Virgin adult female mice display nearly spontaneous maternal behaviour towards unfamiliar pups. Thus, maternal care is hormone-independent and triggered by pup-derived stimuli. Anosmia suppresses maternal care, or even causes infanticide behaviours in dams, so mothers do not display maternal care toward pups in absence of the detection pup-chemosignals. To investigate the neural basis of maternal behaviours, we have characterized the maternal behaviours displayed by nulliparous CD1 female mice. To do so, a group of virgin females (godmothers) were exposed to prolonged cohabitation with a lactating female and her litter from the moment of delivery, whereas a second group (pup-sensitized females), were exposed 2h-daily to foster pups. Both groups were tested for maternal care on postnatal days 2-4. Godmothers retrieved pups as quick as dams from the first test, and they expressed higher rates of crouching than dams. By contrast, pup-sensitized females differed from dams in all measures of maternal behaviour during the first test, but expressed full maternal behaviour after 2 sessions of contact with pups. Conversely, maternal aggression is governed by both intrinsic and extrinsic factors. The extrinsic factors are related with the pheromonal cues of the intruder, whereas the intrinsic factors influencing maternal aggression are less understood. Female mice are not aggressive, but during two weeks after parturition, when they fiercely attack intact but not castrated males approaching the nest. This seems a change in the response to male pheromones with two alternative explanations. Maternal aggression could be a cognitive response of the dams to protect their pups from threatening (infanticide) intruders. Alternatively, maternal physiology (e.g. hormones) might change socio-sexual behaviour by acting on the detection of or the response to pheromones. We report three experiments that test the hypothesis that maternal physiology induces reversible changes in dam’s CNS that dramatically alter their responsiveness to sexual pheromones. If maternal aggression were merely cognitive, maternal (sensitised) non-lactating females would show pup defence. We checked whether godmothers show aggression (pup defence) against male intruders as compared to dams or virgin females. The results of this experiment indicate that only dams were aggressive and confirmed that they attacked preferentially intact rather than castrated male intruders. This does not support a cognitive nature of maternal aggression but rather suggests a transient change in the nervous system of the female likely induced by endocrine agents. Additionallyt, we wanted to prove whether the male pheromone attractive to non-lactating females (a urine-borne protein named darcin) promotes attacks of the dams directed to intruders bearing it. Thus, we analysed maternal aggression in dams and godmothers (controls). Females were confronted to castrated males that had been swabbed with one of three different stimuli: saline buffer (control), recombinant darcin (r-darcin) or intact male urine. The results show that dams attack with shorter latency and for much longer time than godmothers. Moreover, urine- and r-darcin-swabbed castrated males were equally attacked but received significantly more attack than control castrated males. Therefore, darcin is detected by lactating dams, but the response to this pheromone changes from attraction to aggression, thus indicating that transient changes occur in the brain of the lactating female that switch its socio-sexual circuitry to an aggressive state. Further, it suggests that the neurobiological bases of pup-oriented and non-pup- oriented components of maternal behaviour are different. Thus, we analysed the expression of oxytocin and arginine-vasopressin in the region extended between anterior commissure and the anterodorsal preoptic area (AC/ADP) and the paraventricular hipothalamic nucleus of the maternal brain of godmothers and dams. Both nuclei are critical for the expression of maternal behaviour. In the study of nonapeptidergic positive cells in both nuclei there were no global differences between groups in the expression of oxytocin, arginine-vasopressin or the co-expression of both peptides. However, we found a positive correlation between the number of OT-expressing neurons in the AC/ADP, a region located in the hypothalamus, and the aggressive behaviour displayed by lactating females. Thus, oxytocin might contribute to the expression of maternal aggression, on top of the effect of hormonal agents related to motherhood.1. INTRODUCCIÓN El comportamiento parental se da en una gran amplia variedad de especies de vertebrados e invertebrados, pero es especialmente importante en mamíferos y aves (Numan and Insel, 2003). Numan e Insel definieron este comportamiento como “cualquier comportamiento de un miembro de una especie hacia un conespecífico reproductivamente inmaduro que incrementa las probabilidades de que el receptor sobreviva hasta la madurez” (Numan e Insel, 2003). Aunque, especialmente en mamíferos, la mayor parte del cuidado lo llevan a cabo las hembras, en algunas especies los machos muestran comportamiento parental, lo que se conoce como comportamiento paternal. Por otro lado, en algunas aves y mamíferos, incluida la especie humana, también se da el comportamiento aloparental, en el cual un adulto dirige sus cuidados hacia una cría con la cual no está relacionado genéticamente (Riedman, 1982). Esto sugiere que mientras en unas especies el comportamiento maternal está estrictamente asociado al estado fisiológico del adulto (comportamiento maternal estricto), en otros (comportamiento paternal, comportamiento aloparental) el cuidado de las crías se da con cierta independencia de la situación fisiológica del animal. El comportamiento maternal, tiene una profunda influencia sobre el desarrollo de los recién nacidos. Tanto la calidad como la cantidad de este comportamiento afectan al desarrollo de la prole. En este sentido, el comportamiento maternal es sumamente importante porque afecta a algunos aspectos fenotípicos de las crías (Li et al., 2015; Meaney, 2001; Pan et al., 2014; Pedersen et al., 2011). Muchos estudios, algunos de ellos llevados a cabo en humanos, revelan que un trastorno en las relaciones madre-hijo durante la vida postnatal temprana, como el provocado por la