Existen una gran cantidad de factores que pueden contribuir a la infertilidad, desde infecciones o factores ambientales a factores genéticos e incluso relacionados con la dieta. Estos factores pueden afectar a la mujer, al hombre o a ambos, resultando en la incapacidad para conseguir un embarazo o para que dicho embarazo llegue a término. El factor masculino contribuye al 30-55% de todos los casos de infertilidad (Lee y Foo, 2014). El resto, se debe a infertilidad femenina, donde se sospecha que una de las principales causas de la infertilidad de origen desconocido (hasta un 40% de las causas de infertilidad de origen femenino) sea de origen endometrial (Healy y cols., 1994). La compleja fisiología del endometrio se puede ver alterada por multitud de factores, malformaciones anatómicas, patologías diversas y variaciones endocrinas que pueden conducir a una alteración de la función endometrial (Abrao y cols., 2013). Una de las patologías relacionadas con la disminución de la implantación embrionaria es la presencia de miomas, tumores benignos que pueden alterar el ambiente molecular y fisiológico del endometrio, afectando a la migración espermática, la implantación embrionaria, y, por supuesto, a la receptividad endometrial; con una incidencia del 25-30% de las mujeres en edad reproductiva (Vitale y cols., 2013). Se han propuesto varios mecanismos por los cuales se asocia la presencia de miomas submucosos con infertilidad o subfertilidad: se cree que los miomas pueden interferir con la migración del esperma y el transporte de óvulos por el bloqueo mecánico de las zonas distales o proximales de los tubos de Falopio; y pueden afectar al proceso de implantación embrionaria a través de la alteración de la cavidad uterina causando presión mecánica o generando contracciones uterinas anormales, y causando desórdenes vasculares en el endometrio, secreción de sustancias vasoactivas y, en general, una función endometrial alterada (Parker 2007). Varios estudios retrospectivos y de caso-control han demostrado que los miomas submucosas e intramurales que penetran en la cavidad endometrial están asociados con peores tasas de embarazo y de implantación, pero que su eliminación mejora las tasas de embarazo (Abrao y cols., 2013). Sin embargo, el impacto en la infertilidad de los miomas intramurales o subserosos más pequeños que no alteran la cavidad endometrial es controversial (Brady y cols., 2013). Se ha estudiado el impacto de estos miomas en la implantación embrionaria y la receptividad endometrial mediante el análisis de distintos marcadores moleculares (Sinclair y cols., 2011), el análisis de expresión génica diferencial entre muestras de miomas y de endometrio de mujeres sanas (Horcajadas y cols., 2008), y mediante estudios prospectivos y retrospectivos en clínicas de reproducción asistida. Algunos autores han encontrado una reducción de la implantación y los embarazos en curso en presencia de miomas intramurales pequeños (<5cm) (Guven y cols., 2013); pero otros han fallado en encontrar dicha relación, sobre todo si los miomas no comprometen la cavidad uterina (Bozdag y cols., 2009). De esta forma, se hace necesario un estudio amplio con un gran número de pacientes donde se pueda analizar qué impacto tienen los miomas intramurales que no afectan a la cavidad uterina sobre la receptividad endometrial y la implantación embrionaria. Además, se hará uso tanto de métodos clínicos para determinar dicho impacto (a través de un estudio retrospectivo de mujeres con miomas intramurales que reciben embriones sanos del programa de donación de ovocitos); como de técnicas moleculares, en este caso, la transcriptómica de tejido endometrial tomado durante la ventana de implantación en mujeres con miomas intramurales. Así, se podrá determinar de manera consistente y robusta si este tipo de tumores benignos tienen verdaderamente o no, un impacto negativo sobre la implantación embrionaria y la receptividad endometrial. 