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The nematode Strongyloides stercoralis is the causative agent of human
strongyloidiasis. Since the life cycle of this parasite allows autoinfections,
strongyloidiasis can become a chronic disease in immunocompetent
individuals, while in immunocompromised is not rare the evolution to a severe
and even a fatal course of the infection. The region of La Safor valenciana has
been considered an endemic focus of the parasite since more than a century
ago, with hundreds of cases diagnosed since then; strongyloidiasis is a sanitary
problem in this region.
This Doctoral Thesis provides new information about the protein content of
the infective stage of the parasite, L3i larvae, in order to identify new
molecules that could be applied in diagnosis. An analysis of the most abundant
transcripts of L3i larvae was performed, cloning 8 of them, and finally
obtaining 5 fragments of recombinant proteins: Major antigen, 14-3-3 zeta
protein, Puromycin-sensitive aminopeptidase, Ferritin 1 and Aspartic protease
4. Also, several assays to evaluate antigenicity of these fragments, as well as
the capacity of recognition by antibodies in serum of infected patients were
done. In the same way, polyclonal antibodies have been generated against 3
fragments of recombinant proteins: 14-3-3 zeta, Ferritin 1 and Aspartic
protease, which were employed as a diagnostic tool for the identification of
the parasite.
With the same purpose, synthetic peptides from the proteins of L3i larvae,
Metalloproteinase, Tropomyosin and Galectin, were produced.
Immunoenzymatic assays using serum of infected patients demonstrate
greater immunogenic potential in 2 of the 9 synthetic peptides, with good
sensitivity (up to 93%).
Finally, an immunolocalization study of 14-3-3 zeta, Ferritin 1 and Protease
aspartic 4 proteins was performed on larvae L3i cuts of S. stercoralis, using the
polyclonal antibodies produced previously at the laboratory, also it has
contributed to the improvement of the morphological knowledge of the
surface of the L3i larvae, carried on by analysis with Scanning Electron
Microscopy (SEM).El nematodo Strongyloides stercoralis es el principal causante de la
estrongiloidiasis humana. Debido a la capacidad del parásito de perpetuar un
ciclo autoinfectivo la infección puede prolongarse durante años en el
hospedador, dando lugar a una enfermedad crónica en personas
inmunocompetentes, mientras que en condiciones de inmunosupresión puede
desembocar en cuadros clínicos graves con elevadas tasas de mortalidad. La
región de La Safor valenciana ha sido considerada foco endémico de este
parásito desde hace más de un siglo, habiéndose diagnosticado cientos de
casos desde entonces, suponiendo un problema sanitario en la región.
La presente Tesis contribuye a la mejora en el conocimiento proteómico de la
larva infectante del parásito, L3i, con el fin de identificar nuevas moléculas
para el diagnóstico de la enfermedad. Para ello se ha realizado un análisis de
los transcritos más abundantes de la larva L3i, clonándose 8 de ellos, y
obteniendo finalmente 5 fragmentos de proteínas recombinantes: Antígeno
principal-Major antigen, 14-3-3 zeta, Aminopeptidasa sensible a puromicina,
Ferritina 1 y Proteasa aspártica 4. Se han realizado diferentes ensayos para
valorar la antigenicidad de estos fragmentos proteicos y su capacidad de ser
reconocidos por los anticuerpos presentes en los sueros de pacientes
enfermos. Además, se generaron anticuerpos policlonales frente a fragmentos
de las proteínas 14-3-3 zeta, Ferritina 1 y Proteasa aspártica 4, evaluándose su
posible utilidad como herramienta diagnóstica específica para S. stercoralis.
Con idéntico fin, se han producido péptidos sintéticos a partir de las proteínas
14-3-3, Metaloproteinasa, Tropomiosina y Galectina identificadas en larvas L3i
de S. stercoralis. Los ensayos inmunoenzimáticos, utilizando sueros de
pacientes de diversos orígenes, han demostrado mayor reconocimiento para 2
de los 9 péptidos sintetizados, obteniéndose buenos resultados en cuanto a
sensibilidad (hasta del 93%).
Finalmente se han realizado estudios de inmunolocalización de las proteínas
14-3-3 zeta, Ferritina 1 y Proteasa aspártica 4 en cortes de vermes utilizando
los anticuerpos policlonales producidos, y se ha contribuido a mejorar el
conocimiento morfológico de la L3i, realizando un estudio de la superficie del
parásito mediante microscopia electrónica de barrido.
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