separación materno-filial, altera la regulación neuroendocrina y provoca retrasos psicomotores y cognitivos en los hijos (Mehta et al., 2009; Rutter et al., 2012). Uno de los sistemas que se ve afectados en mayor medida es el eje hipotalámico-pituitario-adrenal (HPA), que controla las respuestas a estrés. De hecho existe evidencia clara de que la alteración de la relación materno-filial durante este periodo puede alterar las respuestas al estrés en la vida futura de las crías. Debido a que el eje HPA de roedores comparte muchas características moleculares y neurobiológicas con el eje HPA humano (Gilles et al., 1996; Walker et al., 1986), el roedor se usa como un buen animal modelo para el estudio de este fenómeno. Este importante papel del comportamiento parental (sobre todo del maternal) en la salud presente y futura de los hijos justifica sobradamente la investigación de la biología del comportamiento maternal, con el fin de optimizarlo y combatir de forma efectiva sus alteraciones y patologías. En este sentido, nuestro conocimiento de las bases neurales y endocrinas del comportamiento maternal está basado principalmente en estudios llevados a cabo en ratas en los últimos 50 años. Durante las últimas décadas, sin embargo, ha ido creciendo el interés por el ratón como especie de estudio debido a las grandes ventajas del uso de individuos genéticamente modificados en los estudios de la neurociencia. Estos estudios han revelado importantes diferencias entre el comportamiento maternal de ambas especies, rata y ratón, siendo el ratón más semejante en este sentido a los primates, incluyendo la especie humana, que las ratas. La principal diferencia entre ambas especies es que las ratas poseen un comportamiento maternal exclusivamente asociado a la fase de maternidad, ocurriendo espontáneamente sólo durante el período de lactancia. De hecho, una rata no lactante -especialmente si es nulípara- tiende a evitar las crías que le generan una cierta ansiedad, y sólo la exposición reiterada a crías de corta edad durante 5-7 días, acaba por provocar primero una habituación y tolerancia a la presencia de las mismas, y después una exploración de las crías seguida de un comportamiento casi completo de cuidado de las crías (ver Numan e Insel, 2003). A este fenómeno se lo conoce como sensibilización maternal. Esta situación contrasta con la observada en primates no humanos (y evidentemente en humanos). Así, las hembras vírgenes de macaco muestran un comportamiento maternal espontáneo (Maestripieri y Wallen, 1995). Por esta razón, la rata no parece ser la mejor especie para comprender algunos aspectos de la neuroendocrinología del comportamiento maternal de los primates, incluyendo al humano. Por el contrario, como veremos, las hembras vírgenes de ratón de cepas de laboratorio sí que exhiben un comportamiento maternal casi espontáneo, sin apenas necesidad de sensibilización maternal. De ser esto cierto, el comportamiento maternal de ratones se asemejaría al de los primates. Mientras en las ratas el comportamiento maternal parece estar regulado por la fisiología de la maternidad, con un previsiblemente importante papel de la regulación endocrina del comportamiento, en ratones -como en primates- sería relativamente independiente de hormonas. Por ello, vamos a centrarnos en la neurobiología y neuroendocrinología del comportamiento maternal del ratón, que es la especie en la que hemos llevado a cabo este estudio. 1.1 BASES HORMONALES Y NO HORMONALES DEL COMPORTAMIENTO MATERNAL DEL RATÓN En roedores, los investigadores han diferenciado entre los comportamientos maternales que son dirigidos hacia las crías de aquellos que no (Numan e Insel, 2003). Así, los comportamientos maternales incluyen respuestas dirigidas a las crías como recogerlas y agruparlas en el nido, cubrirlas, protegerlas y abrigarlas con el propio cuerpo, acicalarlas y limpiarlas, así como amamantarlas. Las respuestas no dirigidas a las crías incluyen construir y mantener el nido, ingerir alimentos con mayor fruición (hay un cambio claro de requerimientos nutricionales), así como la llamada agresión maternal (Numan e Insel, 2003). Se trata de un comportamiento agresivo asociado a la defensa del nido (Vom Saal et al., 1995) frente a adultos intrusos, potencialmente infanticidas. Además, las repuestas no dirigidas a las crías incluyen una disminución en la ansiedad relacionada con un incremento en la actividad exploratoria (Bridges, 2015). Durante el periodo preparto, las hembras preñadas ya muestran altos niveles de agresión hacia intrusos -a menudo se habla de agresión preparto como una entidad comportamental independiente, a nuestro juicio erróneamente- y comienzan a construir el nido (Caughey et al., 2011). Los estudios sugieren que existe una motivación intrínseca que promueve un comportamiento maternal casi espontáneo en las hembras de ratón (Alsina-Llanes et al., 2015; Gandelman et al., 1970; Stolzenberg y Rissman, 2011), debido a que las hembras vírgenes de ratón no evitan las crías cuando son expuestas a ellas por primera vez, sino que las recogen y agrupan en un nido improvisado (Alsina-Llanes et al., 2015; Gandelman, 1973). Estos datos sugieren que el comportamiento maternal de ratones es independiente de los eventos endocrinos relacionados con la preñez, como por ejemplo, los niveles de esteroides o prolactina. Uno de los objetivos de este trabajo es caracterizar el estos aspectos del comportamiento maternal en ratones usando la cepa no consanguínea CD1. Para ello compararemos el comportamiento de las madres con el de dos tipos de hembras vírgenes que serán expuestas a crías mediante diferentes procedimientos. Las comadres son vírgenes que comparten con la madre el cuidado de las crías desde el momento del parto. Las hembras sensibilizadas por el procedimiento tradicional, son expuestas a crías en su caja durante períodos diarios de 2 horas. Queremos comprobar cómo se desarrollan en estos animales los comportamientos maternales, usando las madres como el control positivo. 