Human mesenchymal stem cells (MSCs) have a therapeutic potential in tissue engineering and regenerative medicine. Human dental pulp stem cells (hDPSCs) have proven to be a good source for cell therapy as pulp tissue is easily available from teeth after extraction without ethical issues. Cell therapy requires a large number of cells, thus, an in vitro expansion step is required before implantation. Long-term in vitro culture entails the inconvenience of senescence following a certain number of passages, thereby losing hDPSCs stemness properties and regenerative potential. Currently, the in vitro culture of MSCs is carried out under ambient oxygen tension (21% pO2). However, the local oxygen tension varies between 3-6% pO2 within the organism depending on the vascularization of the tissue and its metabolic activity. Mimicking physiological conditions in cell culture experiments is a useful tool to gain knowledge. Thus, the aim of this study was to compare long-term in vitro culture of hDPSCs under ambient (21% pO2) and physiological (3% pO2) oxygen partial pressure, and to determine whether hyperoxia can alter the physiology and affect the senescence of normal adult stem cells. First, we investigated if ambient oxygen tension could induce oxidative stress in hDPSCs during long-term culture. Oxidative stress reflects an imbalance between the systemic manifestation of reactive oxygen species (ROS) and the biological ability of a system to readily detoxify the intermediates and to repair the resulting damage. Oxidative stress is known to produce damage to biomolecules such as DNA, carbohydrates, lipids and proteins. Therefore, we assessed ROS levels, mitochondrial membrane potential, protein and lipid oxidation, as well as antioxidant gene expression during long-term hDPSCs in vitro culture. Our data revealed increased ROS levels, protein carbonylation and lipid oxidation, and a disruption of the mitochondrial membrane potential in the cells that were cultured under ambient oxygen tension. Furthermore, these cells showed an upregulation of the expression of manganese superoxide dismutase, catalase and glutathione peroxidase genes, suggesting an increased antioxidant defence to withstand increasing ROS production. Thus, ambient oxygen tension induces oxidative stress in hDPSCs in vitro culture. Senescence was described as an irreversible state of cell cycle arrest, which is accompanied by morphological alterations, reduced proliferation rate, apoptosis resistance and increased expression of senescence-associated β-galactosidase activity and p16INK4a. The CDKN2A gene, also known as the INK/ARF locus, encodes both p16INK4a and p14ARF, which are cell cycle regulators. The p16INK4a protein inhibits cyclin D-dependent CDK4 and CDK6 to prevent phosphorylation of the retinoblastoma protein (pRb). The hypophosphorylated form of pRb sequesters E2F transcription factors, preventing them from coordinately activating a suite of genes required for DNA replication. The p14ARF protein binds to the MDM2 E3 ubiquitin ligase to prevent p53 polyubiquitylation and to facilitate p53 activation. In turn, the p53 transcription factor regulates an extensive group of genes that are commonly induced by cellular stress leading to apoptosis. We then determined some senescence characteristics in hDPSCs cultured under both oxygen tension conditions. Cells that were cultured under ambient oxygen tension rapidly began to show enlarged and flattened phenotypes and decreased their regenerative potential as they only reached 15 passages, while those cells that were cultured under physiological oxygen tension reached 25 passages and preserved a “younger” phenotype. Accordingly, 21% pO2 was accompanied by increased β- galactosidase activity, increased expression of p16INK4a and reduced expression of p14ARF. Taken together, our results suggest that oxidative stress induces a premature senescence of hDPSCs cultured under ambient oxygen tension. Another characteristic that is not included in the definition of stem cell senescence, but should be taken into consideration, is the loss of stemness properties. hDPSCs are adult stem cells that express pluripotency-related genes. Those genes are the four transcription factors: OCT4, SOX2, KLF4 and c-MYC, abbreviated to, “OSKM”, and they are involved in the induction and maintenance of pluripotency. hDPSCs cultured at 3% pO2 showed high levels of OCT4 and SOX2 at early stages, but their expression was downregulated as passages accumulated. However, at advanced passages, these cells upregulated the KLF4 and c-MYC expression. On the other hand, hDPSCs cultured at 21% pO2 showed a downregulation of all four OSKM factors along passages. Taken together, our data suggest that ambient oxygen tension entails a loss of the stemness properties in long-term in vitro culture. Finally, we aimed to investigate a possible relation between p16INK4a and OSKM expression