Introducción Las levaduras son responsables de numerosos procesos biotecnológicos tales como la producción de bebidas y alimentos fermentados. Las levaduras de interés biotecnológico son organismos muy especializados que han evolucionado bajo restrictivas condiciones ambientales en distintos ambientes manipulados por el hombre. Durante el proceso de adaptación a estos ambientes manipulados por el hombre, distintas cepas y especies del género Saccharomyces se han visto sometidas a procesos selectivos generados por su uso inconsciente en la fermentación alcohólica (Querol et al., 2003), lo que también ha generado diferencias adaptativas entre ellas (Barrio et al., 2006). Aunque la especie más frecuente en fermentaciones vínicas, y objeto principal de la mayoría de los estudios es S. cerevisiae, otras especies pertenecientes al género Saccharomyces tales como S. kudriavzevii, S. paradoxus, S. bayanus y S. eubayanus, una nueva especie aislada en Argentina (Libkind et al. 2011), así como los híbridos de estas especies, han sido objetivo de estudio en los últimos, mostrando importantes diferencias genéticas y fisiológicas. De los resultados obtenido de trabajos previos, cabe destacar que en comparación con cepas comerciales de S. cerevisiae, las cepas de las especies S. uvarum y S. kudriavzevii son capaces de fermentar mostos produciendo un menor grado alcohólico y una mayor concentración de glicerol, sin que ello conlleve un incremento de la cantidad de ácido acético (González et al. 2007, Tosi et al. 2009, Gamero et al. 2013), característica de gran interés para paliar los efectos del cambio climático en enología. También se ha observado que cepas de S. uvarum y S. kudriavzevii crecen mejor a bajas temperaturas que las cepas de S. cerevisiae en distintas condiciones fermentativas, tanto en mosto natural de uva (Tronchoni et al., 2009) como en mosto sintético (Arroyo-López et al., 2010). Sin embargo, pocos datos se conocen sobre la regulación de la síntesis de glicerol en S. kudriavzevii y en el resto de especies del género Saccharomyces. Estos datos revelan grandes diferencias entre las especies indicando una gran disparidad en el metabolismo central de carbono, probablemente debido a las diferencias de adaptación a diferentes condiciones ambientales. A la vista de estos datos se hace necesaria una mejor comprensión de los distintos mecanismos reguladores de la síntesis de glicerol entre estas especies. Las especies del género Saccharomyces presentan dos genes GPD1 y GPD2, que codifican las glicerol-3-fosfato deshidrogenasas, enzimas más importantes de la ruta de síntesis de glicerol. En S. cerevisiae se conoce muy bien la expresión de estos genes relacionada con la respuesta al estrés osmótico (Albertyn et al., 1994) y en condiciones de fermentación vínica (Pérez-Torrado et al., 2002). En cambio, GPD2 se induce en anaerobiosis para mantener el equilibrio redox celular mediante la reoxidación del NADH que se produce durante la síntesis del glicerol (Ansell et al. 1997), por lo que en el caso de la fermentación vínica la inducción se produce al pasar a condiciones anaeróbicas durante la fase de crecimiento exponencial. Sin embargo, poco se sabe en las otras especies del género Saccharomyces. En la primera parte de la tesis se analiza la acumulación de glicerol intracelular y se caracteriza la actividad enzimática de las dos Gpd1p en S. kudriavzevii y se compara con S. cerevisiae. La producción y el balance de glicerol son esenciales para la supervivencia de las levaduras sometidas a condiciones estresantes como puede ser el estrés osmótico o por frío, situaciones que son habituales durante procesos industriales como son las vinificaciones. Las respuestas a estos estreses son bien conocidas en S. cerevisiae, mientras que se sabe poco en otras especies del género Saccharomyces próximas filogenéticamente y asociadas a los ambientes naturales o de fermentación, tales como S. uvarum, S. paradoxus o S. kudriavzevii. En la industria fermentativa, especialmente en la fabricación del vino, se exigen actualmente dos características para utilizar una cepa de levadura: la resistencia a estrés osmótico y la capacidad para crecer a bajas temperaturas (Pretorius et al., 2012). Se sabe que S. cerevisae trata de aumentar los niveles de glicerol intracelular cuando está sometida a estrés osmótico o por frío