En la presente tesis nos hemos centrado en el estudio del papel de las especies S. uvarum y S. kudriavzevii en la síntesis de aromas y como principal aplicación en la elaboración de vinos. En estudios anteriores, estas dos especies, estrechamente relacionadas con S.cerevisiae, mostraron diferencias notables durante la producción de alcoholes superiores y ésteres cuando se comparaban con S. cerevisiae (Gamero et al., 2013; Pérez-Torrado et al., 2015). Los alcoholes superiores y ésteres formados por las levaduras, son componentes claves en el sabor y el aroma de los productos fermentados. Tal y como hemos mencionado previamente, S. kudriavzevii y S. uvarum presentan diferencias muy significativas en la formación de estos compuestos aromáticos al comparar con S. cerevisiae. Por lo tanto, el principal objetivo de la presenten tesis fue profundizar en la comprensión de los aspectos moleculares básicos responsables de las estas diferencias. En la primera parte de la tesis se estudia cómo las tres especies del género Saccharomyces difieren en la producción de aromas a partir de los aminoácidos precursores de dichos compuestos. Este objetivo se llevó a cabo mediante el crecimiento de cepas de S. cerevisiae, S. uvarum y S. kudriavzevii usando como única fuente de nitrógeno, los correspondientes aminoácidos de forma individual, y siguiendo la producción de alcoholes superiores y ésteres de acetato. El análisis global de los resultados obtenidos en este capítulo indicó que S. kudriavzevii produce una mayor cantidad de alcoholes superiores, mientras que S. uvarum se caracteriza por ser la especie que produce mayor cantidad de ésteres de acetato. En concreto, S. uvarum es la especie que produce las mayores cantidades de acetato de 2-feniletilo y S. kudriavzevii del precursor de dicho acetato, el 2-feniletanol. Los resultados obtenidos en este capítulo nos indican diferencias importantes en el metabolismo de los aminoácidos y la producción de alcoholes superiores, así como de ésteres de acetato entre las tres especies del género Saccharomyces, estrechamente relacionadas. A continuación decidimos explorar las divergencias aminoacídicas en 23 enzimas ortólogos que participan en la producción de alcoholes superiores y ésteres de acetato en las especies S.kudriavzevii o S. uvarum, comparadas con las secuencias de S. cerevisiae. Para alcanzar este objetivo se realizó un estudio in silico de un alineamiento múltiple de secuencias y un posterior análisis de las distancias de Grantham, basadas en las diferencias de las propiedades físico-químicas de los reemplazamientos aminoácidos (Grantham, 1974; Li et al., 1984). El análisis reveló que tres secuencias mostraron valores de Grantham significativamente más elevados: la 2-cetoácido descarboxilasa codificada por el gen ARO10, y dos alcohol acetil transferasas, codificadas por los genes ATF1 y ATF2. Los estudios llevados a cabo en la última parte de la tesis se diseñaron para evaluar el efecto de forma individual de los alelos ARO10, ATF1 y ATF2 de las especies S. kudriavzevii y S. uvarum, en la producción de alcoholes superiores y ésteres de acetato respectivamente. En estos capítulos también nos centramos en evaluar las propiedades cinéticas y de especificidad por sustrato de las respectivas enzimas. La expresión individual de los alelos ARO10, ATF1 y ATF2 procedentes de S. kudriavzevii y S. uvarum en una cepa de S. cerevisiae donde se habían disrumpido dichos genes, mostraron diferencias en la producción de alcoholes superiores y ésteres de acetato. Todos los datos descritos y analizados en este trabajo indican que las variaciones de aminoácidos observadas entre las descarboxilasas codificadas por los genes ortólogos ARO10 y entre las AATases codificadas por los genes ortólogos ATF1 y ATF2 podrían ser la razón de las diferencias enzimáticas observadas, y por tanto también podrían ser la razón de la mejora en el aroma de los vinos al fermentar con las especies S. kudriavzevii y S. uvarum respecto a S. cerevisiae.The species of the genus Saccharomyces, S. kudriavzevii and S. uvarum revealed significant differences during the formation of fermentative aroma as compared to S. cerevisiae. The main goal of this PhD thesis was to obtain a deeper fundamental understanding of the molecular aspects behind these differences. First part of the thesis describes observed differences among Saccharomyces kudriavzevii and Saccharomyces