NAGIOS: RODERIC FUNCIONANDO

Defective carbohydrate metabolism in multiple sclerosis

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Defective carbohydrate metabolism in multiple sclerosis

dc.contributor.advisor	Casanova Estruch, Bonaventura
dc.contributor.advisor	Burgal Marti, Maria
dc.contributor.advisor	López Rodas, Gerardo
dc.contributor.author	Mathur, Deepali
dc.contributor.other	Departament de Bioquímica i Biologia Molecular	es_ES
dc.date.accessioned	2016-01-26T08:57:10Z
dc.date.available	2016-07-25T04:45:05Z
dc.date.issued	2015	es_ES
dc.date.submitted	28-01-2016	es_ES
dc.identifier.uri	http://hdl.handle.net/10550/50493
dc.description.abstract	La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad crónica del sistema nervioso central (SNC) en el que episodios repetidos de inflamación (bortes), dan lugar a inflamación que conduce a la interrupción de la vaina de mielina por daños producidos en la misma. Junto a este fenómeno de inflación focal, existe una inflamación difusa en el SNC, que unida a la anterior, dará lugar a que aparezca un proceso de neurodegeneración, que será el responsable último de la afectación axonal y neuronal difusa que es la que va a condicionar la discapacidad en los pacientes afectos de EM. La enfermedad es una causa importante de discapacidad neurológica y de disfunción neurológica en adultos jóvenes que afecta a más de dos millones de personas en todo el mundo. En España, la prevalencia de la enfermedad es de aproximadamente 70-80 casos por cada 100.000 habitantes según las estimaciones actuales. La enfermedad se manifiesta típicamente hacia los 20 a 40 años de edad, cuando las personas están en su plena capacidad profesional y, a veces se convierte en un proceso agresivo que altera la vida de los pacientes y sus familias. La EM es una enfermedad heterogénea, tanto en su forma de presentación, el curso evolutivo, la anatomía patológica (donde se han descrito hasta 4 patrones distintos de afectación patológica) y la respuesta a los tratamientos. Estas diferencias llevaron a la clasificación de los tipos de EM en remitente-recurrente (EMRR), EM secundaria progresiva (EMSP) o EM primaria progresiva (EMPP). La mayoría de los pacientes comienzan con un curso de la enfermedad del tipo EMRR que se caracteriza por ataques periódicos (brotes), seguidos de su recuperación parcial o completa (remisiones). A pesar de recibir medicamentos para prevenir la recaída de los pacientes, que tienen un efecto antiinflamatorio pero sobre todo inmunomodulador, los pacientes entran finalmente en la fase secundaria progresiva (EMSP) con un empeoramiento neurológico irreversible. Los pacientes que cursan con una enfermedad progresiva primaria (PPMS) sufren un deterioro continuo de los síntomas neurológicos, lo que sugieren que la fisiopatología de la progresión no es únicamente de naturaleza inflamatoria. El desarrollo de tratamientos eficaces se ha visto obstaculizado por nuestro aún limitado entendimiento de la patogénesis de la EM. Es evidente que una comprensión más profunda de los mecanismos que sustentan la progresión de la enfermedad pueden ayudar en el desarrollo de estrategias terapéuticas para el tratamiento de esta patología. Aunque todas las células del SNC, incluyendo oligodendrocitos y astrocitos, pueden considerarse como "víctimas" celulares en la EM, se acepta ampliamente que es el daño neuronal la causa principal de la discapacidad funcional persistente en estos pacientes, aunque su origen no está aún del todo aclarado. Una de las hipótesis generales es que el daño axonal en los axones desmielinizados es el resultado del aumento de la demanda energética consecuente con la redistribución de la bomba Na+/K+ ATPasa anterior al aumento de los niveles intracelulares de Ca2+. El daño axonal también se ha atribuido a defectos metabólicos defectuosa o a un soporte trófico deteriorado a causa de daños en los oligodendrocitos. Sin embargo, también se cree que ciertos factores difusibles presentes en el líquido cefalorraquídeo (LCR) podrían también afectar a la capacidad de las neuronas para responder al daño axonal con una producción de energía adecuada, especialmente en la patogénesis de las lesiones corticales. La disminución de la capacidad para satisfacer la demanda energética se ha observado durante el deterioro mitocondrial en estudios con neuronas cultivadas, modelos preclínicos de EM en animales, y en muestras de EM humana. El LCR se encuentra en contacto con el parénquima y los ventrículos del cerebro y puede ser un sitio para la deposición de los productos del daño celular que pueden influir en la fisiología celular de las neuronas, las células progenitoras de los oligodendrocitos (OPCs) y los propios oligodendrocitos mielinizantes. El LCR es por tanto un biofluido prometedor para la búsqueda de biomarcadores y de proteínas asociadas al desarrollo de la EM, tanto con respecto al proceso inflamatorio como al neurodegenerativo. Los factores liberados en el LCR de pacientes con EM incluyen factores apoptóticos, citoquinas, enzimas proteolíticas, productos oxidativos y radicales libres que son producidos por las células gliales y las células inmunes activadas. Estos compuestos serían probablemente los más propensos a causar el daño axonal durante el desarrollo de la enfermedad. La hipótesis de trabajo sobre la que se articula el trabajo desarrollado es que la identificación del efecto a nivel transcripcional de células neuronales incubadas con LCR, obtenido de distintos tipos clínicos de pacientes con EM, puedan tal vez explicar ese daño neuronal. Por otra parte, el estudio de los posibles patrones genéticos diferenciales sobre las OPCs incubados con el LCR, el cual podría contener factores que dañan éstas células durante los intentos de reparación de las neuronas, podría facilitar la progresión de la EM. La identificación de los mecanismos implicados en la degeneración-reparación del daño axonal puede arrojar luz en la comprensión de la progresión de la enfermedad y/o su pronóstico dependiente del tipo clínico de la EM. 2. OBJETIVOS En base a esta hipótesis, el objetivo principal fue intentar determinar los mecanismos que están implicados en la degeneración axonal-regeneración en la EM. Para ello se centró el estudio en el daño neuronal primario, independiente del daño secundario como resultado de la desmielinización, utilizando cultivos primarios de neuronas granulares del cerebelo (CGCs) como modelo celular. Es verosímil que factores hasta ahora desconocidos presentes en el LCR de pacientes con EM son capaces de regular la destrucción a la reparación axonal, y hacer una remielinización estable o no y que la recuperación funcional pueda ser posible o permanecer en el curso de la enfermedad. Además, durante las fases de la enfermedad remitente-recurrente el cerebro del paciente por sí solo es capaz de reparar el daño, remielinizar el axón y recuperar la función neurológica. Por lo tanto, decidimos tratar a las CGC y OPCs con LCR derivado de diferentes formas clínicas de la EM y llevar a cabo estudios de expresión génica global. Por otro lado nos planteamos también como objetivo identificar los genes de referencia más estables expresadas en CGC y OPCs tratados para poder normalizar con precisión las niveles de mRNA en los perfiles de expresión. Por último, nos planteamos intentar identificar posibles biomarcadores que ayuden a distinguir las diferentes formas clínicas de la EM y permitan explorar las diferencias y similitudes con la neuromielitis óptica (NMO). Por todo ello, los objetivos concretos que se proponen en esta tesis son los siguientes: 1. Establecer una clasificación de pacientes con EM y NMO en base a criterios clínicos y la presencia de bandas oligoclonales de IgG e IgM en el LCR y aquaporina en suero. 