3. Objetivos primarios y secundarios. El objetivo principal es analizar el impacto de la presencia de miomas intramurales que no afectan a la cavidad uterina, en la receptividad endometrial y en la implantación embrionaria, tomando como modelo los resultados de embarazo en un programa de donación de ovocitos. Los objetivos secundarios o específicos son: * Estudiar de manera prospectiva la genómica funcional o transcriptómica de tejido endometrial durante la ventana de implantación en mujeres con miomas intramurales. * Estudiar de manera retrospectiva los resultados clínicos de mujeres con miomas intramurales que han recibido embriones dentro del programa de donación de ovocitos. 4. Tipo de diseño. 5. Lugar/es de ejecución. 6. Material. a. Estudio prospectivo: análisis histológicos y moleculares i. Diseño del estudio y recogida de biopsias endometriales Este estudio fue llevado a cabo de acuerdo a las directrices de la declaración de Helsinki y ha sido aprobado por el Comité de Ética e Investigación Clínica de la institución donde se obtuvieron las biopsias endometriales (Hospital Universitario Dr. Peset, Valencia, España) y del lugar donde se procesaron (Fundación IVI, Valencia, España). Se obtuvo el consentimiento escrito informado de todos los pacientes. Se recogieron un total de 22 muestras endometriales usando un catéter Pipelle (Genetics, Namont-Achel, Belgium) en mujeres con miomas intramurales simples que no alteran la cavidad endometrial y se dividieron en grupos según tamaños: grupo A: menos de 5 cm (2,9±1,1 cm, rango 1,8–4,5 cm, n=7); y grupo B: miomas de 5 cm o más, (6,7±1,2 cm, rango 5,5–8,0 cm, n=8). El grupo C, control, se compuso de mujeres sanas y fértiles con ciclos normales (n=7). Todas las biopsias endometriales se realizaron 7 días después del pico de LH endógena (LH+7), en el centro temporal de la ventana de implantación. El diagnóstico del mioma, la localización, y el tamaño fue llevado a cabo por ultrasonografía transvaginal, resonancia magnética e histeroscopia o histerosonografía. Se excluyeron otras patologías ginecológicas, especialmente la presencia de adenomiosis y/o endometriomas. Para detectar la ovulación, las pacientes fueron sometidas a ultrasonografías transvaginales sistemáticas, empezando en la fase folicular temprana del ciclo. Una vez que se detectó un folículo de 17-18 mm, se analizó LH en la orina usando un kit comercial disponible para determinar el pico de dicha hormona (Felcontrol; Laboratorios Effik, Madrid, España). Una vez extraída la biopsia endometrial y después de lavar con PBS1X, alrededor del 80% de la misma fue almacenada a -80ºC para el análisis de expresión génica (figura 1). Una pequeña parte de la muestra se fijó con formaldehido al 4% (p/v) y se incluyó en parafina para los estudios histológicos. El dataje endometrial se realizó usando el criterio de Noyes (Noyes y cols., 1950). Fue llevada a cabo por dos patólogos independientes de forma ciega sin conocimiento del día de la toma del tejido ni del historial clínico de las pacientes. Figura 1. Esquema representativo del procedimiento llevado a cabo sobre las muestras endometriales recogidas para el estudio prospectivo. b. Estudio retrospectivo: impacto de miomas en las tasas de implantación y de embarazo i. Diseño del estudio y recogida de datos Se diseñó un estudio retrospectivo híbrido entre un caso control y un estudio de cohortes en pacientes que realizaron una donación de ovocitos en IVI-Valencia desde abril de 1994 hasta agosto de 2007. Buscando en nuestra base de datos de 12.108 ciclos de donación de ovocitos. Se identificaron 807 primeros ciclos de donación de ovocitos en pacientes con miomas documentados ultrasonográficamente que no afectaban la cavidad endometrial, como se verificó por histeroscopia o histerosonografía. Los pacientes sospechosos, o diagnosticados, de adenomiosis concomitante y/o endometriosis por ultrasonidos, resonancia magnética y/o cirugía fueron excluidos, así como las parejas con oligozoospermia severa (<5 millones/mL de espermatozoides en el eyaculado). Se dividieron en cuatro grupos, dependiendo del tamaño y el número de miomas. El grupo A se formó con mujeres que