tratamiento a nivel de laboratorio FIV. Esto incluye transferencia en día 3, cultivo prolongado y transferencia en estadio de blastocisto utilizando el método co-cultivo, hatching asistido, diagnóstico genético preimplantacional (DGP) o donación de ovocitos (ovodon). El PGS se está convirtiendo en un procedimiento habitual en pacientes con mal pronóstico reproductivo y con predisposición a tener un mayor número de embriones anormales y cada vez están aumentando más sus indicaciones, siendo el fallo de implantación una de ellas. La hipótesis es que el estudio cromosómico de los embriones podría mejorar los resultados reproductivos en los ciclos de FIV y en teoría reduciría las concepciones cromosómicamente anormales por lo tanto reduciendo abortos y fallos de implantación. Se ha usado Comprehensive Chromosome Screening (CCS) por array CGH y FISH para el análisis genético. Las parejas con fallo de implantación presentan una elevada incidencia de anomalías cromosómicas que se ha determinado en varios estudios. Por ello se ha propuesto que la selección de embriones cromosómicamente normales podría mejorar la capacidad de implantación de estos embriones. Objetivos: 1. Comparar en un estudio prospectivo randomizado los resultados clínicos obtenidos en pacientes de fallo de implantación con PGS a la del grupo control sin biopsia embrionaria, mediante la técnica de FISH para 9 cromosomas. 2. Analizar los resultados clínicos retrospectivos, cuando se incorpora el análisis de 24 cromosomas mediante arrays de CGH. Evaluar los diferentes tipos de anomalías cromosómicas. 3. Analizar el impacto clínico de diferentes factores. Número de ovocitos MII obtenidos, factor masculino y número de fallos previos. Diseño y Selección de Pacientes Se trata de un estudio con 2 etapas. Estudio 1: Primera etapa es analizar los resultados de un estudio prospectivo randomizado que se realizó entre 2004-2011, en 91 pacientes de FI con ≥3 ciclos fallidos mediante FISH comparando resultados con biopsia embrionaria en día 3 versus transfer de blastocisto sin análisis cromosómico. En este estudio FI fue definido como ≥3 ciclos fallidos tras la transferencia de embriones de buena morfología. Los pacientes fueron asignados en dos grupos a través de una randomización generada por un ordenador: Grupo A: ciclo de ICSI convencional con transferencia de blastocistos en día 5; y Grupo B: ciclo de DGP con la investigación de nueve cromosomas (13, 15, 16, 17, 18, 21, 22, X, Y) y transferencia de blastocisto en el día 5. Estudio 2: La segunda etapa consiste en un estudio retrospectivo en 491 pacientes de FI con ≥2 ciclos fallidos donde se ha realizado el análisis cromosómico de 24 cromosomas en embriones mediante array de CGH. Este es un estudio retrospectivo de PGS en pacientes de FI en que se realizó una biopsia en día 3 y un análisis de array de CGH, desde 2010 a 2014. Se realizaron un total de 491 ciclos DPI con array-CGH, para parejas con al menos dos fallos anteriores de FIV/ICSI tras la transferencia de embriones de buena morfología. La edad de las mujeres era entre 29 a 44 años. Para analizar las diferencias en la incidencia de anomalías cromosómicas correlacionados con la edad, este grupo de pacientes se subdividió en dos grupos: mujeres menores de 40 años (n = 274) o mayores o iguales a 40 años (n = 217), respectivamente. Resultados Estudio 1: Se observaron diferencias estadísticamente significativas sólo en el número medio de días de estimulación, que fue mayor en el grupo de PGS (11,0 vs. 9,9; p=0,0051), y en el número de ciclos de FIV fallidos anteriores, lo que fue mayor en el grupo de PGS (3,5 vs. 3,1; p = 0,0039). El porcentaje de embriones anormales en el grupo de PGS-FISH fue de 57,3%. Los porcentajes de embriones en día 3 que llegaron al estadio de blastocisto fueron similares en ambos grupos (64,1% y 61,7%, respectivamente, en los grupos A y B). Tampoco se encontraron diferencias estadísticamente significativas en el porcentaje de pacientes que tuvieron al menos un embrión normal para la transferencia (83,7% vs. 89,6% en los grupos A y B, respectivamente). Con respecto a los resultados clínicos, la tasa de embarazos por transferencia fue mayor en el grupo PGS-FISH en comparación con el grupo de blastocisto, mostrando diferencias estadísticamente significativas (36,1% vs. 62,8, p=0,024; respectivamente, en los grupos A y B). La tasa de abortos espontáneos en ambos grupos fue similar (7,7% vs. 14,8%). La tasa de nacido vivo por paciente fue de 27,9% en el grupo A y se incrementó a 47,9% tras la aplicación de PGS-FISH en el grupo B, pero esta diferencia no fue estadísticamente significativa debido al limitado número de pacientes incluidas. Teniendo en cuenta las gestaciones totales conseguidas tras los ciclos con transferencia en fresco más las transferencias de embriones congelados, las