2. Determinar el efecto de la LCR en la viabilidad y el daño celular de las neuronas granulares del cerebelo y en oligodendrocitos. 3. Establecer una relación entre la afectación neuronal y la agresividad en diferentes formas clínicas de EM y NMO. 4. Identificar genes constitutivos durante la maduración de CGCs y en neuronas y OPC expuestos a la LCR de pacientes con EM y NMO. 5. Analizar mediante ensayos con micromatrices de DNA la afectación en la expresión génica del tratamiento con el LCR de los cultivos primarios de CGCs y en OPC. 6. Analizar las variaciones en los genes implicados en el metabolismo de los hidratos de carbono y en la producción de energía y correlacionarlos con el deterioro neuronal y la prognosis en los diversos tipos de EM y NMO. 7. Buscar potenciales biomarcadores para diferenciar los diversos tipos de EM y NMO y en su prognosis. 3. MATERIALES Y METODOS 3.1. Clasificación de pacientes Se han estudiado un total de 59 pacientes en los diferentes experimentos usando las muestras de LCR obtenidas en el Departamento de Neurología del Hospital La Fe y en el Hospital Clínico (Universidad de Valencia). Estos pacientes fueron analizados mediante electroforesis para determinar la presencia en el LCR de bandas oligoclonales de IgG e IgM, en pacientes con EM, y de aquaporina en el suero de pacientes con NMO. Los pacientes con EM se definieron y se agrupan en diferentes cursos clínicos, de acuerdo con los criterios de Lublin. Adicionalmente, los pacientes con EMRR fueron reclasificamos en función de la presencia de bandas oligoclonales de tipo IgM, manteniendo un subgrupo con predominio de afectación medular, que se clasificó como tal. Los pacientes con EM incluidos en este estudio fueron diagnosticados según los criterios de McDonald 2010, y todos ellos cumplen las siguientes características: bandas IgG oligoclonales presentes, habiéndose realizado la punción lumbar fuera de un brote y que hayan pasado al menos un mes después de la última dosis de corticoides. Se utilizaron los criterios Wingerchuk para diagnosticar pacientes con enfermedad NMO. Los pacientes sufrieron recaídas de neuritis óptica y mielitis, y 2 de los tres criterios, la RM normal o que no cumplen los criterios de Patty para MRI de diagnóstico de la EM. Se realizaron todos los estudios durante el procedimiento de diagnóstico, para lo cual el paciente firmó un consentimiento informado. En base a estos criterios clínicos y bioquímicos se pudo establecer que de los 59 pacientes, 21 tenían EM de tipo inflamatoria (11 EMRR subtipo IgM +/+ y 10 EMRR subtipo IgM +/-), 8 tenían EM de subtipo medular (EMMed), 11 tenían EM primaria progresiva (EMPP), 9 tenían neuromielitis óptica (NMO), y 10 eran controles (pacientes NIMD). La tabla 3 muestra la clasificación final y las características clínicas de los pacientes usados en este estudio. Estos pacientes fueron analizados mediante electroforesis para determinar la presencia en el LCR de bandas oligoclonales de IgG e IgM, en pacientes con sospecha de EM, y de aquaporina en el suero de pacientes con sospecha de NMO. 3.2. Análisis de LCR y suero en pacientes con EM y NMO Para determinar los subtipos de EM y NMO señalados arriba, se analizaron muestras de LCR y suero pareadas para detectar las bandas oligoclonales de IgG y IgM mediante isoelectroenfoque (IEF) e inmunodetección. La técnica consiste, usando un kit comercial (Helena BioScience IgG-IEF) y el método descrito por Villar et al. (2001), consiste en la dilución de las de las muestras de LCR hasta concentraciones similares de proteínas, y la incubación con ditiotreitol para reducir IgM. El electroenfoque enfoque se realizó en un sistema de electroforesis Multiphor II (GE Healthcare) a un pH entre de 5 a 8. Las proteínas se transfirien a una membrana de PVDF y se analizan mediante Western blot usando en la inmunodetección anticuerpo anti-IgM humano conjugado con biotina y estreptavidina-fosfatasa alcalina para la detección. En los estudios con suero de pacientes con NMO se usó el anticuerpo anti-AQP4 para la inmunodetección. Se usó además la para detectar la presense de NMO anticuerpos IgG específicos. La inmunofluorescencia indirecta (IFI) se realizó además en las células transfectadas por acuaporina 4 usando el mismo anticuerpo (EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika AG). 3.3. Material biológico 3.3.1. Animales Para los diversos experimentos con cultivos celulares primarios se utilizaron ratas Wistar (Harlan Iberica) con peso entre 200-250 g. El mantenimiento de los animales se realizó en las instalaciones de los animales inferiores del Príncipe Centro de Investigación, Felipe, Valencia, España. 3.3.2. Cultivos primarios de neuronas granulares de cerebelo (CGCs) Los cultivos primarios de neuronas granulares del cerebelo (CGCs) se obtuvieron de acuerdo con el protocolo modificado descrito previamente [Minana et al., 1998]. Los extrajeron los cerebelos de ratas Wistar de 8 días y, tras eliminar las meninges, se disgregaron con pipeta Pasteur, se trataron con 3 mg/ml de dispasa (grado II) durante 30 min a 37ºC en atmósfera humidificada de CO2 5% y se inactivó la enzima con 1 mM EDTA. Las células granulares se resuspendieron en medio basal de Eagle (BME, Gibco) con 40μg/ml de DNAasa I. La suspensión celular se filtró a través de una malla con un tamaño de poro de 90μm, se centrifugó a 1.500 rpm durante 5 min y se lavó la suspensión de células con BME. Finalmente, las células se resuspendieron en medio completo BME con sales de Earle con 10% de suero bovino fetal, glutamina 2 mM, 0.1 mg/ml de gentamicina y 25 mM KCl. Se contaron las células neuronales, se sembró la suspensión en placas de cultivo revestidas de poli-L-lisina a una densidad de 3x105 células/pocillo y se incubaron a 37º C. Para la obtención de cultivos enriquecidos en neuronas, se incubaron las células con arabinósido de citosina 1 mM entre de 18 a 24 horas, lo que inhibe la replicación de células no neuronales. 3.3.3. Cultivos primarios de células precursoras de oligodendrocitos (OPCs) Las OPCs se aislaron a partir de la corteza de ratas postnatales el día 1 y se cultivaron de acuerdo con un procedimiento de McCarthy y De Vellis modificado [McCarthy y De Vellis 1.980]. Las células fueron cultivadas en medio NM10 (DMEM de alta glucosa suplementado con SBF al 10%), y se cultivaron durante una semana a 37 ºC en 5% CO2. Después de una semana, las células de microglía poco adheridas se eliminaron mediante una agitación de baja velocidad (210 rpm) durante 20 min en un agitador de plataforma rotatoria. El medio se retira y se desecha y se reemplaza con medio fresco NM10. Los matraces se agitaron durante la noche durante 18-20 horas a 220 rpm y las células se inmunoseleccionaron en una columna de purificación magnética Miltenyi MACS usando anticuerpo de ratón anti-A2B5. Las OPCs primarias se sembraron en placas revestidas de poli-lysine a una densidad de 2.000 células por cm2 y se cultivaron en medio de definición química de oligodendrocitos (ODM) que contiene 100 mg/ml de transferrina bovina, 5.0 g/ml de insulina recombinante de levadura, 100 g/ml de BSA, 1 mg/ml de biotina, 0.628 mg/ml de progesterona, 0,38 mg/ml de selenito de sodio, 16.1 g/ml de putrescina. Para la expansión de los OPCs, el medio ODM se suplementó con 20 ng/ml del factor de crecimiento de fibroblastos (bFGF) y 10 ng/ml del factor de crecimiento AA derivado de plaquetas (PDGF-AA), y las células se dejaron proliferar durante 48 horas antes del tratamiento con los LCR . Los cultivos de OPCs, tal como se detectó por inmunocitoquímica, eran 99%+ cultivos OPCs puros, con <1% de astrocitos detectables GFAP+ y <1% de microglia detectables Iba1 +. 