in hDPSCs. A well described upstream regulator of the INK/ARF locus is BMI-1. Through repression of target gene expression, the BMI-1 protein regulates a myriad of cellular processes critical for cell growth, cell fate decision, development, senescence, apoptosis, and self-renewal of stem cells. Thus, we tested whether BMI-1 regulates hDPSCs fate while modulating p16INK4a and OSKM gene expression. To this end, we first analysed BMI-1 protein expression in hDPSCs in long-term culture under either oxygen pressure percentage. Our results show that hDPSCs cultured at 3% pO2 retained constant levels of BMI-1 along passages. However, hDPSCs cultured at 21% pO2 showed higher BMI-1 protein levels at early stages, which rapidly plummeted as passages accumulated. These data suggest that ambient oxygen tension accelerated BMI-1 protein degradation. We next proceeded to silence BMI-1 gene expression in hDPSCs cultured under ambient oxygen tension by siRNA transfection. Knocked-down hDPSCs exhibited the same amount of BMI-1 protein as hDPSCs cultured under physiological oxygen tension. Interestingly, following transfection, p16INK4a expression was not altered, but OCT4 and SOX2 expression levels were upregulated. Taken together, we can conclude that in vitro culture carried out under ambient oxygen tension causes an oxidative stress-induced premature senescence and a loss of the stemness properties of hDPSCs. Moreover, BMI-1 levels should be kept in a balance that allows normal stem cell proliferation, while preventing stem cell senescence thereby maintaining proper stem cell homeostasis.Las células madre son aquellas células que se dividen asimétricamente para producir una copia de sí mismas y una segunda célula que seguirá su camino hasta convertirse en una célula diferenciada y especializada. Así pues, las células madre que podemos encontrar en el organismo adulto comparten al menos dos características. En primer lugar, se pueden hacer copias idénticas de sí mismas durante largos períodos de tiempo; esta capacidad de proliferar se refiere como auto-renovación a largo plazo. Segundo, pueden dar lugar a tipos celulares maduros que tienen morfologías características y funciones especializadas. Las células madre mesenquimales humanas (CMM) tienen pues un potencial terapéutico en ingeniería de tejidos y en medicina regenerativa. En particular, las células madre de pulpa dental humana (CMPD) han demostrado ser una buena fuente de células para la terapia celular porque el tejido pulpar es fácilmente accesible y carece de problemas éticos. Sin embargo, las terapias celulares requieren de un elevado número de células, para lo cual es necesaria una etapa de expansión celular in vitro previa a la implantación. A su vez, el cultivo in vitro a largo plazo lleva implícito el inconveniente de la senescencia tras un cierto número de pases, momento en el cual las células pierden su capacidad de autoregeneración, característico de las células madre. Por esta razón, el estado de senescencia debe tenerse en cuenta para poder obtener células madre de buena calidad que puedan ser utilizadas en las terapias celulares. Actualmente, el cultivo in vitro de las CMM se lleva a cabo bajo tensión de oxígeno ambiental (21% pO2). Sin embargo, dentro del organismo, la tensión de oxígeno a nivel local oscila entre el 3-6% pO2, dependiendo de la vascularización del tejido y de su actividad metabólica. El cultivo celular debe tratar de imitar lascondiciones fisiológicas del organismo, por lo tanto, el objetivo de este estudio fue el de comparar el cultivo in vitro a largo plazo de las CMPD bajo ambas concentraciones de oxígeno: ambiental (21% pO2) y fisiológica (3% pO2). Así, existen trabajos que muestran que altas concentraciones de oxígeno pueden causar estrés oxidativo a través de la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) que pueden dañar lípidos, proteínas y ADN, cambiando el metabolismo de la célula. En este contexto, es interesante destacar que cultivar las CMM en condiciones de hipoxia, o mejor dicho, de “normoxia” fisiológica, antes del trasplante podría mejorar el potencial regenerador de tejido. Además, la reducción de los niveles de oxígeno se acompaña de una mayor tasa de crecimiento, sugiriendo que el estrés oxidativo es un factor contribuyente en la senescencia celular. La senescencia se describe como un estado irreversible de detención del ciclo celular, que se acompaña de alteraciones morfológicas, una menor tasa de proliferación, resistencia a la apoptosis y un aumento de la expresión de la actividad β-galactosidasa asociada a la senescencia y de p16INK4a. El crecimiento celular está controlado por dos vías principales: una que implica la proteína retinoblastoma (pRb), la cual regula la salida del ciclo celular en la fase G1 y otra que implica la participación de la proteína p53, que induce la detención del crecimiento o apoptosis en respuesta al estrés celular. El