1.1.1 Hormonas y comportamiento maternal Los estudios llevados a cabo en ratas indican que la sensibilización maternal (que permite expresar comportamientos maternales a hembras vírgenes) es facilitada por esteroides y prolactina (Bridges y Ronsheim, 1990; Bridges et al., 1990). Por el contrario, como hemos visto, en ratones el cuidado maternal muestra cierta independencia hormonal, si bien los resultados no son claros. Por un lado, la deleción del gen del receptor de la prolactina elimina por completo la expresión del cuidado maternal por parte de la madre (Lucas et al., 1998). Por otro lado, estudios recientes usando mutantes dirigidos de una de las moléculas de señalización de la acción de prolactina contradicen esta idea (Buonfiglio et al., 2015). Uno de los aspectos más estudiados del comportamiento maternal en el ratón es la agresión maternal, dado que los ratones son en general muy agresivos (más que las ratas). Para su estudio, la hembra lactante actúa como residente y se suele utilizar como intruso a un macho. En comparación con la agresión entre machos, la agresión maternal es cualitativamente diferente, ya que es menos ritualizada y es más violenta (Ervin et al., 2015; Parmigiani et al., 1998). Dado que la agresividad en hembras está restringida al período maternal, se especula cual puede ser el mecanismo fisiológico de inducción de agresión maternal. Aunque parece lógico pensar que el cóctel de hormonas que caracterizan el período de la maternidad pudieran tener un papel muy relevante, Garland y Svare (1988) propusieron que la agresión maternal podría ser independiente de hormonas, y ser inducida únicamente por el contacto con crías, específicamente por estímulos somatosensoriales producidos por la succión de los pezones durante la lactancia. De hecho, estos autores y su grupo realizaron estudios en hembras lactantes de ratón en los que les extirparon la hipófisis o las trataron con fármacos que inhiben la producción de prolactina, sin que se viera aparentemente alterada de la agresión maternal (Mann et al., 1980). Igualmente McDermott y Gandelman (1979) fueron capaces de promover agresión maternal en hembras vírgenes mediante exposición a crías y estimulación endocrina para el crecimiento de los pezones. Sin embargo, los altos niveles de agresión maternal preparto (Caughey et al., 2011; Mann et al., 1984), cuando aún no ha habido contacto con las crías, contradicen esta visión. Así pues, la regulación endocrina o no endocrina de la agresión maternal es un tema abierto al debate que vamos a estudiar en este trabajo. El segundo objetivo de nuestro trabajo es analizar esta cuestión comprobando si hembras vírgenes que muestran un comportamiento de cuidado maternal completo y poseen un nido que defender, las comadres, 1.1.2 Olfacción y comportamiento maternal en ratones Una de las maneras de comenzar el estudio de la neurobiología de un comportamiento es conocer qué estímulos regulan su expresión. En este sentido los ratones son animales macrosmáticos y sus comportamientos están guiados en gran medida por las señales químicas, entre las cuales hay feromonas. En roedores, el sentido del olfato está compuesto por dos sistemas, el olfatorio y el vomeronasal u olfativo accesorio (para mayor detalle ver Munger et al., 2009). El órgano sensorial del sistema olfativo accesorio es el órgano vomeronasal (VNO) que detecta feromonas que pueden estimular comportamiento sociales y respuestas endocrinas (Wysocki y Lepri, 1991). Por el contrario, el sistema olfativo principal detecta miles de moléculas volátiles (odorantes) mediante el epitelio olfativo. La detección de estas sustancias puede influir en todo tipo de comportamientos incluyendo sociales, anti-predatorios y alimentarios entre otros. En el sistema nervioso central, las vías de ambos sistemas quimiosensoriales, el vomeronasal y el olfatorio, discurren en paralelo (Boehm et al., 2005; Halpern y Martínez-Marcos, 2003) y están parcialmente segregadas. A pesar de eso, ambas convergen en ciertos núcleos amigdalinos (Cádiz-Moretti et al., 2014), pudiendo así controlar comportamientos tan complejos como el cuidado de las crías y la agresión maternal. Las señales olfativas que provienen de las crías guían los comportamientos maternales. Los primeros estudios indicaban que las lesiones del epitelio olfativo con ZnSO4 o las lesiones de los bulbos olfativos principales tienen un efecto suave y severo en la construcción del nido y comportamiento maternal, respectivamente. (Vandenbergh, 1973). De hecho, la extirpación del bulbo olfativo elimina el comportamiento maternal (Gandelman et al., 1971), y promueve ciertos comportamientos anti-maternales como el canibalismo de las propias crías (Gandelman et al., 1972). Otros estudios más recientes también apoyan la importancia de las señales olfativas de las crías en la regulación del comportamiento maternal de las madres. Así, la mutación nula del gen de la adenilil ciclasa de tipo 3 (AC3−/−), necesaria para la transducción olfativa, genera anosmia (Wong et al., 2000) y una disrupción completa de la expresión del comportamiento maternal, tanto en hembras vírgenes como en lactantes (Wang y Storm, 2011). Por otro lado, el sistema accesorio parece jugar un papel menor en las respuestas maternales, ya que las lesiones del VNO no afectan en la expresión de la construcción del nido y el cuidado maternal (Bean y Wysocki, 1989), mientras que mutaciones nulas del canal TRPC2, implicado en la transducción vomeronasal, apenas afecta a estos comportamientos (Hasen y Gammie, 2011, 2009; Kimchi et al., 2007). Pese a ello, como este sistema es crucial para la detección de las señales químicas relevantes en el contexto de las relaciones socio-sexuales, no es de extrañar que mutaciones en el canal TRPC y proteínas acopladas a los receptores de feromonas, sí supriman la agresión maternal (Hasen y Gammie, 2011; Kimchi et al., 2007; Leypold et al., 2002; Stowers et al., 2002). 1.1.3 Feromonas masculinas: de la atracción sexual a la agresión maternal En ratones la mayoría de feromonas que median las interacciones socio-sexuales son proteínas urinarias (MUPs) de la familia de las lipocalinas. Éstas contienen una cavidad para unir moléculas hidrofóbicas y volátiles de bajo peso molecular (Novotny et al., 1999). Existe un claro dimorfismo en la producción de las proteínas urinarias en ratones de laboratorio (Hurst y Beynon, 2013; Hurst, 1987), ya que los machos adultos son capaces de secretar de dos a ocho veces más que las hembras (datos de la cepa C57; Cheetham et al., 2009). Trabajos previos de nuestro laboratorio han demostrado que la hembra de ratón se ve atraída de forma innata por las feromonas masculinas no volátiles que contiene el lecho ensuciado por machos (Moncho-Bogani et al., 2002) y que estas feromonas son detectadas por el VNO (Martínez-Ricós et al., 2008). Trabajos posteriores de otro laboratorio consiguieron aislar la feromona responsable de la atracción sexual, siendo ésta una MUP específica de machos llamada darcina o Mup 20 (Roberts et al., 2010). La darcina por sí misma (la forma recombinante libre de odorantes, r-darcina) atrae a hembras y genera en ellas aprendizaje asociativo (Lanuza et al., 2014; Roberts et al., 2012) confiriendo atracción a odorantes con los que se asocia.. Además, se ha visto que no sólo promueve atracción, sino la agresión entre machos (Kaur et al., 2014). 