3.3.4. Tratamiento de CGCs y OPCs con LCR de pacientes con MS y NMO Los cultivos de CGCs de día 14º se incubaron con 10% (v/v) de los LCF de pacientes con MS (IgM +/-, IgM +/+, medular, PPMS y controles) y NMO durante 24 h. Los cultivos de OPCs fueron tratados con LCR diluido 1:1 en medio ODM suplementado con bFGF (20 ng/ml) y PDGF-AA (10 ng / ml) durante 24 h. La viabilidad celular de las CGCs y OPCs durante los cultivos de LCR se utilizó yoduro de propidio (PI), que está excluido en las células vivas, a una concentración final de 0.5 g/ml en PBS y se incubó durante 30 min a temperatura ambiente en oscuridad. Las células se incubaron además con rodamina-123, colorante catiónico que se acumula dentro de la mitocondria de las células debido a la diferencia de potencial negativa interna, a una concentración de 10 g/ml en PBS durante 30 min a temperatura ambiente en oscuridad. Las células se visualizaron mediante microscopía confocal en microscopio Leica TCS SP2 AOB de escaneo láser confocal invertido. El análisis de las imágenes obtenidas se realizó usando el programa Metamorph 7.0 (Molecular Devices). 3.4. Análisis de expresión global con micromatrices de DNA y normalización de datos. Los análisis de expresión de genes de células de CGCs y OPCs en las diversas condiciones experimentales señaladas en resultados se llevaron a cabo tras la extracción de RNA con el kit Quick RNA Microprep (Zymo Research Corp.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Concentración de ARN y la pureza se determinaron utilizando una máquina de NanoDrop. La calidad de ARN La concentración y pureza de los RNA se determinó espectrofotométricamente utilizando el espectrofotómetro Nanodrop 1.000 y la calidad de los RNA pureza se verificó por electroforesis capilar utilizando un Bioanalyzer 2.100 (Agilent) y se retro-trascribieron a cDNA. Estos RNA se usaron tanto en los ensayos con micromatrices de DNA como para los análisis por qPCR de genes individuales, incluidos los genes constitutivos de referencia (tabla 4), en un aparato Applied Biosystems 7.300, y los datos fueron analizados utilizando el software de detección (SDS) versión 1.3 (Software Roche). Por otra parte, los genes constitutivos de referencia invariables fueron evaluados por herramientas de software GeNorm y NormFinder disponibles públicamente. El programa GeNorm clasifica los genes de acuerdo a su medida promedio de estabilidad de la expresión, desde los más estables (valor de M más bajo) a los menos estables (el más alto valor de M). Un programa alternativo, NormFinder, que se introdujo posteriormente clasifica los genes candidatos de referencia en base a las estimaciones combinadas de variaciones intra e intergrupales. Los RNA purificados se usaron para el análisis de expresión génica basado en micromatrices de DNA de un color (Agilent Technologies), mediante hibridación con micromatrices Agilent SurePrint G3 Rata GE 8x60K Microarray (GEO-GPL13521) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Con el fin de dar cuenta de la variación técnica entre micromatrices (es decir, la cantidad de RNA de partida, y las diferencias en la eficiencia de la transcripción inversa, el etiquetado y la hibridación, etc.), la intensidad de la señal en bruto se normalizó utilizando el método de “desplazamiento de percentil”, fijado en la intensidad más robusta del percentil 75, disponible en GeneSpring 9.0 para micromatrices de un color (Agilent). Después de la normalización, los datos se filtraron con el fin de excluir los “probesets” con baja expresión y/o los afectados por las diferencias entre los laboratorios. Los genes expresados diferencialmente se identificaron mediante la comparación de los niveles de expresión promedio en término de veces de inducción en las muestras de MS y NMO respecto a los controles. La figura 11 representa el flujo de trabajo para la preparación de las muestras y el procesamiento de las micromatrices. 3.5. Análisis de redes de interacción proteína-proteína utilizando el software STRING v10 Para dilucidar si la interacción de diferentes enzimas metabólicos relacionados con una ruta metabólica (en nuestro caso la glucólisis, el ciclo de Krebs y la cadena de transporte de electrones) puede condicionar la respuesta de toda la ruta a cambios locales en la concentración de las enzimas hemos utilizado el software STRINGv10. Aunque no todos los genes relacionados con una red específica puedan ser localmente afectados en algún tipo de EM o NMO, el análisis STRING mostraría la interacción física de enzimas relacionadas en una ruta y existir un complejo regulador estrechamente relacionado que modifique el flujo metabólico en esa ruta concreta. Para expresar los cambios en el flujo metabólico global en una ruta concreta resultado de cambios locales en alguna de las enzimas de la misma, hemos definido el parámetro “índice del flujo metabólico acumulado” (CFI) que indica el cambio sinérgico en el flujo global como resultado de la disminución de la actividad de uno o varios enzimas de la ruta analizada. Estos valores nos permitirán hacer comparaciones en los cambios de los flujos metabólicos de las rutas del metabolismo de carbohidratos y de obtención de energía en los distintos tipos de EM y NMO. 3.6. Análisis estadístico Los datos obtenidos, resultado de al menos tres experimentos independientes, se expresan como el valor medio + su error estándar. Una prueba estadística se aplicó para buscar diferencias significativas entre las condiciones experimentales para cada gen candidato. Se realizó un análisis unidireccional de la varianza (ANOVA) para determinar los genes con variaciones significativas. Un valor de p<0.05 fue considerado estadísticamente significativo. 4. RESULTADOS Y DISCUSION 4.1. Diagnóstico clínico y clasificación de pacientes con EM y NMO El primer paso para el estudio de los cambios inducidos en las células cerebrales por el tratamiento con LCR de pacientes con EM y NMO es la clasificación correcta del subtipo y del nivel de la enfermedad. El curso clínico preciso de los pacientes con EM (fenotipos) es importante para el pronóstico, el diseño de los ensayos clínicos y la toma adecuada de los tratamientos. En este trabajo es además importante su conocimiento para hacer la adecuada correlación del tipo de MS y NMO con los cambios en la expresión génica o el comportamiento celular en los tratamientos. Por ellos, se realizó la clasificación de los pacientes en base a la clínica y la imagen MRI en grupos EMRR, EMPP y MedMS. En el primer grupo EMRR se clasificó en subgrupos con pacientes con menor o peor pronóstico en base a la presencia de bandas oligoclonales IgG e IgM en el LCR (Figura 12). Los pacientes con NMO se identificaron mediante inmunofluorescencia indirecta en células transfectadas con acuaporina 4 que detecta la presencia por la presencia de anticuerpos IgG específicos de NMO en muestras de suero de los pacientes (Figura 13). Por lo tanto, las formas clínicas de la EM que utilizaremos en este trabajo son: 1) Pacientes con EMRR subtipo IgM +/- que poseen anticuerpos oligoclonales IgG (+) pero no IgM (-) detectables en el LCR. 2) Pacientes con EMRR subtipo IgM +/+ que poseen tanto anticuerpos oligoclonales IgG (+) como IgM (+) detectables en el LCR. 3) Pacientes EMMed que son positivos para bandas oligoclonales de IgG (+) y negativo para bandas oligoclonales de IgM (-) en el LCR, así como, son negativos para anticuerpos anti-NMO en el suero. 