presentaban miomas de menos de 5 cm de diámetro. Este grupo se dividió posteriormente en tres subgrupos de acuerdo al número de miomas: grupo A1 [un único mioma] (similar al grupo A en estudios histológicos y moleculares); grupo A2 [dos miomas] y grupo A3 [tres o más miomas]. El grupo B eran pacientes de donación de óvulos en las que había un mioma de 5 cm o más sin afectación de la cavidad endometrial, en la recolocación del embrión (similar al grupo B en estudios histológicos y moleculares). Se establecieron dos grupos control. El grupo C1 se hizo con casos en los que se realizó una miomectomía antes de la FIV. La mayoría de los casos eran pacientes con uno o dos miomas de tamaño medio extraídos por laparoscopia, pero sin mioma presente en FIV. Antes de entrar al programa de donación de ovocitos, una histeroscopia confirmó una cavidad endometrial normal. El grupo C2 comprende pacientes que han donado ovocitos en las mismas fechas que los incluidos en el grupo C1. Se tuvo cuidado de incluir mujeres en ambos grupos C en las que se diagnosticaron miomas, adenomiosis y/o endometriosis, y factores masculinos severos. Por tanto, el grupo C2 era similar al grupo C en los estudios histológicos y moleculares. Las variables analizadas y comparadas entre los grupos incluyeron edad, años de infertilidad, indicación para la donación de ovocitos, número de ovocitos recibidos, tasas de fertilización, calidad de los embriones recolocados y tasas de implantación y de embarazo. De manera similar, se incluyeron también en los análisis los periodos de gestación y su desarrollo durante 26 semanas. 7. Método. a. Estudio prospectivo: i. Estudio del perfil de expresión génica: transcriptómica 1. Purificación de ARN total El ARN total se extrajo de las biopsias endometriales usando el reactivo Trizol (Life Technologies, Paisley, UK) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Fue tratado con RQ1 ADNasa I (Promega, Southampton, UK) durante 30 min a 37ºC y después re-extraido con Trizol. La calidad del ARN se evaluó cargando 300 ng de ARN total en un Labchip de ARN y se analizó en un bioanalizador A2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Sólo se incluyeron para el análisis en microarray las muestras con un número de calidad e integridad del ARN muy bueno (RNA Integrity Number (RIN)>7,5 en el bioanalizador de Agilent). En total, se analizaron 19 muestras por duplicado: seis del grupo A, seis del grupo B y siete del grupo C. 2. Marcaje, hibridación y lectura del microarray La generación de las dianas de ADNc marcadas y la hibridación del chip se llevó a cabo siguiendo el método recomendado por el fabricante. La señal de fluorescencia en los microarrays se adquirió usando un escáner de microarray Genepix 4100 (Axon Instrument, Foster City, CA). Las imágenes escaneadas se procesaron usando el software GenePix Pro 3.0 (Axon Instruments). Los datos generados por el análisis CodeLink Operating Software (Northbrook, IL) de las imágenes escaneadas del microarray fueron importados en la versión 4.0 del Set de Análisis de Patrones de Expresión Génica (GEPAS, Valencia, España) para su análisis. Los archivos que contenían los niveles de intensidad de las sondas fueron procesados usando el algoritmo robusto de análisis de microarrays para el ajuste de la señal de fondo, la normalización y la transformación log2 de los valores perfectamente emparejados. La intensidad de los puntos de todos los microarrays estaba entre los valores estándar para los bioarrays Codelink de todo el genoma. La extracción de datos fue realizada de 0 a 65.535 unidades arbitrarias. ii. Análisis de datos 1. Análisis bioinformático El análisis de microarray se llevó a cabo usando la versión 3.1 de GEPAS (http://www.gepas.org) (Vaquerizas y cols., 2005). La anotación funcional de los resultados de los análisis se hizo usando el sitio Babelomics (http://www.babelomics.org). 2. Preprocesado Los datos que se extrajeron del proceso de normalización del microarray se preprocesaron antes de llevar a cabo el análisis del microarray. Múltiples sondas que mapean el mismo gen fueron mezcladas usando la media como resumen de los valores de hibridación. 