1.2 NÚCLEOS NONAPEPTIDÉRGICOS Y COMPORTAMIENTO SOCIAL Los comportamientos sociales dependen de un circuito cerebral bien conservado en la evolución llamado la red sociosexual. Los nonapéptidos vasopresina (AVP) y oxitocina (OT) participan en el control de la mayoría de estos comportamientos (Insel y Young, 2000) y difieren en estructura únicamente en dos aminoácidos situados en la 3ª y 8ª posición. La OT y la AVP se conocen por su función como neurohormonas periféricas, secretadas al torrente sanguíneo en la neurohiopófisis por las neuronas neurosecretoras magnocelulares del hipotálamo. La OT promueve la eyección de leche durante la lactancia (Nishimori et al., 1996) y la contracción uterina durante el parto, mientras la AVP o también conocida como hormona antidiurética, incrementa la presión sanguínea también por su actividad vasoconstrictora. Pese a que hay dudas de que crucen la barrera hematoencefálica de vuelta al sistema nervioso central (Neumann y Landgraf, 2012), estos nonapéptidos se encuentran en el cerebro donde actúan como neurotransmisores o neuromoduladores en determinadas neuronas y conexiones de la red socio sexual cerebral. Las funciones de los neuropéptidos se llevan a cargo al unirse a sus receptores. Mientras la OT tiene un receptor específico (OTR), las vasopresina cuenta con tres tipos, de los cuáles dos (AVP1aR y 2R) se expresan en el sistema nervioso central (Neumann y Landgraf, 2008). Sin embargo la unión a estos receptores no es específica del todo. La OT se une al OTR pero este receptor también puede unirse a AVP con 100 veces menos de afinidad que por la OT (Manning et al., 2012), haciendo difícil la tarea de interpretar las funciones de cada nonapéptido. La distribución central de AVP está diferenciada en dos subpoblaciones, una de ellas constituida por las células magnocelulares hipotalámicas y otra, por neuronas dispersas en el polo caudal núcleo del lecho de la stria terminalis (BST) (Otero-Garcia et al., 2014; Rood et al., 2013). Éstas últimas muestran un claro dimorfismo sexual a favor de los machos, en los que la producción de AVP depende de testosterona (Otero-Garcia et al., 2014; Rood et al., 2013). Las proyecciones de estas neuronas a los centros de la red socio-sexual del cerebro son igualmente dimórficas. En la parte rostral del núcleo paraventricular hay células que están doblemente marcadas por OT/AVP. Éstas células se extienden desde la comisura anterior hasta el núcleo anterodorsal preóptico (AC/ADP; Otero-García et al., 2015). Forman así un grupo celular situado entre el MPOA y la parte ventral del BST (vBST), una región crucial para la expresión del comportamiento maternal en ratas (Numan y Numan, 1996; Numan et al., 2005b; Olazábal et al., 2002) y ratones (Tsuneoka et al., 2013). Además, Numan y Woodside, (2010) postulan que los comportamientos maternales podrían ser modulados por OT en el MPOA/BSTv. Esto sugiere que la región involucrada en el comportamiento maternal podría incluir al AC/ADP junto a MPOA-vBST. 2. OBJETIVOS 1. Caracterizar dos modelos diferentes de sensibilización maternal en hembras vírgenes de ratón de la cepa CD-1. 2. Investigar si el contacto íntimo y prolongado con las crías es suficiente para inducir agresión maternal en hembras vírgenes de ratón. 3. Investigar si las señales químicas masculinas, incluida la feromona atractiva sexual de macho darcina, promueven agresión maternal. 4. Investigar posibles cambios en el cerebro de la madre ocurridos durante la lactancia, específicamente en la expresión y co-localización de los neuropéptidos AVP y OT en los núcleos del cerebro supuestamente implicados en el comportamiento maternal . 3. MATERIAL Y MÉTODOS 3.1 ESTUDIO 1: CARACTERIZACIÓN DEL COMPORTAMIENTO MATERNAL EN RATÓN 3.1.1 Modelos de sensibilización maternal Hemos caracterizado el desarrollo del comportamiento maternal en hembras que han sido sometidas a dos protocolos diferentes de sensibilización en hembras vírgenes de ratón. A. Hembras sensibilizadas (protocolo tradicional). Hemos adaptado al ratón el procedimiento utilizado en ratas (Fleming y Luebke, 1981). Para ello expusimos hembras vírgenes que nunca habían tenido contacto con crías, a crías de una madre donante, 2h diarias durante 3 (en Sección 3.1.3.) o 4 días consecutivos. (en Sección 3.1.4). b. Comadres. Estas hembras fueron estabuladas con hembras preñadas a partir del día de gestación 5-7, y compartieron con ellas la gestación, parto y lactancia. Así, las comadres fueron expuestas a las crías desde el momento del parto y compartieron con las hembras lactantes el cuidado de las crías (Figura 8). 3.1.2 Test de comportamiento dirigido a las crías El test de comportamiento dirigido a las crías fue realizado diariamente en la caja de las propias hembras del día postparto (PPD) 2 a 4. Las hembras fueron testadas tras retirar de la caja la hembra acompañante. En el grupo de hembras lactantes y comadres, las ocho crías fueron retiradas con una espátula y posteriormente esparcidas por la caja. En el caso de las hembras sensibilizadas, recibieron ocho crías de una madre donante esparcidas de igual modo (Figura 10). El test, acabó 40 minutos después y los comportamientos se grabaron para su análisis posterior. Los grupos experimentales (y sus tamaños muestrales) de los experimentos están resumidos en la Tabla 1. 