4) Pacientes EMPP que se caracterizan por disminución progresiva de la capacidad neurológica, con anticuerpos IgG (+) pero no anticuerpos IgM (-) en el LCR. 5) Pacientes con NMO que son positivos con anticuerpos contra acuaporina 4, con una mielitis transversa con gran extensión y/o cerebro normal en el primer evento. 6) Controles con pacientes sin inflamación y sin enfermedad neurológica diagnosticada (NIND). La prevalencia de EM observada en estos pacientes, como se conoce en la literatura, es mayor en las mujeres que en los hombres (75% en mujeres). La edad media de los pacientes con EM fue de 30,7 ± 9,7 años, mientras que fue de 25,6 ± 15 años para los pacientes NMO. De acuerdo con la clasificación clínica, las características generales de cada MS pacientes se describen en la Tabla 7. Se encontraron diferencias significativas entre la edad al inicio de la EMPP y las otras dos formas de EM (p<0.003), entre la EDSS (Escala Ampliada del Estado de Discapacidad) de la EMRR y las otras dos formas de EM (p <0.001), y el tiempo de evolución entre la EMPP y EMRR (p<0.043), después de la corrección de Bonferroni. La tabla 8 muestra las características de los pacientes con EM de acuerdo con la nueva propuesta y la clasificación de trabajo. Después de la corrección de Bonferroni se encontraron diferencias significativas importantes entre la edad al inicio de la enfermedad y la EDSS entre las formas EMMed y EMPP respecto a las formas inflamatorias de MS. Los diferentes subtipos de EM ayudan a predecir la severidad de la enfermedad y la respuesta al tratamiento, por tanto, su clasificación es importante. En nuestro estudio, encontramos diferencias significativas entre la EDSS de EMRR y las otras dos formas de EM (EMSP y EMPP) (p <0,001). Aunque la lesión del nervio se produce siempre, el patrón es específico para cada individuo con EM. La gravedad y discapacidad de la enfermedad aumenta en el curso de la EMRR a EMSP y en el subtipo PPMS subtipo, dado que los síntomas empeoran continuamente desde el momento del diagnóstico en lugar de tener ataques y recuperación bien definidos. En nuestros estudios se encontraron diferencias significativas en el tiempo de evolución entre la EMRR y las formas progresivas (p=0.043), así como en el grado de discapcidad medido por la EDSS (p<0.001). En los pacientes que experimentan un curso progresivo, el tiempo de evolución fue similar en los casos de EMSP y en los casos que eran progresivas desde el inicio (13,5 versus 13,8). 4.2. LCR de pacientes con EM provoca muerte celular en CGCs Como el daño axonal ahora ha sido ampliamente aceptado como la causa principal de discapacidad funcional persistente en pacientes con EM, nos centramos en la primera parte de nuestro estudio en el daño neuronal primario, independientemente del daño secundario resultante de la desmielinización. Los individuos con MS poseen la capacidad, y los factores necesarios adecuados, para reparar la mielina dañada durante el curso remitente-recidivante de la enfermedad. Debido a su generación posnatal y la viabilidad de los cultivos primarios bien caracterizados in vitro, las células granulares del cerebelo son un modelo de elección idóneo para el estudio de los eventos celulares y moleculares implicados en los mecanismos de supervivencia/apoptosis y la neurodegeneración/neuroprotección durante la EM. Puesto que potencialmente todas las células del cerebro, neuronales y no neuronales, pueden verse afectadas por esta enfermedad, se determinó el efecto de los LCR de pacientes en la viabilidad celular mediante la adición de yoduro de propidio y rodamina-123 a los cultivos celulares primarios de cerebro de rata (Figura 14). Los resultados muestran que los astrocitos se encontraron viables mientras que las neuronas granulares sufrían muerte celular al tratar los cultivos primarios con LCR de pacientes con EM (paneles B, C y D de la Figura 14). Los resultados indican que algunos de los factores presentes en el LCR de pacientes con EM pueden causar la muerte celular por apoptosis específica en las neuronas granulares del cerebelo pero no en astrocitos. Dado que no se puede excluir que las células no neuronales pueden causar interferencias en los estudios del daño neuronal primario, se debe obtener cultivos puros de CGCs. Para este propósito, fue necesario añadir arabinósido de citosina para inhibir la replicación y crecimiento de las células no neuronales. Para estimar la pureza de las CGCs en los cultivos primarios aislados de cerebelo tras el tratamiento, las células se tiñeron con colorantes Texas-Red y FITC, los núcleos se tiñeron con DAPI, y se visualizaron por microscopía confocal. La figura 15 muestra la característica tinción de los neurofilamentos de las neuronas, lo que indica que el cultivo contiene una población pura de CGCs, y que se encuentra desprovisto de cualquier célula no neuronal. 4.3. Identificación de genes constitutivos estables para normalización de datos de micromatrices de DNA Uno de los principales problemas en cualquier análisis de micromatrices de DNA, con el fin de obtener datos de expresión génica precisos (objetivo del siguiente apartado), es la normalización correcta de los cambios obtenidos de las transcripciones de mRNA diana utilizando en la mayoría de los casos genes constitutivos invariables como controles. Sin embargo, datos anteriores de nuestro laboratorio en donde se analizaba la variación del gen del canal de sodio de expresión en células neuronales mostraban que los genes ActB y Gadph usados habitualmente para normalizar los datos se alteraban en los tratamientos usados (2010, Tesis Doctoral del Dr. Beltrán, Universitat de Valencia). En base a estos datos el apartado siguiente de esta tesis fue el encontrar genes constitutivos adecuados para normalizar los datos de micromatrices de expresión. Los datos iniciales con los genes ActB y Gadph, mediante la realización de PCR convencional en muestras neuronales tratadas con LCR de pacientes con EM (de IgM+/+, IgM+/- (MS inflamatoria), EMMed, EMPP, NMO y NIND), mostraban diferencias significativas en su valores relativos de expresión génica (Figura 18). Se puede concluir que tanto ActB como Gapdh no son adecuados para normalizar la transcripción de genes de interés en nuestras condiciones experimentales. Para encontrar genes adecuados para la normalización, se realizaron qPCR de un conjunto de siete genes constitutivos de uso general (HKGs). Estos genes fueron elegidos de la literatura como genes con expresión invariable observadas en condiciones experimentales distintas. Los HKGs candidatos seleccionados fueron actina (ActB), hipoxantina guanina fosforribosil transferasa (Hprt), proteína ribosomal L19 (Rpl19), lactato deshidrogenasa A (LdhA), receptor de transferrina (Tfrc), microglobulina beta-2 (B2m), y gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (Gapdh). Por otra parte, los datos de qPCR y de las micromatrices de DNA fueron evaluados con los softwares GeNormy NormFinder de acuerdo a su medida promedio de estabilidad de la expresión. Los resultados de la Figura 20 ilustra los resultados de los HKGs genes candidatos en las neuronas granulares del cerebelo tratados con CSF de pacientes de MS / NMO en función de su expresión génica. Los datos de este apartado (Figuras 19 y Tabla 10) nos permiten concluir que Hprt y Gadph son los genes más estables transcripcionalmente seguidos por Tfrc durante la maduración de las neuronas granulares de cerebelo. Por lo tanto, estos genes se pueden utilizar para normalizar los valores de expresión génica. Por el contrario, ActB mostró la mayor fluctuación, por lo tanto, no es adecuado para el propósito de la normalización de la expresión durante el desarrollo neuronal. En condiciones experimentales cuando las neuronas granulares de cerebelo fueron expuestos a los LCR de los diferentes subtipos de EM (Figura 20 y Tabla 11) se observó que Tfcr y B2m eran expresados de forma estable constitutivamente, seguido de Rpl19 mientras Gapdh y ActB mostraron la más alta fluctuación. En los experimentos en lo que las OPCs fueron tratados con LCR de pacientes con EM y NMO (Figura 24 y Tabla 12), se encontró que los genes Mrpl19 y Hprt mostraron la expresión más estable seguida de B2m, mientras que ActB y Gadph fueron los genes menos estables en su expresión en las condiciones experimentales usadas. 