en condiciones de vinificación o de crecimiento normal en laboratorio (Panadero et al., 2006; Petelenz-Kurdziel et al., 2013). Esta acumulación es muy importante para mantener el equilibrio durante la primera fase de la fermentación y el glicerol actúa como un agente crio-protector clave para la adaptación a los ambientes fríos, lo que permite la viabilidad celular determinante de un buen rendimiento fermentativo (Remize et al., 2001; Tulha et al., 2010). Por otro lado, se sabe muy poco sobre la relación del balance y producción del glicerol en respuesta a estos estreses en otras especies del género Saccharomyces asociadas también a ambientes fermentativos. Teniendo en cuenta que muchas de estas especies son de interés biotecnológico, se hace necesario un mejor entendimiento de sus características fisiológicas y moleculares en relación al balance de glicerol y que es objetivo del segundo capítulo de esta tesis. Cabe destacar que cualquier cambio de expresión en genes implicados en la ruta del metabolismo central o respiro-fermentativo, como es el caso de genes de la síntesis de glicerol, también puede influir directamente en las características enológicas deseables en las cepas vínicas de levaduras posiblemente por alterar sus rendimientos en etanol, glicerol y ácido acético (Cordente et al., 2013; Pretorius et al., 2012; Varela et al., 2012). Actualmente todos los estudios metabólicos se centran en cepas de S. cerevisiae de interés industrial o de laboratorio, pero poco se conoce sobre cepas de S. cerevisiae de diferentes orígenes o de otras especies del género Saccharomyces. El estudio de las posibles variaciones en el metabolismo central o del efecto Crabtree en condiciones fermentativas entre cepas y especies del género Saccharomyces puede ser de gran interés. Con esta finalidad, se ha llevado a cabo un amplio estudio genético y fermentativo con 94 cepas de S. cerevisiae de diferentes orígenes agrupadas como que vínicas, mosaico y no vínica según según los datos de Liti et al., (2009). Se ha analizado bajo distintas condiciones fermentativas, la producción de los metabolitos primarios y secundarios y los resultados han revelado importantes y significativas diferencias metabólicas entre cepas vínicas y no vínicas de S. cerevisiae. Objetivos y Metodología Esta tesis se centra en el estudio comparativo de la síntesis de glicerol incluyendo cambios en la regulación y en el estudio de cambios en el metabolismo fermentativo de levaduras del género Saccharomyces y otras especies tales como S. uvarum y S. kudriavzevii que son usualmente utilizadas en procesos fermentativos industriales sobre todo en vinificación como alternativas a S. cerevisiae en fermentaciones industriales. Los principales objetivos y la metodología utilizada se enumeran a continuación: 1. Comprender los mecanismos moleculares reguladores de la elevada síntesis de glicerol por cepas de la especie S. kudriavzevii en condiciones de vinificación. Para explicar esta observación a nivel molecular se ha estudiado la expresión de los genes implicados en la ruta de síntesis de glicerol y se ha observado una expresión más alta de GPD1 en S. kudriavzevii en comparación con S. cerevisiae en condiciones de micro-vinificación. También se ha detectado una mayor actividad enzimática de Gpd1p en S. kudriavzevii en respuesta a estrés por frío y osmótico y se ha demostrado que la enzima de esta especie presenta una mayor actividad catalítica que contribuye al aumento de la producción de glicerol. Finalmente, también se ha comparado la producción de glicerol entre las enzimas de ambas especies y con una variedad recombinante entre ambas, con el mismo fondo genético y se ha encontrado que la enzima de S. kudriavzevii produce mayores niveles de glicerol en distintas temperaturas de crecimiento, 12 o 28 °C. Para este estudio se emplearon las cepas de S. cerevisiae T73 y EC1118, usadas como modelos de cepas vínicas, además de la cepa vínica comercial FCry (Fermol Cryophile; AEB group), seleccionada por su adaptación a bajas temperaturas y buena producción de glicerol. La cepa diploide BY4743 se ha empleado como cepa de laboratorio. Las cepas de S. kudriavzevii estudiadas en este objetivo fueron la IFO1802 (tipo) y las naturales ZP591, ZP594 y ZP629, aisladas en Portugal, y CR85, CR89, CR90 y CA111, aisladas en España. Se llevaron a cabo