gen CDKN2A, también conocido como locus INK/ARF, codifica los genes p16INK4a y p14ARF, que son reguladores del ciclo celular. La proteína p16INK4a inhibe las ciclinas dependientes de quinasa CDK4 y CDK6, para prevenir la fosforilación de la proteína del retinoblastoma (pRb). La forma hipofosforilada de pRb secuestra los factores de transcripción de E2F impidiéndoles activar de forma coordinada una serie de genes que son necesarios para la replicación del ADN. La proteína p14ARF, por su parte, se une a la ubiquitin ligasa MDM2 E3 para facilitar la activación de p53. A su vez, el factor de transcripción p53 regula un grupo extenso de genes que son comúnmente inducidos por el estrés celular que conduce a la apoptosis. Otra característica que no está incluida en la definición de senescencia de las células madre, pero que debería de tomarse en consideración, es la pérdida de la pluripotencia o capacidad de autoregeneración. La pluripotencia va ligada a la expresión de unos factores de transcripción, conocidos como: OCT4, SOX2, KLF4 y c-MYC, y abreviados como "OSKM". Dichos genes están involucrados tanto en la inducción como en el mantenimiento de la pluripotencia en las células madre. Es decir, estos genes son capaces de borrar la huella epigenética de las células somáticas hasta convertirlas en las conocidas células madre pluripotentes inducidas (iPSC), cuyas características se equiparan a las de las células madre embrionarias. Finalmente, se pretendió investigar una posible relación entre la senescencia y la pérdida de pluripotencia de las CMPD, ambas asociadas al cultivo in vitro a largo plazo. Un posible nexo de unión es la proteína BMI-1. Dicha proteína modula la compactación de la cromatina a través de la metilación de las histonas en los nucleosomas; es por tanto un regulador epigenético. Más concretamente, BMI-1 es un represor génico, cuya diana mejor descrita es el locus INK/ARF. También se sabe que BMI-1 juega un papel clave no sólo en la prevención de daños al ADN, sino también en el mantenimiento de la función mitocondrial y la homeostasis redox. Así pues, la proteína BMI-1 regula una amplia gama de procesos celulares críticos para el crecimiento celular, la decisión del destino celular, el desarrollo, la senescencia, la apoptosis y la auto-renovación de las células madre. Por lo tanto, nos propusimos investigar si BMI-1 regula el destino de las CMPD al modular la expresión de los genes p16INK4a y OSKM. Nuestro objetivo principal fue pues el de analizar el papel de p16INK4a y de BMI-1 en la senescencia inducida por el estrés oxidativo en células madre de pulpa dental a largo plazo. En primer lugar, analizamos si la tensión de oxígeno ambiental induce estrés oxidativo en las CMPD durante el cultivo a largo plazo. Para ello se midió la producción de especies reactivas del oxígeno (ROS) y el potencial de membranamitocondrial por citometría de flujo. También se analizaron los niveles de malondialdehído (MDA) como marcador de la peroxidación lipídica por cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) y los niveles de carbonilación proteica por western blot. Además de estos marcadores, también se determinaron los niveles de las enzimas antioxidantes: manganeso superóxido dismutasa (MnSOD), glutatión peroxidasa (GPx) y catalasa (CAT), mediante la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). A continuación, analizamos si la tensión de oxígeno ambiental provoca una senescencia prematura inducida por estrés oxidativo en las CMPD durante el cultivo a largo plazo. Para ello, analizamos la morfología celular por microscopía y determinamos la actividad de la enzima β-galactosidasa por citometría de flujo. Paralelamente, comparamos la expresión de los genes p14ARF y p16INK4a por PCR para determinar la vía de señalización implicada en la senescencia prematura de las CMPD cultivadas al 21% pO2. Seguidamente, analizamos si la tensión de oxígeno ambiental produce una pérdida de pluripotencia en las CMPD durante el cultivo a largo plazo, para lo cual medimos la expresión de los factores OCT4, SOX2, KLF4 y c-MYC por PCR. Por último, comparamos la evolución de la expresión de BMI-1 tanto a nivel génico como proteico, en las CMPD durante el cultivo a largo plazo bajo ambas presiones de oxígeno. Finalmente, mediante la introducción de pequeños ARN de interferencia (siRNA), se silenció la expresión de BMI-1 para ver si tenía algún efecto sobre la expresión de los factores de pluripotencia. Las CMPD normalmente residen a bajas concentraciones de oxígeno. En los mamíferos, incluidos los humanos, en el momento en que el oxígeno llega a los órganos y tejidos, la concentración de oxígeno cae a 2-9%, con una media de 3% en la pulpa dental. A pesar de este hecho, todavía es común cultivar células al 21% pO2. Sin embargo, la función celular normal requiere un entorno estable de oxidación-reducción. El exceso en la tensión de oxígeno se ha descrito como