4.4. Perfiles de expresión génica global de CGCs y OLPs tratadas con LCR de pacientes con EM y NMO. Los datos disponibles en la literatura revelan que hay un posible papel de la alteración del metabolismo energético alterado en la patogénesis de la EM [véase la figura 44]. Los estudios iniciales aportados por Jones en los años 50 describen la posibilidad de alteraciones del metabolismo del piruvato en la EM [Jones et al., 1.950]. Un informe del grupo Regenold (2008) describe un posible papel del metabolismo energético del SNC en la progresión de la EM. Estos investigadores midieron los niveles de lactato, sorbitol y fructosa, y todos los metabolitos del metabolismo mitocondrial extra-glucososídico, en el LCR de EMRR y pacientes EMSP. Los datos demostraron niveles elevados de los tres metabolitos en el LCR de pacientes EMSP y en menor grado en pacientes con EMRR. En el siguiente grupo de experimentos, se estudiaron los perfiles de expresión génica en neuronas granulares del cerebelo (Figuras 21-23) y en células precursoras de oligodendrocitos (Figuras 25-27) tratadas con el LCR de pacientes con EMRR IgM+/-, EMRR IgM +/+, EM medular, EMPP y NMO utilizando la tecnología de micromatrices de expresión. Nuestros estudios se centraron en la red del metabolismo de carbohidratos, que incluye la vía glicolítica y el ciclo del ácido tricarboxílico, y la cadena de transporte de electrones y fosforilación oxidativa como rutas de obtención de energía que podrían estar incidiendo en el curso de la EM y NMO (Figura 34). Para dar una imagen más global acerca de los genes alterados en estas rutas metabólicas en los diferentes cursos clínicos de la EM y NMO, hemos incorporamos toda la información en un diseño de vía metabólica general desarrollado en este trabajo (Figura 35). Esta integración también nos permitió interrelacionar mejor los cambios en las neuronas y los OPC, con el objetivo de encontrar correlaciones en todo el proceso de degeneración axonal-reconstrucción en los diferentes tipos de EM y NMO. Para poder "integrar" nuestros datos en las rutas del metabolismo, hemos definido un parámetro denominado "ÍNDICE DEL FLUJO METABÓLICO ACUMULADO o CFI" dentro de la red para comparar las diversas condiciones experimentales de EM y NMO. Los valores de CFI quieren significar que la reducción en el flujo local debido a la inhibición de una o varias actividades enzimáticas afectan sinérgicamente sobre el flujo metabólico de toda la red. Por tanto, a medida que más genes están regulados negativamente, disminuyendo su actividad enzimática, el flujo total están siendo reduciendo como un factor multiplicativo que integramos como el valor CFI de esa ruta metabólica. En la sección de Discusión integramos los cambios relativos del metabolismo energético en los diferentes pacientes con EM y NMO calculando el CFI de las rutas metabólicas en esos pacientes. 4.4.1. EMRR IgM +/- Nuestros resultados revelaron que los genes glicolíticos incluyendo Gapdh, Pgam y Eno mostraron una menor expresión en las neuronas expuestas al LCR de la CSF derivado de IgM +/- forma clínica de la EM (Figura 21). Los genes que participan en el ciclo TCA incluyendo Pdh y Mdh2 and gene que participan en la fosforilación oxidativa incluyendo ATP5b también fueron inhibidos en estas neuronas (Figura 22 y Figura 23). En los experimentos en los que las OPCs se expusieron al LCR de pacientes con EMRR tipo IgM +/- se observó la disminución en la expresión de muchos genes glicolíticos incluyendo Hk, Gpi, Gadph, Tpi, Pgk1, Eno1, Eno2, Pk, y Pkm2 (Figura 25). Por otra parte, se reduce la expresión de los genes implicados en el ciclo TCA incluyendo Pdha1, Aco2, Idh, and Ogdh. (Figura 26). Del mismo modo los genes implicados en la fosforilación oxidativa, a saber Atp5a1, ATP5b, MT-ND2, Cox, y Cyc1, mostraron asimismo disminución de la expresión en comparación con los controles neurológicos (Figura 27). Los resultados obtenidos cuando las neuronas se tratan con LCR de pacientes EMRR IgM+/- (Figuras 34 y 35) mostraron que el flujo glicolítico disminuye significativamente en las neuronas (CFI 0,0296), así como en los OPC (CFI 0,0192). El flujo relacionado con el ciclo del TCA también se reduce en las neuronas (CFI 0,0960) y en OPCs (CFI 0,0602). En la fosforilación oxidativa, el flujo se reduce asimismo en las neuronas (CFI 0,3300) y en los OPC (CFI 0,0119). En general podemos señalar que el flujo metabólico de carbohidratos y de la síntesis de ATP se redujeron sensiblemente tanto en las neuronas (CFI 0,00094), como en las OPCs (CFI 0,000014) cuando son expuestas al LCR de pacientes con EM tipo EMRR IgM +/-. Las células neuronales sometidas a daños en los tejidos requieren más energía en forma de ATP para sobrevivir, pero en estos pacientes los genes metabólicos están inhibidos lo que lleva a una reducción en el flujo metabólico general. Esto provoca la disminución en la producción de ATP y en general la capacidad de estas células para reparar el daño que las células sanas, lo que puede estar relacionados con el desarrollo de la patología en estos pacientes. 4.4.2. EMRR IgM +/+ Los resultados obtenidos cuando las neuronas se expusieron al LCR de pacientes con EMRR IgM +/+ demostraron que los genes que catalizan pasos cruciales de la vía metabólica de la glucosa y la generación de ATP, tales como Hk, Gadph, Pgk, Pgam, Eno, Pkm2, Pdh, Mdh2, y ATP sintasa tenían una expresión reducida en comparación con el control (Figura 21-23). En el tratamiento de las OPCs al LCR de estos pacientes se encontró que casi todas las enzimas implicadas en la glicolisis (Hk1, Gpi, Tpi, Gadph, Pgk1, Pgam5, Eno y Pk), las relacionadas con el ciclo de Krebs (Pdh, Aco2, Idh, Ogdh, Sdh, y Mdh2) así como las de la cadena electrónica mitocondrial y fosforilación oxidativa (complejos CI, Cyc1, CIV/Cox, ATPasaA y ATPasaB) se encuentran fuertemente reducidas en su expresión génica. Los resultados globales muestran que cuando las neuronas se tratan con LCR de pacientes EMRR IgM +/+ pacientes el flujo glucolítico disminuye fuertemente (CFI 0,0007) así como en los OPCs (CFI 0,0047). El flujo global relacionado con el ciclo del TCA también se reduce en las neuronas (CFI 0,0690) y con fuerza en OPCs (CFI 0,0024). En la fosforilación oxidativa, el flujo se reduce tanto en las neuronas (CFI 0,3000) como en los OPC (CFI 0,0173). En general, el flujo metabólico de las rutas de metabolismo de los carbohidratos y de la síntesis de ATP se redujeron profundamente tanto en las neuronas (CFI 1.4201E-05), como en los OPCs (CFI 1.9596E-07) cuando se exponen a los LCR de pacientes EMRR IgM +/+. Si comparamos los resultados obtenidos con los subtipos de EMRR IgM+/- y IgM+/+, se puede indicar que los genes implicados en el metabolismo de los hidratos de carbono y la síntesis de ATP están más afectados en el segundo tipo que el primero tanto en neuronas como en OPC. La EMRR IgM +/- es una forma clínica inflamatoria más benigna y menos agresiva de MS, con abundante IgG pero sin anticuerpos IgM en el LCR. Por lo tanto la energía en forma de ATP se requiere para reparar las neuronas dañadas y degenerado en lesiones de la EM puede ser mucho más baja que la forma agresiva EMRR IgM +/+. Para combatir el estrés oxidativo generado en las enfermedades neurológicas, las células necesitan para producir grandes cantidades de equivalentes reductores para la producción de energía. Sin embargo, si no hay suficiente producción de energía, como ocurre en la forma agresiva se perjudica severamente la capacidad de reparación del daño neuronal. Del mismo modo ocurre en las células OPCs, en donde se produce menor nivel de energía lo cual puede bloquear el proceso de reparación por las OPCs. Llegamos a la conclusión de que la expresión diferencial de genes metabólicos influye en el perfil de la bioenergética de las neuronas y, bloquear asimismo los procesos de reparación por los OPC lo que podría estar relacionado con el mal pronóstico en los pacientes con EM del tipo EMRR IgM +/+ en comparación con el tipo EMRR IgM +/-. Otro resultado importante que podemos destacar es que en las OPCs tratadas con LCR se observó una diferencia significativa en la expresión génica de Eno2, Gpi, Tpi, PDHA1, Pgk1, Pkm2, AldoC, y Sdhaf2 entre los pacientes de EMRR IgM+/- e IgM +/+. Del mismo modo, no se encontraron diferencias en la expresión de los genes Pgam1 y Cox6b2 entre los OPC expuestas al LCR de IgM +/- y las OPC expuestas a LCR de pacientes medulares (ver más abajo). Estos genes podrían servir como potenciales biomarcadores para distinguir entre las diferentes clases inflamatorias de los pacientes con EM (las EMRR IgM +/- vs EMRR IgM +/+ y las EMRR IgM +/- vs EMMed). 4.4.3. EMMed Los resultados que se obtienen en los tratamientos las neuronas expuestas a la LCR de la forma clínica medular de EM (EMMed) (Figuras 21-23) muestran que los genes glicolíticos, incluyendo Hk1, Gapdh, Eno y Pkm2, disminuyen su expresión génica en comparación con los controles no neurológicos. Por otra parte, los genes implicados en el ciclo de Krebs, incluyendo Pdh y Mdh2, y los genes de la ATP sintasa alfa y beta muestran asimismo una importante disminución en su expresión génica. Los valores de los índices de flujo acumulativo fueron de 0,0075, de 0,0810 en las enzimas del ciclo del Krebs, y de 0,1050 en las enzimas de la cadena de transporte y de fosforilación oxidativa al exponer a las neuronas al LCR de pacientes medulares (Figura 38). En total, el índice de flujo total acumulada del metabolismo de la glucosa y de la síntesis de ATP se encontró que era tan bajo como 6.36727E-05 en estas neuronas. En los experimentos con OPCs tratados con el LCR de estos pacientes se encontró que muchos de los genes de la ruta glicolítica, como Hk1, Gpi, Gapdh, Tpi, Pgk1, Eno y Pkm2 (Figura 25), del ciclo de Krebs, como Pdh, Aco2, Idh, Ogdh y Sdh (Figura 26), y de los complejos de la cadena de transporte electrónica y la fosforilación oxidativa, como CI, CycC1, CIV/Cox, ATPasa A y ATPasa B (Figura 27), se encuentran profundamente reprimidos. Nuestros resultados revelaron una importante disminución de los índices de flujo metabólico acumulado en la ruta glicolítica (CFI 0,0019), del ciclo de Krebs (CFI 0,0124) y de la cadena electrónica y de la fosforilación oxidativa (CFI 0,0328) en las OPC tratadas con el LCR de estos pacientes (Figura 39). En comparación con los pacientes no-MS (controles), el índice total del flujo acumulado se redujo en el conjunto de las tres rutas metabólicas hasta un valor muy bajo (CFI 7.94269E-07), similar al que ocurre en la EMRR IgM+/+. La forma medular de la EM es un subtipo de EM con neuronas dañadas que se encuentran sobre todo en la región de la médula y que constituye uno de los subtipo más agresivo de MS, comparable al más agresivo del SNC de EMRR IgM +/+, con el que muestra un patrón de expresión génica similar. La drástica reducción en ambos tipos de EM de la expresión de los genes metabólicos daría lugar a un fracaso bioenergético lo que hace que los oligodendrocitos no sean capaces de reparar el importante daño axonal en las neuronas con depleción energética expuestas al LCR de estos tipos agresivos y de peor pronóstico de EM en contraste con el tipo EMRR IgM +/-. 4.4.4. EMPP En los experimentos de tratamiento de las neuronas con el LCR de pacientes con EM primaria progresiva (EMPP) se encontró tan solo reducción en la expresión del gen Pgam en la ruta glicolítica (Figura 21). Entre los genes que participan en el ciclo TCA los genes Pdh y Mdh2 mostraron reducción en su expresión (Figura 22), mientras que las subunidades alfa y beta de la ATP sintasa implicadas en la producción de ATP mostraron asimismo disminución de su expresión (Figura 23). Por el contrario, varios de los genes de la ruta glicolítica se ven afectados a la baja en las OPCs tratadas con LCR de esto pacientes, incluidos Hk1, Gpi, Gapdh, Eno2 y Pk (Figura 25). Algunos de estos genes pueden servir como biomarcadores en pacientes con EMPP. Los genes que participan en el ciclo TCA, incluyendo Aco2, también disminuyen su expresión en comparación con los controles (Figura 26). Del mismo modo, los complejos CI, CIV/Cox y ATP sintasa (subunidad alfa) muestran asimismo reducción en su expresión (Figura 27). Los resultados obtenidos con el tratamiento con LCR de pacientes con EMPP indicaron que el flujo glucolítico disminuyó ligeramente en las neuronas (CFI 0,3000) (Figura 40) y más fuertemente en los OPC (CFI 0,0033) (Figura 41). El flujo relacionado con el ciclo TCA se disminuye en ambos neuronas (CFI 0,0870) (Figura 40) y los OPC (CFI 0,5400) (Figura 41), así como la disminución de la fosforilación oxidativa en las neuronas (CFI 0,1050) (Figura 40) y en los OPC (CFI 0,0728) (Figura 41). En general, podemos decir que el flujo metabólico en las rutas de hidratos de carbono y de producción de ATP disminuye ligeramente en las neuronas (CFI 0,00274) y más fuerte en los OPC (CFI 0,00013) en pacientes con EMPP en comparación con los controles. Estos resultados serían compatibles con el hecho de que estos pacientes tengan un subtipo de EM menos agresiva, de curso más lento y progresivo y de mejor pronóstico que los subtipos EMRR IgM+/+ o EMMed. 