tasas de gestación evolutiva acumuladas por paciente fueron 32,6% y 52,1% en los grupos A y B, respectivamente, sin observarse tampoco diferencias significativas. Estudio 2: La edad de las mujeres varió entre 29 y 44 años, y la diferencia en la incidencia de anomalías cromosómicas se correlacionó con la edad materna: En las mujeres menores de 40 años (n = 274) y mayores de 40 años (n = 217), 69,4% y 88,1% de los embriones analizados eran anormales, respectivamente. El aumento en la incidencia de anomalías cromosómicas con la edad materna se reflejó en una disminución en el porcentaje de ciclos con transferencia de al menos un embrión normal. En el grupo de mujeres de menor edad (<40 años), el 75,5% de los ciclos se resultó en una transferencia, mientras que esta tasa se redujo a sólo 37,8% en las mujeres mayores de 40 años. La tasa de embarazo también fue más elevada en el grupo de pacientes menores de 40 años en comparación con el grupo de mayor edad (52,6% y 41,5%, respectivamente), aunque las tasas de aborto fueron similares. Los resultados clínicos también se evaluaron según el número de fallos de implantación anteriores, en este análisis sólo se incluyeron el grupo de pacientes menores de 40 años. El porcentaje de embriones anormales no se vio afectado por el número de fallos de implantación anteriores (71,9% con 2 fallos y 69,5% con ≥ 6 ciclos anteriores), pero se notó una disminución en el porcentaje de embriones con un patrón de división caótico (de 18,6% con 2 fallos a 8,5% con ≥ 6 ciclos anteriores). Con ello, llegamos a la conclusión de que el resultado clínico o las posibilidades de un embarazo a término no se ven afectados por el número de ciclos fallidos anteriores. La contribución de la concentración de espermatozoides se evaluó pacientes menores de 40 años. Se observaron mayores tasas de embarazo e implantación en los ciclos en los que la concentración de espermatozoides fue menor de 10 millones/ml. Sin embargo, el porcentaje de embriones cromosómicamente anormales fue similar para diferentes concentraciones de espermatozoides. Estos resultados podrían indicar que cuando existe un factor de calidad seminal como una posible causa de la mala implantación en ciclos de FIV convencionales, la selección de embriones cromosómicamente normales para la transferencia puede ser capaz de mejorar las tasas de embarazo a más de 60,0%. El número de ovocitos de metafase II (MII) también puede contribuir a los resultados clínicos de los pacientes con FI. En pacientes menores de 40 años, la principal limitación de la reducción del número de ovocitos de MII fue un menor número de ciclos que tuvieron transferencia embrionaria: en pacientes con menos de 5 ovocitos MII se transfirieron embriones en 60% de los ciclos, mientras que cuando se recuperaron más de 16 ovocitos MII, este porcentaje fue superior al 90%. Sin embargo, el porcentaje de embriones anormales, las tasas de embarazo y aborto espontáneo fueron similares independientemente del número de ovocitos de MII obtenidos. El parámetro más afectado por el número de ovocitos de MII fue la tasa de transfer por ciclo y, por tanto, la tasa de embarazo por ciclo. La tasa de embarazo por ciclo se vio significativamente disminuida en casos ≤10 ovocitos MII en comparación con el grupo de pacientes con más de 10 MII (33,6% y 46,8%, respectivamente; p =0,03). Conclusiones: 1. Los criterios morfológicos para la selección de embriones no permiten seleccionar embriones cromosómicamente normales. 2. Los resultados obtenidos en nuestro estudio demuestran que las aneuploidías embrionarias pueden ser una causa importante de los casos de fallo de implantación. Se puede utilizar cribado genético preimplantacional para seleccionar y transferir embriones cromosómicamente normales para mejorar los resultados reproductivos en estas pacientes. 3. En nuestro estudio prospectivo y randomizado de PGS-FISH, aunque no estadísticamente significativa, se ha detectado una tendencia a la mejora de las tasas de nacidos vivos con PGS en un grupo de pacientes de con fallo repetido de implantación en los que se excluyeron otras causas. 4. Los embriones no se ven afectados negativamente por el procedimiento de biopsia embrionaria según su desarrollo posterior y las tasas de formación de blastocisto e implantación. 5. Las aneuploidías en embriones preimplantacionales pueden ocurrir en cualquiera de los 24 cromosomas. El porcentaje de embriones aneuploides es mayor cuando se analizan 24 cromosomas por array de CGH, en comparación con el cribado PGS-FISH con sólo 9 cromosomas. 6. El porcentaje de embriones anormales no es afectado por el número de fallos de implantación anteriores, así que el resultado clínico tampoco es afectado por el número de ciclos fallidos anteriores. 