3.1.3 Test de agresión maternal Para evitar la interferencia de la realización de un test en el resultado de otro, para analizar este comportamiento usamos animales diferentes de los anteriores, en experimentos separados. En este experimento utilizamos como hembras experimentales madres, comadres, hembras sensibilizadas y hembras vírgenes inexpertas (sin contacto con crías), estabuladas como en el experimento anterior. El test de agresión maternal se llevó a cabo en la propia caja de las hembras (Figure 11) el PPD5 Las hembras fueron llevadas a las habitaciones de test y se retiraron, tanto las crías como las hembras acompañantes. Para el test, se introdujo un macho dentro de la caja por el lado contrario al nido y los grabamos su comportamiento durante 5 minutos para su posterior análisis. Tras ello, el intruso fue retirado, y se intercambió a la hembra para ser testada. Los grupos de animales experimentales (y el tamaño muestral) están recogidos en la Tabla 1. 3.1.4 Efecto de la presencia de las crías durante el test de agresión con comadres Para evaluar si la presencia de las crías promueve agresión maternal en las comadres, se llevaron a cabo tests de agresión maternal siguiendo el protocolo del experimento anterior, tanto en ausencia como en presencia de las crías, los días PPD4 y 5 respectivamente, utilizando un macho intacto como intruso. 3.2 ESTUDIO 2: ESTÍMULOS QUE PROMUEVEN LA AGRESIÓN MATERNAL 3.2.1 Maternal aggression test El test de agresión maternal fue realizado como en el estudio 1. El objetivo es conocer la capacidad de los diferentes estímulos de macho como promotores de agresión maternal, utilizando dos condiciones diferentes de intruso, machos castrados y machos intactos. El tipo y tamaño de los grupos experimentales están recogidos en la Tabla 2. 3.2.2 Análisis de las proteínas urinarias de ratón Analizamos el contenido de proteínas urinarias de la orina de hembras, machos intactos y machos intactos, utilizando una electroforesis simple siguiendo el protocolo de Lanuza et al., (2014). Para ello recogimos orina de un grupo de ejemplares de cada grupo, homogeneizamos la muestra y separamos las proteínas de la orina con el sistema PhastGel (General Electrics). 3.2.3 Propiedades promotoras de agresión de darcina recombinante en hembras lactantes Para conocer las propiedades promotoras de la agresión de la darcina, medimos los ataques de las hembras lactantes y las comadres (control negativo) hacia machos castrados cuya zona urogenital y cuello se roció con solución salina, darcina recombinante (r-darcina) u orina de macho intacto. El protocolo de agresión maternal fue idéntico al utilizado en el estudio 1 y el diseño experimental está resumido en la Tabla 2. 3.2.4 Agresión maternal en una arena neutral Hasta nuestro conocimiento, la agresión maternal se ha descrito como un comportamiento de protección del nido, ante la presencia de posibles depredadores. En este experimento evaluamos el nivel de agresión de las hembras lactantes y comadres en un ambiente neutro, fuera de su caja, en donde fueron introducidas antes que el macho intruso. Nuestra hipótesis es que las hembras solo serían agresivas hacia un macho intruso en las cercanías de su nido, cuando estuvieran en su propio territorio. Para esto, evaluamos la agresión maternal en unas cajas de 220 x 220 x 145 h mm. Tras 2 minutos de habituación de la hembra a la caja, introdujimos durante 5 minutos un macho castrado (n=7) al que habíamos aplicado orina de macho intacto. Los comportamientos se grabaron y posteriormente fueron medidos por alguien ajeno al experimento. El tamaño de los grupos y los tipos de animales experimentales utilizados están recogidos en la Tabla 2. 3.3 ESTUDIO 3: DISTRIBUCIÓN DE NONAPÉPTIDOS EN NÚCLEOS DEL CEREBRO MATERNAL 3.3.1 Perfusión, fijación y corte Los animales fueron sacrificados mediante sobredosis de pentobarbital y perfundidos a través del ventrículo cardíaco izquierdo con solución salina (5.5 ml) seguida de paraformaldehído al 4% en tampón fosfato 0.1M pH 7.4 a razón de 5.5 ml/min durante 12 minutos. Los encéfalos fueron extraídos cuidadosamente y sumergidos en sacarosa al 30% en tampón fosfato para su crioprotección. Acto seguido, los cortamos en un micrótomo de congelación y recogimos los cortes en 4-5 series paralelas, en función del experimento. Para la detección de AVP y OT por inmunofluorescencia usamos 2 de las 4 series obtenidas. Para la detección con inmunoperoxidasa, usamos dos (series 1 y 3) de las cinco series obtenidas. Las series restantes se congelaron (-18ºC) para uso futuro. 3.3.2 Inmunohistoquímica para la detección de oxitocina Para la inmunohistoquímica simple (OT) usamos el método indirecto del complejo avidina-biotina-peroxidasa (ABC). Para ello, preincubamos en 1% peróxido de hidrógeno (H2O2, solución de bloqueo, anticuerpo primario (1:25000, rabbit anti-oxytocin IgG, Millipore Cat#AB911), anticuerpo secundario (1:200, goat anti-rabbit IgG, Vector Labs, BA-1000) y ABC. Finalmente, las preparaciones fueron reveladas con diaminobenzidina, montadas y cubiertas para hacerlas permanentes. 3.3.3 Análisis de la co-localización de OT+AVP Para el marcaje simultáneo de oxitocina y vasopresina combinamos la immnuofluorescencia de ambos péptidos en 2 series de hembras lactantes y no lactantes (6 por grupo). Brevemente, incubamos las series en borohidruro sódico -para reducir la autofluorescencia-, incubamos en solución de bloqueo, la mezcla de anticuerpos primarios (rabbit anti-vasopressin IgG, 1:2500; Millipore, AB1565; mouse anti-oxytocin, monoclonal IgG 1:200; Dr. Harold Gainer, NIH, PS38), y de anticuerpos secundarios marcados con fluoróforos diferentes (Alexa Fluor 488-conjugado Goat anti-rabbit IgG, 1:250; Jackson ImmunoResearch, 111-545-003; Rhodamine Red X-conjugado goat anti-mouse IgG, 1:250; Invitrogen R6393). Los cortes se lavaron cuidadosamente entre pasos. Para revelar la citoarquitectura en las secciones, contrateñimos con DAPI. Finalmente, montamos los cortes en portaobjetos gelatinizados y cubrimos con medio de montaje para fluorescencia. Analizamos las preparaciones con un microscopio confocal Olympus FV1000 invertido, escaneando secuencialmente los canales para identificar el DAPI, Alexa Fluor 488 (AVP) y Rodamina (OT). Las longitudes de onda de excitación fueron 405 nm para DAPI, 488 nm para Alexa Fluor 488 y 559 nm para Rodamina Red-X. Las longitudes de onda de emisión fueron 461, 520 y 591 respectivamente. Las secciones del plano Z se tomaron separadas entre 1.5 y 4 micras, a x100, x200 y x600 aumentos, en las regiones de interés. Guardamos las imágenes en formato TIF y OIF. Procesamos los stacks (pilas de imágenes) obtenidos con ImageJ para el recuento de las células en cada una de las secciones ópticas, en cada uno de los canales, para identificar las células marcadas con sólo-OT, sólo-AVP y con ambos nonapéptidos (Figura 15A, B y C).   4. DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS 4.1 LA EXPOSICIÓN A CRÍAS PROMUEVE EL CUIDADO MATERNAL EN HEMBRAS VÍRGENES DE RATÓN Hemos caracterizado y validado dos protocolos de sensibilización maternal en hembras vírgenes de ratón de la cepa CD1. Para ello, hemos adaptado el protocolo clásico en el cuál hembras vírgenes de ratón fueron expuestas 2h diarias a crías. Además, hemos diseñado un procedimiento más natural, en el que hembras vírgenes, llamadas comadres, compartían el cuidado de las crías con las lactantes desde el momento del parto. Este contacto continuo con las crías, induce una expresión rápida y completa del comportamiento maternal dirigido a las crías desde el día postparto 2. Ambos protocolos de sensibilización maternal indujeron con éxito, aunque a diferentes ritmos, comportamientos dirigidos a las crías. Así las comadres se comportaban de modo indistinguible a las madres en la mayoría de los aspectos desde el primer día de test (PPD2), mientras que las hembras sensibilizadas por el procedimiento tradicional necesitaron al menos dos sesiones de sensibilización antes de alcanzar niveles de comportamiento maternal similar al de las restantes hembras. Éstos resultados son consistentes con los obtenidos en otras cepas de ratón (Stolzenberg y Rissman, 2011). Por otro lado, estos autores demostraron que mientras las hembras inexpertas necesitan solo dos días de exposición a crías para recoger las crías en su propia caja, este periodo no es suficiente para responder a las crías en un ambiente nuevo, como un laberinto en T. Por esta razón, la elección del ambiente del test es tan crucial para observar las respuestas maternales a crías en hembras nulíparas de ratón. Las comadres expuestas a crías desde el momento del parto, fueron tan rápidas como las madres en el test de recogida de las crías (Figura 17). Sin embargo, las hembras sensibilizadas fueron más lentas que las madres durante tanto durante el primer día de test – en el que aún no habían tenido contacto con crías previamente- y el segundo. A lo largo de los tests, las hembras sensibilizadas adquieren experiencia con las crías y aprenden a recogerlas antes. Así, durante el tercer día de test, tras dos sesiones de 2h de exposición diaria, las hembras sensibilizadas consiguen ser tan rápidas como las madres en recoger a las crías. Por otra parte, las hembras sensibilizadas sobreexpresaron el acicalamiento/limpieza de las crías (Figura 19). Nuestra interpretación es que los altos niveles de este comportamiento se deberían al efecto novedad de las crías para las hembras sensibilizadas (Rinaldi et al., 2010). De este modo, las madres y comadres estarían reconociendo a sus propias crías, y tras reagruparlas en el nido, expresarían un menor nivel de comportamiento de acicalamiento/limpieza. Esta hipótesis concuerda con los resultados obtenidos por Stolzenberg y Rissman (2011), que observaron que las hembras expertas fueron más rápidas en recoger las crías pero presentaban una menor tasa del comportamiento de lamida/acicalamiento (ver también Alsina-Llanes et al., (2015)). Estos resultados contrastan con el número de veces que las hembras se acurrucan sobre las crías, puesto que las comadres sorprendentemente lo realizan con mayor frecuencia que las lactantes (Figura 18). Interpretamos esta observación como que, en las condiciones de test en el que no hay amenazas visibles, las lactantes, tras poner a salvo a la crías en el nido, podrían estar más dispuestas a dejar el nido y explorar los cambios en los alrededores. De hecho, de acuerdo con nuestra hipótesis, Bridges, (2015) propone que los niveles de ansiedad en las lactantes disminuye y ello les lleva a incrementar la actividad exploratoria. Por el contrario, las comadres, estarían más ansiosas por tratarse de la primera vez que están a solas con las crías, sin la presencia de la madre, por lo que estarían más motivadas para reagrupar las crías y permanecer en el nido con ellas. 4.2 LA SENSIBILIZACIÓN MATERNAL NO INDUCE AGRESIÓN MATERNAL En nuestros experimentos, ni el contacto constante con las crías ni una exposición de 2h diarias a las mismas fueron capaces de promover agresión maternal en hembras vírgenes de ratón, a pesar de que éstas expresaban comportamiento maternal dirigido a las crías con niveles similares a los de las madres. La falta de agresión de las hembras sensibilizadas en el Experimento 3.1.4 podría atribuirse a la falta de un nido para defender. Pero el hecho de que cuando se dejó el nido a las comadres éstas no expresaran agresión, parece demostrar que, un periodo de contacto íntimo con crías (5 días) per se no es capaz de provocar agresión maternal en hembras vírgenes (Figura 21), tal y como se ha visto en ratas (Erskine et al., 1980b). Así, a diferencia del comportamiento maternal, la agresión maternal parece ser que requiere cambios fisiológicos asociados a la maternidad. Además, la agresión maternal solo se da cerca del nido, puesto que las hembras lactantes no atacan a un macho adulto desconocido si se encuentran en un ambiente diferente al de la propia caja de la hembra (Figura 25; Experimento 3.2.7). Así, todas las hembras lactantes de la presente tesis expresaron agresión maternal cuando el encuentro sucedía en sus propias cajas. Sin embargo, en una caja neutra sólo 1/10 hembras lactantes atacaron al macho intruso (Tabla 5), pese a que esta agresión duró menos de 1 segundo por lo que podríamos concluir que en general, la agresión maternal sucede específicamente dentro del territorio de la madre. Este hecho demuestra que la agresión maternal es un comportamiento territorial, como la agresión entre machos (Miczek y O’Donnell, 1978; Miczek et al., 2001). 