micro-vinificaciones con la variedad de mosto Bobal o con mosto sintético MS300, que simula el mosto natural de uva. Para los experimentos de estrés, tras crecimiento durante una noche en medio GPY, las células se transfirieron a GPY con sorbitol 1M o a GPY previamente atemperado a 12 ºC. Los plásmidos que expresan el gen GPD1 de S. cerevisiae o S. kudriavzevii, bajo el control del promotor GAL, se construyeron usando pYES2.1 TOPO TA Expression Kit (Invitrogen). Los plásmidos que expresan GPD1 de ambas especies bajo su proprio promotor se construyeron usando pGREG526 por recombinación homóloga en levaduras. También se construyó la versión con el promotor de GPD1 de S. cerevisiae y la secuencia codificadora de ambas especies (pGREG526-GPD1Scer-Skud). La modelización de la estructura de la enzima Gpd1p se realizó por medio del programa MODWED online basado en el software Modeller. Los niveles de glicerol se determinaron enzimáticamente por medio de un kit comercial (AMS-SYSTEA) adaptado a un instrumento automatizado ECHO y también por medio de HPLC acoplado a un detector de índice de refracción (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). La expresión de los genes GPD1, GPD2, GPP1 y GPP2 se cuantificó por qRT-PCR (quantitative real-time PCR) usando Light Cycler FastStart DNA MasterPLUS SYBR green (Roche Applied Science, Germany) con el aparato LightCycler® 2.0 System (Roche Applied Science, Germany). La actividad de Gpd1p citoplasmática se determinó en extractos celulares brutos. El contenido proteico total se estimó con Bio-Rad Protein y albumina de suero bovino como patrón. Las medidas de actividad obtenidas con las distintas concentraciones de sustrato se representaron y se ajustaron a la ecuación de Michaelis-Menten por regresión no lineal, usando GraphPad Prism 6.0 Software Enzyme Kinetics package, que permite calcular directamente la Vmax y Km. Todos los experimentos se realizaron por triplicado. 2. Comparar el balance de glicerol entre distintas especies del genero Saccharomyces durante estrés osmótico y por frío. Para llevar a cabo este objetivo se estudió la expresión de cuatro genes clave para el balance del glicerol en cuatro especies con potencial biotecnológico (S. cerevisiae; S. paradoxus; S. uvarum and S. kudriavzevii). También se estudió la función del transportador de glicerol Stl1p en la supervivencia a cambios osmóticos y viabilidad celular en ambientes de vinificación. Se usaron dos cepas distintas de cada especie. En S. cerevisiae, la cepa vínica modelo T73 y la comercial Fermol Cryophile FCry (AEB group). Las cepas 108 y Chr16.2, aisladas de ambientes naturales, se usaron como representativas de la especie S. paradoxus. En S. uvarum, se emplearon las cepas 12600 y BMV58 aisladas en ambientes de vinificación en España. La cepa BMV58 fue patentada (patente ES2330709 B1) e implementada por Lallemand® Inc. por su alta producción de glicerol y buenas propiedades fermentativas. En la especie S. kudriavzevii, se usó la cepa tipo IFO1802 y la salvaje CR85 aislada en España. La cepa BY4741Δhog1Δstl1 fue usada como cepa de laboratorio para la expresión de los genes STL1 de las distintas especies y comparación de la función de sus productos bajo estrés osmótico. Las vinificaciones se realizaron en botellas de 250 mL con mosto sintético MS300 a 12 ºC y 100 rpm. La tolerancia al estrés osmótico se evaluó diariamente por drop tests en placas con YPD; YPD + 0.8 M NaCl; YPD + 1.25 M KCl, incubadas a 12 ºC y 25 ºC. Para comparar el crecimiento de las distintas especies se usaron cultivos en placa con YPD con 2 M sorbitol o 2 M KCl y suplementado o no con glicerol 1mM. Para investigar las diferencias funcionales de Stl1p, el crecimiento de las células de BY4741Δhog1Δstl1 transformadas con plásmidos adecuados se siguió en placas con SC-ura en presencia de 0.7 M sorbitol o 0.3 M KCl. Las placas contenían o no glicerol 10 mM. Los plásmidos que expresan el gen STL1 de las cepas T73 de S. cerevisiae, BMV58 de S. uvarum e IFO1802 de S. kudriavzevii bajo el control del promotor del gen NHA1 se construyeron por sustitución de la secuencia codificadora del gen NHA1-985 (derivado del plásmido YEp352) por medio de recombinación homóloga. Las concentraciones de glicerol y azúcares residuales (glucosa y fructosa) se determinaron en las muestras de mosto y medio por HPLC acoplado a un detector de índice de refracción (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). La expresión de los genes GPD1, GPD2, STL1 y FPS1 se cuantificó por qRT-PCR (quantitative real-time PCR) como se ha descrito más arriba. 