7. Se observan mayores tasas de embarazo e implantación en los ciclos en que la edad de la mujer es menor de 40 años, la concentración de espermatozoides es menor de 10 millones/ml y cuando se recupera más de 10 ovocitos de MII.SUMMARY OF THESIS Hypothesis: Recurrent implantation failure refers to failure to achieve a clinical pregnancy after 3 or more previous in vitro fertilization (IVF) cycles with fresh transfer of at least 2 embryos in each cycle. Both embryonic and endometrial factors could play an important role in implantation failure. Different treatment strategies have been used in the IVF laboratory to achieve pregnancy in such cases. These include perfoming embryo transfer on day 3, extended culture and blastocyst transfer using the co-culture method, assisted hatching, preimplantation genetic diagnosis (PGD) or egg donation. Preimplantation genetic diagnosis (PGS) is becoming a routine procedure in patients with poor reproductive outcome who are prone to increased numbers of abnormal embryos. Indications for PGS are increasing with implantation failure being one of them. The hypothesis of this thesis is chromosomal study of embryos may improve reproductive outcomes in IVF cycles, and in theory reduce miscarriage rates and implantation failures by reducing chromosomally abnormal conceptions. The FISH tecnique and Comprehensive Chromosome Screening (CCS) using array CGH were used to perform the genetic analysis. Several studies have reported that couples with implantation failure have a higher incidence of chromosomal abnormalities. Therefore, it is proposed that selection of chromosomally normal embryos could improve implantation potential of these embryos. Objectives: 1. In a prospective randomized study, to compare clinical results of recurrent implantation failure (RIF) cases in whom PGS was perfomed by analysing 9 chromosomes using the FISH tecnique compared to the control group in whom blastocyst transfer has been done without PGS. 2. In a retrospective study, analyze clinical results of implantation failure cases after array CGH was introduced for the study of 24 chromosomes. Evalute the different types of chromosomal abnormalities detected. 3. To analyze the clinical impact of different factors. Number of MII oocytes obtained, male factor and number of previous failures Design and Selection of Patients: This is a study with 2 phases. Study 1: In the first phase, we have conducted a prospective randomized study between 2004-2011 consisting of 91 implantation failure (IF) patients with ≥3 failed IVF cycles in which we compared the results of embryo biopsy on day 3 and FISH analysis versus blastocyst transfer without chromosomal analysis. In this study, IF was defined as ≥3 previously failed IVF cycles following transfer of embryos with good morphology. The patients were randomized into two groups through a computer-generated randomization: Group A: conventional ICSI cycle with blastocyst transfer on day 5; and Group B: PGD cycle with analysis of nine chromosomes (13, 15, 16, 17, 18, 21, 22, X, Y) and blastocyst transfer on day 5. Study 2: This is a retrospective study performed between 2010 to 2014 including 491 IF patients with ≥2 failed IVF cycles with transfer of embryos of good morphology. All cases underwent a PGS cycle with day 3 embryo biopsy and array CGH analysis of 24 chromosomes. The age of women was between 29-44 years. To analyze differences in the incidence of chromosomal abnormalities associated with age, the patients was divided into two groups: women under 40 years (n = 274) or greater than or equal to 40 years (n = 217), respectively. The second phase consists of a retrospective study including 491 IF patients with ≥2 failed cycles in whom analysis of 24 chromosomes was performed using array CGH. Results Study 1: Statistically significant differences were observed only in the mean number of days of stimulation, which was higher in the PGS group (11.0 vs. 9.9; p = 0.0051) and the mean number of previously failed IVF cycles, which was higher in the PGS group (3.5 vs. 3.1, p = 0.0039). The percentage of abnormal embryos was 57.3% in the PGS-FISH group. The percentage of day 3 embryos that reached the blastocyst stage were similar in both groups (64.1% and 61.7%; respectively in groups A and B). No difference was found in the percentage of patients who underwent transfer of at least one normal embryo (83.7% vs. 89.6% in Groups A and B, respectively). Regarding clinical outcomes, pregnancy rate per transfer was higher in the PGS-FISH group compared to the blastocyst group which was statistically significant (62.8% vs. 36.1%, p = 0.024; respectively, in Groups A and B). The spontaneous miscarriage rate was similar in both groups (7.7% vs. 14.8%). The live birth rate per patient was 27.9% in group A and increased to 47.9% with the application of PGS-FISH in group B, but this difference was not statistically