4.3 DE LA ATRACCIÓN A LA AGRESIÓN: LA LACTANCIA CAMBIA EL VALOR EMOCIONAL DE LAS FEROMONAS Los resultados del estudio 2 nos llevan a dos conclusiones principales. Primero, sólo las hembras lactantes atacaron a los intrusos y más importante aún, las comadres y las hembras vírgenes inexpertas no mostraron respuesta agresiva frente a machos intactos (0.76±0.36s, 0.26±0.14 s tiempo de ataque; comadres y vírgenes inexpertas, respectivamente; Figura 22). Este hecho sugiere que sólo las hembras lactantes responden de modo agresivo ante machos conespecíficos cuando son introducidos en la caja de las hembras. Además de atacar con mayor fiereza, las hembras lactantes fueron mucho más rápidas en iniciar el ataque que las no lactantes (ver Resultados). Sin embargo, cuando las hembras lactantes se enfrentan a machos castrados, no se diferenciaron de las no lactantes en términos de tiempo total de ataque y latencia al primer ataque. Estos resultados indican que las señales químicas de masculinidad, cuya producción es testosterona-dependiente, generan la agresión de las hembras lactantes (agresión maternal), como sucede en la agresión entre machos (Kaur et al., 2014; Stowers et al., 2002). Por lo tanto, la agresión maternal observada parece ser inducida de forma por feromonas sexuales masculinas. Otra de las implicaciones de nuestro trabajo es haber demostrado que la darcina es una señal química promotora de la agresión maternal en hembras lactantes. De hecho, cuando aplicamos r-darcina sobre los machos castrados, ésta induce en hembras lactantes los mismos niveles de agresión maternal y con la misma latencia que la orina de macho intacto (ver Figura 24). Cabe destacar que la inducción de agresión maternal por parte de r-darcina ocurre en ausencia de odorantes de macho (la r-darcina sólo podría unirse a olores de macho castrado). En otras palabras, las hembras lactantes podrían reconocer la misma señal masculina tanto en orina como en r-darcina. Por esta razón, la darcina contenida en ambas soluciones –orina y tampón salino- es la promotora de agresión maternal. Así pues, si la misma molécula –darcina- induce diferentes respuestas comportamentales en vírgenes –atracción- y en lactantes -agresión-, el cambio en la respuesta hacia los machos alrededor del parto no debe implicar modificaciones en el órgano vomeronasal –como por ejemplo cambio en el patrón de expresión de receptores- sino que las hormonas circulantes durante la preñez deben cambiar el valor emocional de este estímulo, regulando así la respuesta a darcina. Nuestra hipótesis es que deben darse cambios a nivel del circuito socio-sexual del cerebro. Por ello, empezamos a explorar posibles cambios a nivel de las células nonapeptidérgicas, en dos núcleos relacionados con el comportamiento maternal. Debido a que los nonapéptidos OT y AVP están implicados tanto en el comportamiento social como en el procesamiento de las señales químicas, estos nonapéptidos podrían ser los candidatos modulados por los factores que actúan durante la preñez y el periodo cercano al parto. 4.4 EN RATONES CD1 LA PRODUCCIÓN DE DARCINA ES TESTOSTERONA DEPENDIENTE La electroforesis para la separación de la orina de los machos –castrados en intactos- y de hembras, reveló dos bandas presentes en todas las muestras, junto con una banda que excepcionalmente se observaba en la orina de machos (Figura 23). Esta banda corresponde a una proteína urinaria cuya producción es dependiente de testosterona y fue previamente descrita como darcina por Roberts et al., (2010). Darcina es una MUP de 18893Da de peso, con una movilidad inusual ya que aparece como una banda equivalente a 16kDa. Nuestra electroforesis reveló la presencia de esta MUP en ratones machos de la cepa CD-1, pero no en los machos castrados. 4.5 EL NÚMERO DE CÉLULAS NONAPEPTIDÉRGICAS NO ESTÁ AFECTADO DURANTE LA MATERNIDAD NI SENSIBILIZACIÓN POR CRÍAS Tras la caracterización del cuidado de las crías y agresión maternal en hembras de ratón CD-1, investigamos las posibles adaptaciones en el cerebro maternal que pudiesen explicar el aumento de la motivación por los estímulos de las crías y la defensa del nido. Nuestra hipótesis es que modificaciones de los sistemas nonapeptidérgicos del cerebro de las hembras lactantes podrían explicar los cambios comportamentales asociados a la maternidad, entre otros la agresión maternal. Para explorar esta idea cuantificamos el número de células que expresaban OT, AVP o ambos nonapéptidos en el AC/ADP y Pa, dos núcleos que parecen estar implicados en el comportamiento maternal. Nuestros resultados tanto con técnicas de inmunoperoxidasa como inmunofluorescencia coincidieron en no revelar diferencias en el número de células OTérgicas y AVPérgicas – inmunofluorescencia sólo- entre hembras lactantes y no lactantes, ni en el Pa ni en el grupo del AC/ADP (Figura 28). Así, el número de células nonapeptidérgicas fue idéntico en madres y comadres, y el número de células inmunoreactivas para OT no difirió entre madres, comadres y hembras vírgenes sin experiencia con crías. Pese a que no encontramos diferencias en las células OT positivas en el AC/ADP entre ambos grupos, otros estudios sugieren que sí hay modificaciones funcionales de estas células en lactantes (Tsuneoka et al., 2013). Estos autores demostraron que células OT positivas en el AC/ADP no fueron activadas por los estímulos de las crías en hembras vírgenes, pero mostraron un incremento muy significativo de actividad c-fos en hembras lactantes cuando fueron expuestas a crías ajenas 7 días tras el parto. Dado que nuestros resultados indican que no hay un incremento en células OTérgicas en esta región el cerebro de las madres, todo sugiere que las células OTérgicas del AC/ADP son insensibles a estímulos de las crías en hembras vírgenes pero se vuelven sensibles a estos estímulos tras el parto. A la luz de resultados previos que sugerían un aumento de la co-expresión entre los niveles de ARN mensajero de OT y AVP en el núcleo supraóptico en ratas (Mezey y Kiss, 1991), partimos de la hipótesis de que, aunque el número total de células nonapeptidérgicas no cambiaban durante la lactancia, el sustrato hormonal de las madres podría afectar al porcentaje de la co-localización de OT y AVP en el AC/ADP y el Pa. Sin embargo, no observamos diferencias en este porcentaje entre madres y comadres, tanto en el AC/ADP (Figura 30) como el Pa, que contiene mayormente neuronas neurosecretoras (Figura 31). Por lo tanto, nuestros resultados podrían contradecir los obtenidos por Mezey y Kiss (1991). Sin embargo, este estudio no aportó ningún análisis estadístico de los datos y utilizaron un tamaño muestral pequeño (n=2 por grupo). De hecho, sólo aportaron un mero recuento e incremento de porcentajes de co-localización. Nuestros resultados en hembras lactantes de día PPD5, muestran un aparente incremento de dos veces más en el porcentaje de células doblemente marcadas en las dos regiones más rostrales del Pa (Tabla 6), pero