4.4.5. NMO La neuromielitis óptica (NMO) es otra enfermedad del SNC de tipo inflamatoria, desmielinizante y autoinmune pero totalmente distinta de la EM. La NMO tiene un patrón de expresión génica completamente diferente en las neuronas expuestas a LCR de estos pacientes que la de los tipos de EM estudiados más arriba. Se encontró que la expresión de los genes que catalizan reacciones en vía glicolítica, incluyendo Hk1, Pgam, y Eno, estan sobreexpresados en las neuronas expuestas a la LCR de pacientes NMO en comparación con las neuronas tratadas con LCR de controles neurológicos. Sólo los genes Gadph y Mdh2 mostraron una ligera disminución de su expresión (Figura 21). Además, los genes de cadena del ciclo TCA y transporte de electrones incluyendo Pdh (Figura 22) y las subunidades alfa y beta de la ATP sintasa mostraron una mayor expresión en las neuronas tratadas (Figura 23). Por el contrario el gen Mdh2 del ciclo del TCA se expresó en cantidades considerablemente más bajos (Figura 22). En general, se observó una aumento de los valores de CFI en dos rutas metabólicas, la vía glicolítica (CFI 1,9656) y la cadena de transporte y fosforilación oxidativa (CFI 1,5867), y una ligera disminución de las enzimas del ciclo de Krebs (CFI 0,2174) (Figura 42). Esto hace que el índice de flujo acumulativo en el conjunto de las tres rutas metabólicas se encuentre prácticamente inalterado (CFI 0,67787). A diferencia de la EM la NMO no es una enfermedad progresiva. De hecho menos de 2% de los pacientes NMO tiene una progresión hacia la discapacidad con recaídas. Así que esta diferencia clínica puede ser la causa de que el patrón génico que conduce a la síntesis de ATP celular este poco alterado en pacientes con NMO. Por otro lado, en OPCs expuestas al LCR de pacientes con NMO, la expresión de genes que catalizan reacciones en vía glucolítica, incluyendo Gpi, Aldo, Gadph, Tpi, Pgk, Eno y Pk, muestran reducción en la expresión de los genes en comparación con los controles (Figura 25). Por otra parte, los genes del ciclo TCA, incluyendo Pdh, Sdh, Aco, Ogdh y Mdh2, mostraron disminución de la expresión en las OPCs tratadas (Figura 26). Del mismo modo, los genes de la cadena de transporte y la fosforilación oxidativa, como CI, CycC1, CIV/Cox y las subnidades alfa y beta de al ATP sintasa muestran también reducción en su expresión génica (Figura 27). Nuestros resultados revelaron una disminución en el índice de flujo acumulado en la glicolisis (CFI 0,0013), ciclo de Krebs (CFI 0,0055), y la fosforilación oxidativa (CFI 0,0149) en las OPCs tratadas con LCR de paciente NMO en comparación con los no-MS (controles) (Figura 43). Los resultados señalan que de los índices de flujo acumulado en las neuronas expuestas al LCR de pacientes NMO sufren una muy ligera disminución (CFI 0,67787), mientras que en las OPC disminuyó sensiblemente (CFI 1.10046E-07). Las conclusiones de esta tesis demuestran un metabolismo defectuoso de la glucosa y de la síntesis de ATP en las neuronas granulares de cerebelo cultivadas y oligodendrocitos tratados con el LCR derivado de los sujetos con EM y NMO. Dado que el LCR está en contacto con el parénquima cerebral y los ventrículos, cualquier producto en el fluido puede influir en la fisiología celular de las neuronas, las células progenitoras de oligodendrocitos y los oligodendrocitos mielinizantes. Los datos aportados en este último capítulo nos indican que los potenciales factores presentes en el LCR pueden estar perturbando el metabolismo energético de las neuronas y las OPCs. El estudio también diferencia la NMO de la EM, lo que a veces es difícil distinguir por los clínicos, por poseer patrones de expresión génica diferencial, y claramente diferencia las formas más benignas de las formas más agresivas en la EM. Sin embargo, conocer con precisión si estas alteraciones en la expresión génica es la causa metabólica de la EM y la NMO o son simplemente una mera consecuencia de la enfermedad sigue siendo difícil de alcanzar. 5. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS FUTURAS A pesar de la amplia investigación que se ha llevado a cabo durante la última década, la causa subyacente de la EM sigue siendo difícil de conocer. El metabolismo perturbado de la glucosa está implicado en diversas enfermedades neurodegenerativas como el Alzheimer, el Parkinson y el Huntington. Sin embargo, se sabe poco sobre su papel en la patología de la EM. Los resultados que se resumen más adelante muestran que los potenciales factores presentes en el LCR, podrían estar afectando el metabolismo de las neuronas y oligodendrocitos y, en función de su presencia o no en los diversos subtipos de EM y NMO, diferenciar el curso de las formas más benignas de las formas más agresivas en la EM. El estudio también diferencia la NMO de la EM en base a su diferente patrón de expresión génica, que a veces es difícil distinguir por los clínicos. Las conclusiones que se derivan de esta tesis se pueden resumir en las siguientes: 1. Se clasificaron los pacientes en base a la clínica, la existencia de bandas oligoclonales IgG e IgM en el LCR, de anticuerpos anti-NMO en suero y la imagen MRI en grupos EMRR, EMPP, MedMS y NMO. Se encontraron diferencias significativas entre la edad al inicio de la EMPP y las otras dos formas de EM (p<0.003), entre la EDSS de la EMRR y las otras dos formas de EM (p <0.001), y en el tiempo de evolución entre la EMPP y EMRR (p<0.043). 2. Los estudios de viabilidad celular muestran que las neuronas granulares, no así los astrocitos, sufren muerte celular al tratar los cultivos primarios de cerebro de rata con LCR de pacientes con EM. La obtención de cultivos puros de CGCs requiere el tratamiento de los cultivos con arabinósido de citosina para inhibir la replicación y crecimiento de las células no neuronales. 3. En condiciones experimentales cuando las neuronas granulares de cerebelo fueron expuestas a los LCR de los diferentes subtipos de EM se observó que los genes Tfcr y B2m eran expresados de forma estable constitutivamente, seguido de Rpl19, mientras Gapdh y ActB mostraron la más alta fluctuación. En los experimentos con las OPCs se encontró que los genes Mrpl19 y Hprt mostraron la expresión más estable seguida de B2m, mientras que ActB y Gadph fueron los genes menos estables en su expresión. 4. En los experimentos con micromatrices de expresión se determinaron los cambios de expresión de las enzimas implicadas en el metabolismo de carbohidratos [Glicolisis (GLI), Ciclo de Krebs (TCA) y cadena de transporte electrónica mitocondrial y fosforilación oxidativa (CTE/PO)] cuando CGCs y OPCs son tratadas con LCR de pacientes con EM y NMO. Los datos indican que las formas más agresivas y de peor pronóstico de EM, EMRR IgM+/+ y EMMed poseen los índices de flujo metabólico acumulado (CFI) más bajos en estas rutas metabólicas, con valores de CFI globales en EMRR IgM+/+ de 1.4201E-05 en CGCs y de 1.9596E-07 en OPCs; y en EMMed de 6.36727E-05 en CGCs y de 7.94269E-07 en OPCs. 5. Por el contrario, en la forma más benigna de EMRR IgM+/- , los valores de CFI globales son sensiblemente superiores, de 0,00094 en CGCs y de 0,000014 en OPCs, lo que puede reflejar la disponibilidad de mejores recursos energéticos en estas células para reparar el daño neuronal en el curso de la enfermedad. 6. En la forma intermedia de agresividad y pronóstico y de curso más lento y progresivo, la EMPP, los valores de CFI globales son asimismo más elevados, de 0,00274 en CGCs y de 0,00013 en OPCs, y posiblemente las enzimas directamente afectadas directamente pueden influir en su pronóstico y agresividad. 7. La NMO como un tipo de enfermedad inflamatoria, desmielinizante y autoinmune del SNC distinta de la EM tiene un patrón de expresión génica completamente diferente. Se observó un aumento de los CFI en la ruta GLI (CFI 1,9656) y en la CTE/PO (CFI 1,5867), y una ligera disminución en la TCA (CFI 0,2174), lo que da un CFI global prácticamente inalterado (CFI 0,67787), en neuronas. Por el contrario, en las OPC disminuyó sensiblemente (CFI 1.10046E-07). Estas diferencias pueden ayudar diferenciar los tipos de EM de la NMO. 8. Aunque no todas las enzimas de una ruta metabólica están afectados por cambios en la expresión, el análisis STRING señala que la formación de complejos multiproteicos por interacción proteína-proteína puede coordinar la respuesta global conjunta de la totalidad de la ruta metabólica. 