NAGIOS: RODERIC FUNCIONANDO

Optimización de las técnicas de criopreservación de tejido adiposo.

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Optimización de las técnicas de criopreservación de tejido adiposo.

dc.contributor.advisor	Novella Maestre, Edurne
dc.contributor.advisor	Carda Batalla, María del Carmen
dc.contributor.author	Villaverde Doménech, María Eloísa
dc.contributor.other	Departament de Patologia	es_ES
dc.date.accessioned	2017-05-02T09:39:26Z
dc.date.available	2017-05-03T04:45:05Z
dc.date.issued	2017	es_ES
dc.date.submitted	26-04-2017	es_ES
dc.identifier.uri	http://hdl.handle.net/10550/58336
dc.description.abstract	Objetivos Uno de los progresos más notables en cirugía plástica en los últimos años ha sido la utilización y perfeccionamiento de las técnicas para el manejo del tejido adiposo (TA). Uno de los principales problemas de los injertos de TA es la tasa de reabsorción, que implica procedimientos repetidos de lipoaspiración y lipoinyección, aumentando los costes y complicaciones quirúrgicas, así como el dolor y disconfort para el paciente. Esta es la razón por la que la criopreservación de TA sería extremadamente útil. El objetivo de este estudio es desarrollar un protocolo de criopreservación de TA que simplifique de manera significativa los protocolos desarrollados hasta el momento, sin disminuir la funcionalidad y la viabilidad del TA después de la descongelación y el trasplante. Material y Métodos Se compararon dos temperaturas (Tª) de congelación (-20º y -80º) y dos agentes crioprotectores (ACPs): trehalosa e hidroxietilstrach (HES), mediante un protocolo de congelación lenta. Para ello, el TA de 4 pacientes fue extraído y procesado mediante la técnica de Coleman. A continuación el TA fue dividido en 5 grupos experimentales y procesado de la siguiente forma: • Grupo Control: TA fresco. • Grupo 1: Tª -20ºC (medio Dulbecco’s Modified Eagel Medium (DMEM)/F2, 10%HES). • Grupo 2: Tª -80ºC (medio DMEM/F2, 10%HES). • Grupo 3: Tª -20ºC (medio DMEM/F2, 0.35M trehalosa). • Grupo 4: Tª -80ºC (medio DMEM/F2, 0.35M trehalosa). Tras 1 semana las muestras fueron descongeladas mediante inmersión en baño a 40ºC y procesadas para evaluar la morfología (estudios histológicos) y viabilidad tisular (estudios moleculares: la expresión génica de Gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH)). A partir de los resultados obtenidos se procedió a la realización del estudio “in vivo” eligiendo como Tª de criopreservación -20ºC. Injertos de TA procedente de 6 pacientes y extraídos siguiendo el mismo procedimiento que en el estudio previo fueron trasplantados en ratones inmunodeficientes (n=15). Las muestras de cada paciente fueron divididas en 5 grupos experimentales y a continuación pesadas y procesadas de la siguiente forma: • Grupo Control: TA fresco. • Grupo A: Tª -20ºC (medio DMEM/F2, 10% de HES), TA criopreservado 1 mes. • Grupo B: Tª -20ºC (medio DMEM/F2, 10% de HES), TA criopreservado 2 meses. • Grupo C: Tª -20ºC (medio DMEM/F2, 0.35 trehalosa), TA criopreservado 1 mes. • Grupo D: Tª -20ºC (medio DMEM/F2, 0.35 trehalosa), TA criopreservado 2 meses. Tras 1 mes post-inoculación los animales fueron sacrificados procediéndose a la recuperación de las muestras las cuales fueron pesadas y procesadas para su estudio histológico, estudio de viabilidad (expresión de GAPDH) y estudio de vascularización (expresión génica de Factor de Crecimiento del Endotelio Vascular o VEGF). Resultados El estudio histológico inicial, demostró que las muestras de TA de los grupos criopreservados (Grupos 1-4) mostraban unas características histológicas normales y similares a las del grupo control (fresco). Se observó expresión de GAPDH en todos los grupos experimentales (Control: 4,72±0,13; Grupo1: 7,02±2,33; Grupo 2: 9,02±2,70; Grupo 3: 4,64±0,91; Grupo 4:6,31±-0,65). No se observaron diferencias estadísticamente significativas (p>0,05) cuando se compararon los grupos criopreservados entre ellos o con el grupo control. En cuanto a los estudios “in vivo”, los grupos criopreservados (A-D) presentaron un buen prendimiento y conservación de la arquitectura típica del TA en comparación con el grupo control (fresco), así como una evidente red vascular indicativa de un proceso de neovascularización. No se encontraron diferencias estadísticamente significativas (p>0,05) en cuanto a la tasa de prendimiento (%) (Grupo Control 33,77±9,63; A: 18,88±5,41; B: 32,17±14,19; C: 22,10±9,83; D: 26,09±15,40) expresión génica de GAPDH (Grupo Control: 6,81±0,63; A: 6,74±0,43; B:6,54±0,84; C:6,17±0,17; D:7,26±0,62) o expresión génica de VEGF (Grupo Control: 16,17±1,72; A: 14,93±1,94; B: 14,27±2,52; C: 15,49±1,61; D: 16,61±1,63) cuando se compararon los grupos criopreservados entre ellos o con el grupo control. Conclusiones La congelación lenta de TA a -20ºC con trehalosa o con HES supone un procedimiento de criopreservación de TA sencillo y simple con resultados similares al TA fresco en términos de viabilidad tisular y características morfo-histológicas. La utilización de estos dos ACPs de baja toxicidad constituyen un protocolo sencillo aplicable a la práctica clínica habitual. El tiempo de criopreservación de las muestras no influye en la adecuada conservación del TA.	es_ES