significant due to the limited number of patients included in the study. Considering total number of pregnancies achieved after transfer of fresh plus frozen-thaw embryos, the cumulative ongoing pregnancy rates reached 32.6% and 52.1% in groups A and B, respectively, which was not statistically different. Study 2: The age of women was between 29 and 44, and the incidence of chromosomal abnormalities differed according to maternal age: In women younger than 40 years (n = 274) and over 40 years (n = 217), the percentage of embryonic abnormality was 69.4% and 88.1%, respectively. Complex abnormalities was the major contributor to the total percentage of abnormalities detected in both age groups (12.3% vs. 25.2%). The increased incidence of chromosome abnormalities associated with advancing maternal age was reflected in a decrease in the percentage cycles with transfer of at least one normal embryo. In the group of younger women (<40 years), 75.5% of the cycles resulted in a transfer, while this rate dropped to only 37.8% in women over 40 years. The pregnancy rate was also higher in the group of patients younger than 40 years compared to the older age group (52.6% and 41.5%, respectively), however the miscarriage rates were similar in both groups. Clinical outcomes were also assessed according to the number of previous IVF failures in which only the group of patients under 40 years of age were included in the analysis. The percentage of abnormal embryos was not affected by the number of previous IVF failures (71.9% with 2 previous IVF failures versus 69.5% with ≥ 6 previous IVF failures), but a decrease was noted in the percentage of embryos with a chaotic pattern (from 18.6% with 2 previous IVF failures to 8.5% with ≥ 6 previous IVF failures). With this finding, we conclude that clinical outcome or the possibility of reaching a term pregnancy is not affected by the number of previous IVF failures. The contribution of sperm concentration was evaluated in the group of patients under 40 years of age. Higher pregnancy and implantation rates were detected in cycles where the sperm concentration was less than 10 million/ml. However, the percentage of chromosomally abnormal embryos was similar for different sperm concentrations. These results may suggest that when male factor is thought to be a possible cause of poor implantation in IVF cycles, the selection of chromosomally normal embryos for transfer may improve pregnancy rates to above 60%. The number of metaphase II (MII) oocytes may also contribute to the clinical outcome of patients with IF. In patients younger than 40 years of age, the main limitation of reduced number of MII oocytes was reflected in fewer number of cycles resulting in an embryo transfer. In patients who had less than 5 MII oocytes, embryo transfer was performed in 60% of cycles compared to above 90% when more than 16 MII oocytes were obtained. However, the percentage of abnormal embryos, pregnancy and spontaneous miscarriage rates were similar regardless of the number of MII oocytes obtained. The parameter most affected by the number of MII oocytes obtained was embryo transfer rate per cycle and therefore, pregnancy rate per cycle. Pregnancy rate per cycle was significantly decreased in cases where ≤10 MII oocytes were obtained compared with the group of patients with more than 10 MII oocytes (33.6% and 46.8%, respectively; p= 0.03). Conclusions: 1. Morphological criteria for embryo selection does not allow selection of chromosomally normal embryos. 2. The results of our study suggest that embryonic aneuploidy may be a major causal factor in implantation failure cases. Preimplantation genetic screening can be used in these cases for selection and transfer chromosomally normal embryos for the purpose of improving reproductive outcome. 3. In our prospective randomized study of PGS-FISH, although not statistically significant, we detected a tendency towards improved live birth rates with PGS in a group of patients with repeated IVF failures where other causes were excluded. 4. The embryos are not adversely affected by the embryo biopsy procedure as suggested by further development, blastocyst formation and implantation rates. 5. Aneuploidy can occur in any of the 24 chromosomes in preimplantation embryos. The percentage of embryonic aneuploidy is higher when 24 chromosomes are analyzed using array CGH compared to screening of 9 chromosomes using PGS-FISH. 6. The percentage of abnormal embryos was not affected by the number of previous IVF failures, and nor was clinical outcome affected by the number of previous failed cycles. 7. Higher pregnancy and implantation rates were observed in the following patients: maternal age less than 40 years, cases with sperm concentration less than 10 million/ml and cases with more than 10 MII oocytes retrieved.