9. Se han podido encontrar algunos cambios en la expresión diferencial de genes concretos en los distintos tipos de EM y NMO que usarse como biomarcadores que podrían ayudar a diferenciar clínicamente los diversos subtipos de EM y NMO. Estas observaciones abren nuevas perspectivas para la comprensión de la dinámica del metabolismo en la EM con todavía muchos aspectos desconcertantes y preguntas críticas que deben ser abordados. Por ejemplo: ¿Cómo el defecto en una ruta metabólica contribuye a la desmielinización? ¿Las vías metabólicas en otros tipos de células se encuentran asimismo alteradas en la EM? ¿Los cambios en un tipo de célula, pueden afectar directamente a través de algún factor desconocido, o indirectamente por cambios globales en los niveles de los intermedios metabólicos en el LCR a otros tipos de células? ¿Esta perturbación en las rutas metabólica es causa o consecuencia de la EM? ¿Pueden esos genes ser usados como una diana farmacológica para aliviar la patología MS?. Es evidente que se requiere mucha más investigación para desentrañar plenamente el mecanismo de la enfermedad si bien una comprensión adecuada de la enfermedad y de sus mecanismos podría conducir a nuevos tratamientos de esta grave e incapacitante patología.	es_ES
dc.description.abstract	Multiple Sclerosis (MS) is a chronic disease of the central nervous system (CNS) in which repeated episodes of inflammation results in disruption of myelin sheath and neurodegeneration. The disease is a major cause of neurological disability and dysfunction in young adults that affects more than two million people worldwide. In Spain, the prevalence of the disease is approximately 102-160 per 100,000 population according to the current estimates. The disease typically manifests at 20-40 years of age when people are in their full employment and sometimes develops into an aggressive stage that alters the lives of patients and their families. Unfortunately the current treatments are only effective in preventing relapses and slowing down progression but not completely ceasing it and the development of more effective treatments has been hindered by our limited understanding of MS pathogenesis. Axonal damage is widely accepted as the major cause of persistent functional disability in MS patients, although its origin is unknown. During the relapsing-remitting disease course the patient’s brain itself is capable of repairing the damage, remyelinating the axon and recovering the neurological function. Cerebrospinal fluid (CSF) is in contact with the brain parenchyma and ventricles, which can be a site for deposition of cellular damage products that can influence the cellular physiology of neurons, oligodendrocyte progenitor cells (OPCs) and myelinating oligodendrocytes. It is a promising biofluid in the search for biomarkers and disease associated proteins in MS, both with respect to inflammatory and neurodegenerative processes. Factors released in CSF of MS patients including apoptotic factors, cytokines, proteolytic enzymes, oxidative products and free radicals are produced by glial and activated immune cells. These compounds are most likely to cause axonal damage. Accordingly, our hypothesis was to identify the effect of CSF obtained from distinct clinical types of MS patients upon exposure to neurons on transcriptional grounds. Additionally, we were interested to determine the effect of CSF on OPCs, which could contain factors that damage OPCs during attempts at brain repair. Identification of these mechanisms involved in axonal degeneration-reconstruction may shed light in understanding MS progression and /or prognosis. Furthermore, we were interested in identifying potential biomarkers using genomics based approach that could differentiate MS from another similar but totally distinct neurological disease known as Neuromyelitis optica (NMO). NMO shares many pathological similarities with MS and therefore it was previously considered as its variant. For this reason clinicians often used to encounter difficulty in distinguishing MS from NMO and hence similar treatment was provided to both the category of patients. However recent research shows that there are some NMO specific IgG antibodies present in the sera of NMO patients which differentiate both the diseases. To study primary neuroaxonal damage independent of secondary damage resulting from demyelination, we used a cellular model with primary cultures of unmyelinated granular neurons (CGNs) from rat cerebellum. CGNs are small and the most numerous unmyelinated neurons. We employed these primary cultures and treated them with the CSF of distinct clinical forms of MS including oligoclonal bands of IgG + and IgM type – relapsing remitting MS, primary progressive MS, NMO and neurological controls. Previous data in our laboratory experienced variation in sodium channel gene(s) expression while normalizing them with commonly used housekeeping genes including ActB and Gapdh, therefore to further obtain accurate gene expression data it was first necessary to validate these reference genes for correct normalization of target mRNA transcripts. To do this, we evaluated certain reference genes during the development of cerebellar granule neurons (CGNs) and when CGNs were exposed to the CSF from MS and NMO patients. Unexpectedly, we found that Gapdh showed significant variation in gene expression when neurons were exposed to the CSF of MS and NMO patients. It is well known that GAPDH plays a crucial role in carbohydrate metabolism; therefore, we proposed to look for perturbance in expression of genes implicated in glucose metabolism in treated neurons. To do this, we performed microarray gene expression profiling in both neurons and proliferating OPCs exposed to the CSF from MS patients and looked at the genes involved particularly in glucose metabolism. Furthermore, the stability of reference genes in treated OPCs was validated using GeNorm and NormFinder algorithms. Although very limited research has been carried out so far that indicates a role of metabolic disturbances in the pathogenesis of axonal damage in MS there is evidence that shows an association of neurodegenerative disease etiology with metabolic impairment. The present research shows a significant variation in gene expression catalyzing essential steps of carbohydrate metabolism in neurons and OPCs exposed to the CSF of different clinical forms of MS and NMO patients as compared to neurons exposed to the CSF of neurological controls. These data suggest that factors in CSF of MS and NMO patients cause a disturbance in metabolic gene(s) expression in neurons and oligodendrocytes; and demonstrates that MS seems to be associated with metabolic impairment. The results allow us to distinguish different clinical forms and aggressivity in MS patients and MS from NMO that is sometimes difficult by clinical criteria. These results are important to found biomarkers for NMO and MS diseases. Lastly, the significance of prior validation of reference housekeeping genes to accurately normalize the gene expression data is established.	en_US
dc.format.extent	333 p.	es_ES
dc.language.iso	en	es_ES
dc.subject	Multiple Sclerosis	es_ES
dc.subject	Intermediate Metabolism	es_ES
dc.subject	Molecular Neuroscience	es_ES
dc.subject	cerebrospinal fluid	es_ES
dc.subject	relapsing-remitting multiple sclerosis	es_ES
dc.subject	brain glucose metabolism	es_ES
dc.subject	neurodegenerative disease	es_ES
dc.title	Defective carbohydrate metabolism in multiple sclerosis	es_ES
dc.type	doctoral thesis	es_ES
dc.embargo.terms	6 months	es_ES