estos datos no superan un test estadístico, probablemente debido a la alta variabilidad en la muestra. Otra posibilidad interesante es que la población celular que co-expresa AVP y OT en el AC/ADP sea sexualmente dimórfica. Otero-García et al., (2015) publicaron la descripción detallada de la co-expresión de ambos nonapéptidos en machos (ver Tabla 7). En comparación con nuestros resultados, los machos no parecen diferir en la proporción de células nonapeptidérgicas que sólo expresan AVP en el AC/ADP (1.6% en machos vs. 0.92% en comadres) o en la proporción de células que co-expresan ambos nonapéptidos (40.3% en machos vs. 54.34% en hembras). Por otro lado, en el Pa, el porcentaje de los somas nonapeptidérgicos que expresan sólo AVP pueden ser sexualmente dimórfico en favor de las hembras, mientras que la co-localización de AVP y OT parece ser más frecuente en el Pa de machos, por mostrar entre 2 y 4 veces más de células doblemente marcadas Comadres % Células Nonapeptidérgicas expresando solo OT % Células Nonapeptidérgicas expresando solo AVP % Células Nonapeptidérgicas expresando AVP+OT AC/ADP 44.74 0.92 54.34 Pa (-0.70mm) 52.92 41.82 5.26 Pa (-0.94mm) 39.73 52.43 7.83 Machos* % Células Nonapeptidérgicas expresando solo OT % Células Nonapeptidérgicas expresando solo AVP % Células Nonapeptidérgicas expresando AVP+OT AC/ADP 58.1 1.6 40.3 Pa (-0.70mm) 59.2 16.5 24.3 Pa (-0.94mm) 51 28.6 20.4 Table 7.Comparison of the distribution of nonapeptidergic cell bodies immunoreactive for OT, AVP or both in the AC/ADP and Pa in virgin males and females (godmothers). *Los datos de machos han sido tomados con el permiso de Otero-García et al., 2015 4.6 EL NÚMERO DE CÉLULAS OXITOCINÉRGICAS EN AC/ADP CORELACIONA CON LA AGRESIÓN MATERNAL Nuestros resultados sugieren que los somas OT positivos en el AC/ADP podría jugar un papel importante en la agresión. Hemos observado que el número de células OTérgicas en el AC/ADP, con la técnica de inmunoperoxidasa, correlaciona positivamente con altas tasas de agresión maternal exclusivamente en hembras lactantes (Figura 29). En nuestro material de inmunofluorescencia, el análisis de regresión lineal reveló la misma tendencia, que no llegaba a ser estadísticamente significativa (Figura 33). Cabe indicar que para el material de inmunofluorescencia teníamos un menor número de animales (n=6 por grupo) que en el de DAB (n=9 por grupo), por lo que es probable que los resultado obtenidos en la inmunodetección con peroxidasa pueda replicarse incrementando el tamaño muestral. Por el contrario, no encontramos ninguna correlación o tendencia en la expresión de OT en el Pa y comportamiento agresivo, o entre el número de somas AVPérgicos y la agresión. Además, no encontramos correlación en las hembras no lactantes, que no mostraron apenas ataques hacia los machos intrusos. Por lo tanto, nuestros datos sugieren que las células OTérgicas del AC/ADP, pero no las AVPérgicas, podrían estar implicadas en el control de la agresión maternal   5. CONCLUSIONES 1. Las hembras vírgenes de ratón de la cepa CD-1 expresan cuidados maternales de un modo casi espontáneo. 2. Las hembras vírgenes que fueron expuestas a las crías de modo continuado (comadres) mostraron una velocidad de recogida de las crías en el test similar al de las madres desde la primera sesión de test (el día postparto 2). 3. Las hembras que fueron expuestas a crías durante dos horas diarias (hembras sensibilizadas) necesitaron al menos dos días de sensibilización para expresar niveles de comportamiento maternal similares a los de las hembras lactantes. 4. Las hembras sensibilizadas a crías sobreexpresaron el comportamiento de limpieza/acicalamiento en comparación con las hembras lactantes y las comadres. Nuestra hipótesis es que estos niveles de limpieza se podrían deber a un incremento en el comportamiento de investigación debido a un efecto novedad de las crías. 5. Las comadres cubrieron a las crías con su cuerpo con mayor frecuencia que las lactantes. Especulamos que bajo las condiciones experimentales, las comadres podrían estar más ansiosas que las hembras lactantes, las cuales pueden estar más dispuestas a dejar el nido y explorar los alrededores. 6. La sensibilización maternal de hembras vírgenes por cualquiera de los dos procedimientos empleados, induce la expresión completa del repertorio de comportamientos dirigidos a las crías, pero no es suficiente para promover agresión maternal. Esto sugiere que los agentes endocrinos que actúan sobre el cerebro de las hembras durante la gestación parto deben ser clave para la inducción de la agresión maternal. 7. La agresión maternal es un comportamiento territorial, dado que sólo ocurre cerca del nido y las madres no atacan a machos adultos desconocidos si el encuentro ocurre en un ambiente diferente al de la propia caja de la hembra lactante. 8. Las hembras lactantes de ratón expresan altos niveles de agresión maternal hacia los machos intactos, y bajos frente a intrusos castrados. Por lo tanto, como ocurre con la agresión entre machos, la agresión maternal es promovida por señales químicas dependientes de testosterona secretadas por los machos. 9. Las madres atacan a machos castrados a los que se roció con orina de machos intactos o con la feromona masculina darcina sola. Así pues, la feromona sexual masculina darcina es un estímulo clave que desencadena la agresión maternal. 10. Dado que la misma feromona masculina, darcina, desencadena atracción en hembras no lactantes y agresión maternal en lactantes, los cambios en la respuesta de las hembras hacia los machos durante la maternidad se deben a alteraciones reversibles del cerebro de las hembras, más que del órgano sensorial. 11. El número de células immunoreactivas para oxitocina en el AC/ADP y en el Pa no se ve afectado por la sensibilización maternal ni por la lactancia. 12. La oxitocina podría estar modulando la agresión maternal en hembras de ratón, ya que el número de células inmunoreactivas para la oxitocina en el AC/ADP correlaciona positivamente con los parámetros de agresión, exclusivamente en madres. 13. El número de células immunopositivas para AVP o para AVP+OT en el Pa y AC/ADP no difirió entre hembras lactantes y comadres. Por lo tanto, la lactancia no afecta ni al número de células nonapeptidérgicas ni a la proporción de co-localización de ambos neuropéptidos en estos núcleos del cerebro maternal.