uvarum during the production of aroma-active higher alcohols and acetate esters using their amino acidic precursors comparing to Saccharomyces cerevisiae. Subsequent in silico comparative analysis of the enzymes involved in the branched-chain amino acids catabolism in S. cerevesiae, S. kudriavzevii and S. uvarum released ARO10, ATF1 and ATF2 as the candidates for further experiments. The heterologous expression of the individual ARO10, ATF1 and ATF2 alleles in a host S. cerevisiae resulted in the enhanced production of several higher alcohols and acetate esters. All together the data described and discussed in this thesis indicate that the amino acid variations observed between the decarboxylases encoded by the orthologues ARO10 genes and between the AATases encoded by the orthologues ATF1 and ATF2 genes could be the reason for the distinct enzyme properties, which possibly lead to the enhanced production of several flavour compounds. The main objects of the research presented in this dissertation were S. kudriavzevii and S.uvarum. In previous studies these two species, closely related to S. cerevisiae, showed remarkable differences during the production of higher alcohols and esters when comparing the three species (Gamero et al., 2013; Pérez-Torrado et al., 2015).
Higher alcohols and esters formed by yeast belong to key components of overall flavour and aroma in the fermented products. As already mentioned, S. kudriavzevii and S. uvarum revealed significant differences during the formation of these important flavour-active compounds as compared to S. cerevisiae. The main goal of this PhD thesis was to obtain a deeper fundamental understanding of the molecular aspects behind these differences. First part of the thesis investigates how the three Saccharomyces species differ during the production of higher alcohols and acetate esters that derived directly from their amino acidic precursors. This objective was fulfilled by carrying out cultivations of S.cerevisiae, S. uvarum and S. kudriavzevii strains with individual amino acids as the sole nitrogen source, followed by analysis and comparison of the produced higher alcohols and acetate esters. The global volatile compound analysis revealed that S. kudriavzevii produced large amounts of higher alcohols, whereas S. uvarum excelled in the production of acetate esters. Particularly from phenylalanine, S.uvarum produced the largest amounts of 2-phenylethyl acetate, while S. kudriavzevii obtained the greatest 2-phenylethanol formation from this precursor. Altogether, the data discussed in Chapter 1 indicated differences in the amino acid metabolism and subsequent production of flavour-active higher alcohols and acetate esters among these closely related Saccharomyces species. Subsequently, in silico comparative analysis of the enzymes involved in the branched-chain amino acids catabolism in S. cerevesiae, S. kudriavzevii and S. uvarum was performed in order to explore the amino acid divergences among the orthologous sequences. In silico screening was based on multiple sequence alignments and the Grantham scoring. The Grantham scoring provides a quantitative assessment of the biochemical distances between amino acids, on the basis of their composition, polarity and molecular volume, and according to increasing dissimilarity classifies the amino acid substitutions as conservative or radical (Grantham, 1974; Li et al., 1984). The analysis released three sequences that were evaluated with significantly higher Grantham scores: 2-keto acid decarboxylase encoded by ARO10, and two alcohol acetyltransferases encoded by ATF1 and ATF2. The last part of the thesis then investigates the impact of the selected genes on the production of higher alcohols and acetate esters, and the catalytic properties of the corresponding enzymes. The heterologous expression of the individual ARO10, ATF1 and ATF2 alleles from S. kudriavzevii and S. uvarum in a host S. cerevisiae resulted in the enhanced production of several higher alcohols and acetate esters. All together the data described and discussed in this thesis indicate that the amino acid variations observed between the decarboxylases encoded by the orthologues ARO10 genes and between the AATases encoded by the orthologues ATF1 and ATF2 genes could be the reason for the distinct enzyme properties, which possibly lead to the enhanced production of several flavour compounds.