dc.description.abstract	Objectives One of the most outstanding improvements in plastic and reconstructive surgery over the last years has been the utilization of adipose tissue (AT) in reconstructive surgery, and the improvement of processing techniques. One of the main problems of AT grafts is the fat absorption rate that implies repeated procedures including both lipoaspiration and lipoinjection to achieve the desired result. The mentioned procedures increase the cost and surgical risks, as well as exposing the patient to pain and discomfort. This is the reason why cryopreservation of AT would be an interesting tool in this field. The aim of this study is to develop an AT cryopreservation protocol that simplifies the developed protocols up to this time, without decreasing the functionality and viability of AT after thawing and transplantation. Methods Two cryopreservation temperatures (Tº): -20ºC and -80ºC, and two cryoprotector agents (ACPs): trehalose and hydroxietilstarch (HES), by a slow-freezing protocol, were compared. For this purpose, AT from 4 patients was harvested and processed following the technique described by Coleman. Next, AT was divided in 5 experimental groups and processed as it follows: • Control group: fresh AT. • Group 1: Tº -20ºC (DMEM/F2 medium, 10%HES). • Group 2: Tº -80ºC (DMEM/F2 medium, 10%HES). • Group 3: Tº -20ºC (DMEM/F2 medium, 0.35M trehalose). • Group 4: Tº -80ºC (DMEM/F2 medium, 0.35M trehalose). Samples where thawed after 1 week, by their immersion in 40ºC baths, and were processed to evaluate the morphology (histological studies) and tisular viability (molecular studies: Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) genic expression). Based on the obtained results, an “in vivo” study was performed, choosing as cryopreservation Tº -20ºC. AT grafts from 6 patients were harvested following the same procedure as in the previous study were transplanted into imnunodeficient mice (n=15). Samples of each patient were divided in 5 experimental groups and next they were weighted and processed as it follows: • Control group: fresh AT. • Group A: Tº -20ºC (DMEM/F2 medium, 10% HES), 1-month cryopreserved AT. • Group B: Tº -20ºC (DMEM/F2 medium, 10% HES), 2-month cryopreserved AT. • Group C: Tº -20ºC (DMEM/F2 medium, 0.35 trehalose), 1-month cryopreserved AT. • Group D: Tº -20ºC (DMEM/F2 medium, 0.35 trehalose), 2-month cryopreserved AT. After 1 month of inoculation, animals were slaughtered and samples were recovered, samples that were weighted and processed for histological study, viability study (GAPDH genic expression) and vascularization study (Vascular Endothelial Growth Factor or VEGF genic expression). Results The initial histologic study, demonstrated that all AT cryopreserved groups samples (Groups 1 to 4) showed typical histologic features of AT and they were similar to control group (fresh). GAPDH expression was observed in all experimental groups (Control: 4.72±0.13; Group 1: 7.02±2.33; Group 2: 9.02±2.70; Group 3: 4.64±0.91; Group 4:6.31±-0.65). Statistically significant differences were not observed (>0.05) when cryopreserved groups were compared with themselves and with the control group. Related to the “in vivo” studies, cryopreserved groups (A-D) showed good take of the graft and normal AT architectural preservation, compared to control group (fresh tissue), as well as a clear vascular network, indicative of the neovascularisation process. Statistically significant differences were not found (p>0.05) with regard to graft take (%) (Control Group 33.77±9.63; A: 18.88±5.41; B: 32.17±14.19; C: 22.10±9.83; D: 26.09±15.40), GAPDH genic expression (Control Group: 6.81±0.63; A: 6.74±0.43; B: 6.54±0.84; C: 6.17±0.17; D: 7.26±0.62) or VEGF genic expression (Control Group: 16.17±1.72; A: 14.93±1.94; B: 14.27±2.52; C: 15.49±1.61; D: 16.61±1.63) when cryopreserved groups are compared with themselves or with the control group. Conclusions Slow freezing at -20ºC using trehalose or HES as ACPs is a straightforward and easy AT cryopreservation procedure with similar results to fresh AT in terms of tisular viability and morpho-histological characteristics. The utilization of these two low toxicity ACPs constitute a simple procedure that is feasible in common clinical practice. Cryopreservation time does not affect the proper AT maintenance.	en_US
dc.format.extent	204 p.	es_ES
dc.language.iso	es	es_ES
dc.subject	Cirugía plástica	es_ES
dc.subject	Cirugía reconstructiva	es_ES
dc.subject	Tejido adiposo	es_ES
dc.subject	Lipoinjertos	es_ES
dc.subject	Criopreservación del tejido adiposo	es_ES
dc.subject	HES	es_ES
dc.subject	Trehalosa	es_ES
dc.subject	Criopreservación del tejido adiposo	es_ES
dc.title	Optimización de las técnicas de criopreservación de tejido adiposo.	es_ES
dc.type	doctoral thesis	es_ES
dc.subject.unesco	UNESCO::CIENCIAS MÉDICAS ::Patología::Histopatología	es_ES
dc.embargo.terms	0 days	es_ES