3. Conocer las diferencias metabólicas entre cepas vínicas y no vínicas de S. cerevisiae genéticamente definidas bajo distintas condiciones de fermentación. En este apartado se estudiaron 94 cepas de S. cerevisiae tanto a nivel de secuencias como en relación a los rendimientos de sus metabolitos fermentativos. Otras especies del género Saccharomyces (S. uvarum, S. eubayanus, S. kudriavzevii, S. arboriculus, S. mikatae and S. paradoxus) se estudiaron también metabólicamente en una primera condición fermentativa. Otras 19 cepas previamente caracterizadas genéticamente por Liti et al. (2009) apenas tuvieron sus secuencias de DNA usadas como referencia genética en el estudio de filogenia. 58 de todas esas cepas de S. cerevisiae se eligieron al azar y se estudió su metabolismo en varias condiciones de crecimiento. Las micro-fermentaciones se hicieron a 25 ºC en 1.8 mL de medio YPD o SC en micro-placas (New Greiner Bio-one 96-well Masterblock, 2.4mL Polypro) cubiertas de manera no hermética con tapa de placas de micro titulaciones (Fischer Scientific). Las cuatro condiciones fermentativas empleadas fueron: (1) Con medio YPD; (2) con YPD en ausencia de oxígeno; (3) con medio mínimo SC; (4) con medio SC en ausencia de aminoácidos. Las concentraciones de glucosa, etanol y ácidos orgánicos (pirúvico, acético, succínico y láctico) se determinaron en las muestras al final de las fermentaciones (niveles de glucosa ≤ 0.5g/L) por HPLC (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) con un detector de índice de refracción. El DNA de las levaduras se aisló siguiendo el protocolo descrito por Querol et al. (1992) y las amplificaciones por PCR de los genes nucleares EGT2, CAT8, BRE5 y GAL4 se realizaron con la enzima Taq Phusion DNA polimerasa de Finnzymes®. Las reacciones de secuenciación se hicieron con el kit BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Warrington, UK). Las secuencias de DNA codificadoras de los cuatro genes y representativas de las 113 cepas de S. cerevisiae fueron obtenidas y analizadas. Los alineamientos de secuencia se hicieron por medio del programa MEGA5 y para cada cepa se concatenaron los 4 genes en una única secuencia para la construcción de un árbol filogenético por medio del programa SpliTstree4 v.4.13.1 (Huson y Bryant, 2006) con los parámetros Jukes Cantor characters, NeighborNet, EqualAngle. Conclusiones 1. Comprender los mecanismos moleculares reguladores de la elevada síntesis de glicerol por cepas de la especie S. kudriavzevii en condiciones de vinificación. En primer lugar nos centramos en comprender los mecanismos moleculares reguladores de la elevada síntesis de glicerol por cepas de la especie S. kudriavzevii en condiciones de vinificación. La especie S. kudriavzevii es capaz de producir altos niveles de glicerol y crecer a bajas temperaturas. Para explicar esta observación a nivel molecular se ha estudiado la expresión de los genes implicados en la ruta de síntesis de glicerol (GPD1, GPD2, GPP1 y GPP2) y se ha observado una expresión más alta de GPD1 en S. kudriavzevii en comparación con S. cerevisiae en condiciones de micro-vinificación. También se ha detectado una mayor actividad enzimática de Gpd1p en S. kudriavzevii en respuesta a estrés por frío y osmótico y se ha demostrado que la enzima de esta especie presenta una mayor actividad catalítica que contribuye al aumento de la producción de glicerol. Finalmente, también se ha comparado la producción de glicerol entre las enzimas de ambas especies y con una variedad recombinante entre ambas, con el mismo fondo genético y se ha encontrado que la enzima de S. kudriavzevii produce mayores niveles de glicerol en distintas temperaturas de crecimiento, 12 o 28 °C. Los datos obtenidos en este trabajo destacan que la adaptación de esta especie se ha debido principalmente a la actividad enzimática de Gpd1p. Por otro lado, la adaptación de S. cerevisiae está más relacionada con el aumento de la regulación de la expresión de genes implicados en la ruta de síntesis de glicerol. 