3. Agrupamiento de muestras Se usó el método SOTA para agrupar perfiles de expresión diferentes. SOTA se incluye dentro de GEPAS (Vaquerizas y cols., 2005). Para la visualización y la evaluación de la calidad de los clusters o grupos, usamos CATT, un módulo de GEPAS. El enriquecimiento funcional de los grupos se estudió con la herramienta FatiGO+ (Al-Shahrour y cols., 2004; Al-Shahrour y cols., 2007). 4. Expresión génica diferencial Se aplicó un test-T para encontrar diferencias en la expresión principal en los tres grupos de microarrays (clases). Se analizaron los patrones de expresión génica de las muestras en cada grupo, obteniendo un p-valor para cada gen en el experimento. También aplicamos un test-T a los grupos. Los p-valores se corrigieron usando el índice de falsos positivos (Benjamini y Hochberg, 1995) para considerar los efectos de múltiples tests. 5. Análisis funcional Para detectar activaciones o desactivaciones en funciones biológicas o vías de señalización, empleamos FatiScan (Al-Shahrour y cols., 2007b), una variante del algoritmo de enriquecimiento de set de genes que detecta de manera significativa la regulación positiva o negativa de bloques de genes relacionados funcionalmente en listas de genes ordenados por expresión diferencial. FatiScan es una parte del sitio Babelomics. FatiScan puede buscar bloques de genes que están relacionados funcionalmente por diferentes criterios como términos de ontología génica, vías Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, y otros. 6. Validación de microarray: PCR cuantitativa Para verificar los resultados obtenidos del microarray, se llevó a cabo una PCR a tiempo real para seis genes seleccionados: dos regulados positivamente, inhibidor 2 de la vía del factor de tejido (TFPI2) y el miembro 4 de la familia transmembrana 4 L seis (TM4SF4); y cuatro regulados negativamente, glutatión peroxidasa 3 (plasma) (GPx3), claudina 10 (CLDN10), regulador 2 del transporte de iones que contiene el dominio FXYD (FDXY2), y fosfoproteína secretada 1 (osteopontina, sialoproteína ósea I, activación temprana de linfocitos T 1) (SPP1). El análisis estadístico de los datos de PCR se realizó usando el algoritmo del software de expresión relativa, el cual usa una redistribución por parejas y un test aleatorizado para determinar la significancia. b. Estudio retrospectivo: i. Análisis estadístico de datos clínicos Se hizo un cálculo de la potencia de contraste con la hipótesis inicial de que la presencia de miomas podía reducir las tasas de gestación un 20%. Teniendo en mente que los índices de embarazo son de alrededor del 50% en nuestro programa FIV (riesgo=50%) y que el efecto de los miomas puede ser sobre el 20% (diferencia de riesgo=20%), el tamaño estimado de muestreo con riesgo-β del 20% (potencia=80%) y riesgo-α del 5%, debería haber más de 93 pacientes por grupo. Se realizó un ANOVA por comparación entre los seis grupos establecidos, a pesar de que la mayoría de las variables no siguieron una distribución normal. Sin embargo, ninguna de ellas presentó una asimetría importante y seguían el teorema central del límite. Se usaron tests χ2, seguidos de corrección de Bonferroni (multiplicando el P-valor por el número de comparaciones realizadas) para comparar los índices de embarazo y de aborto entre los grupos. También realizamos un análisis de regresión logística en el que se cuantificó el efecto del tamaño de los miomas en las tasas de embarazo y de aborto. Se calculó la significancia del modelo por el test Omnibus (razón de probabilidad) y la incertidumbre explicada por el modelo se evaluó por Negelkerke R2. La razón de momios o de oportunidades (OR) del efecto de un cm más en el tamaño de mioma en el resultado del embarazo se expresa junto con intervalos de confianza (CIs) del 95%, R2 y significancia. Se asumió una significancia de p<0,05. El análisis estadístico se realizó usando el Paquete Estadístico para las Ciencias Sociales 14 (SPSS Inc., Chicago, IL).