2. Comparar el balance de glicerol entre distintas especies del genero Saccharomyces durante estrés osmótico y por frio. Comparamos el balance de glicerol entre distintas especies del genero Saccharomyces durante estrés osmótico y frío. Para llevar a cabo este objetivo se estudió la expresión de los cuatro genes clave para el balance del glicerol en las especies S. cerevisiae; S. paradoxus; S. uvarum and S. kudriavzevii. También se estudió la función del transportador de glicerol Stl1p en la supervivencia a cambios osmóticos y viabilidad celular en ambientes de vinificación, mostrando diferencias significativas de expresión para S. uvarum, indicando que este podría ser la característica por la que esta especie es más osmotolerante y produce más glicerol, la capacidad de regular mejor la concentración de glicerol intracelular. Las cuatro cepas estudiadas exhiben distintas estrategias de supervivencia bajo condiciones de estrés osmótico u osmótico-frío. En todas las especies, el balance de glicerol intracelular, que depende de su producción, salida, entrada y de otros factores minoritarios, se altera dando lugar a un aumento de sus niveles. Por otro lado, mientras que en la especie S. cerevisiae hay más alteraciones en los niveles de producción, las demás tienden a depender más de la variación del transporte de glicerol al interior celular como ocurre en S. uvarum o S. kudriavzevii. Esta última conclusión se ha demostrado mediante la clonación de los alelos del gen STL1 de las 3 especies en un mismo fondo genético, y pudimos comprobar que cuando la cepa tenía el alelo de S. uvarum o S. kudriavzevii aumentaba su capacidad de crecer en altos estreses osmóticos, así como incrementaba la producción de glicerol y la cantidad de glicerol intracelular. 3. Conocer las diferencias metabólicas entre cepas vínicas y no vínicas de S. cerevisiae genéticamente definidas bajo distintas condiciones de fermentación. Durante la ejecución de esta parte del proyecto incluimos cepas de la especie S. cerevisiae aisladas de otros procesos fermentativos (no vínicos y naturales) como controles y observamos que el metabolismo de estas cepas era más próximo a las especies no-cerevisiae que a las cepas vínicas; este resultado nos pareció muy interesante, ya que confirmábamos nuestra hipótesis, que las cepas vínicas han sufrido una especiación. Por este motivo el estudio se ha realizado con 104 cepas que incluyen representantes de las especies S. uvarum, S. eubayanus, S. kudriavzevii y S. paradoxus, así como cepas de la especie S. cerevisiae vínicas y no vínicas. Las cepas de S. cerevisiae genéticamente caracterizadas como cepas vínicas forman un grupo homogéneo y filogenéticamente distante a las otras cepas caracterizadas como grupos puros no vínicos, que muestran más alta variabilidad genética y metabólica entre ellas mismas. Las cepas de S. cerevisiae vínicas y las no vínicas se diferencian por sus perfiles respiro-fermentativos. Los análisis de rendimiento metabólico del etanol y glicerol juntamente con los ácidos orgánicos indican que las cepas no vínicas, al igual que las especies diferentes a “cerevisiae” poseen una mayor capacidad respiratoria que las cepas vínicas. Los resultados indican que las cepas vínicas tienen capacidad de respiración aerobia más limitada y su metabolismo central es prioritariamente fermentativo. Estas cepas se han adaptado para el aumento de la eficiencia de la estrategia de vida conocida como “make-accumulate-consume”. Por otro lado, las cepas no vínicas demuestran un metabolismo respiro-fermentativo más equilibrado y más eficientes en su adaptación a rápidos cambios ambientales, debido a que pueden balancear la intensidad del flujo metabólico entre las rutas respiratoria y fermentativa. En el análisis metabólico-fermentativo realizado para llevar a cabo este objetivo, destaca la aplicabilidad biotecnológica de algunas cepas aquí estudiadas. La mayor parte de ellas serían cepas no vínicas con eficiencia fermentativa similar a las cepas vínicas, pero también pueden tener aplicación biotecnológica las cepas vínicas con altos rendimientos en glicerol y bajos en ácido acético. Además de estas cepas de S. cerevisiae con potencial de utilización directa como iniciadoras en procesos de vinificación, otras con propiedades metabólicas específicas pueden estudiarse mejor por medio de evolución adaptativa o técnicas de ingeniería metabólica con vistas a mejorar e expandir su aplicabilidad biotecnológica.