un factor importante que podría desestabilizar la homeostasis redox celular. El estrés oxidativo refleja un desequilibrio entre la producción de especies reactivas del oxígeno (ROS) y la capacidad de detoxificación de los productos intermedios o de reparar el daño resultante. En el presente estudio, mostramos que la reducción del nivel de oxígeno ambiental condujo a una disminución del estrés oxidativo intracelular y del daño a biomoléculas durante el cultivo a largo plazo. Nuestros datos revelaron un aumento de los niveles de ROS, de la carbonilación de proteínas y de la oxidación de lípidos, así como una caída del potencial de membrana mitocondrial de las CMPD que se cultivaron a tensión de oxígeno ambiental. Además, estas células mostraron una sobreexpresión de las enzimas MnSOD, CAT y GPx, lo cual sugiere un aumento de la defensa antioxidante para hacer frente a la creciente producción de ROS. Por lo tanto, nuestros datos sugieren que el cultivo in vitro al 21% pO2 conlleva un estrés oxidativo. En este estudio, demostramos que las CMPD cultivadas a tensión de oxígeno ambiental cambiaron su morfología mostrando formas más aplanadas o alargadas, los cual se acompañó de un incremento de residuos en el medio de cultivo. Además, la tasa de proliferación de las CMPD se redujo significativamente a tensión de oxígeno ambiental, puesto que las células cultivadas al 3% pO2 alcanzaron 25 pases mientras que las cultivadas al 21% pO2 sólo alcanzaron 15 pases en el mismo periodo de tiempo. Estas observaciones se acompañaron de una mayor actividad de la enzima β-galactosidasa asociada a la senescencia a lo largo de los pases, lo que sugiere que estas células estaban entrando en un estado senescente. De hecho, aquí se demuestra que las CMPD se pueden mantener en cultivo durante al menos 25 pases manteniendo un fenotipo “más joven” y conservando la cinética de proliferación cuando éstas se cultivan a presión de oxígeno fisiológica. Es decir, durante el cultivo a largo plazo bajo tensión de oxígeno ambiental, las CMPD pierden gradualmente su potencial proliferativo y muestran signos cada vez mayores de senescencia tales como fenotipos más grandes y niveles incrementados de SA-β-Gal. En conjunto, nuestros resultados sugieren que las CMPD cultivadas a tensión de oxígeno ambiental se someten a una senescencia prematura, que se evidencia por el agrandamiento del fenotipo, la reducción del potencial proliferativo y el aumento de la actividad SA-β-Gal. Este fenómeno parece ser causado por la acumulación de ROS, dando lugar a la senescencia prematura inducida por estrés. De hecho, durante mucho tiempo se ha sabido que una tensión reducida de oxígeno promueve el crecimiento y prolonga la vida replicativa de las células humanas mantenidas en cultivo. Los ROS tienen importantes funciones en la señalización celular, pero su papel en la regulación de la progresión del ciclo celular es poco conocido. Los niveles de ROS aumentan significativamente a medida que las células pasan de la fase G1 a la fase S del ciclo celular y son necesarios para la entrada en fase S. Sin embargo, los puntos de control del ciclo celular también se activan por aumento de ROS, lo que indica que la proliferación celular se basa en mantener los niveles de ROS dentro de un rango funcional. La senescencia es una característica normal de las células, por la cual pierden su capacidad replicativa tras un número finito de divisiones. Las vías inhibitorias del ciclo celular p16INK4a/pRb y p14ARF/p53 representan dos importantes vías que controlan la proliferación, y su inactivación puede extender el número límite de divisiones de células mitóticas en mantenidas cultivo. Dado el papel de p16INK4a en la regulación del ciclo celular y la reciente implicación del estrés oxidativo en la senescencia de las células madre, se investigó un posible vínculo entre la producción de ROS y la expresión de p16INK4a. Nuestros resultados muestran que las CMPD cultivadas a largo plazo al 21% pO2 presentaban signos de senescencia, que se acompañaban de un aumento en los niveles de expresión de p16INK4a y una reducción en los niveles de expresión de p14ARF. De acuerdo con esto, las células humanas generalmente expresan cantidades crecientes de p16INK4a cuando se aproximan a su límite de vida útil in vitro. De hecho, las señales de estrés como los ROS estimulan la activación de la transcripción de p16INK4a y desempeñan funciones importantes en la iniciación, así como el mantenimiento, de la senescencia celular. Por esta razón, añadimos un agente antioxidante para ver si podíamos restablecer los niveles de expresión de p16INK4a. El tratamiento con Trolox 50 μM pudo rescatar los niveles de expresión de p16INK4a en el cultivo a largo plazo de CMPD al 21% pO2. En conjunto, podríamos decir que una baja tensión de oxígeno podría retrasar la senescencia de las CMPD mediante la regulación negativa de la expresión de p16INK4a. Las CMPD cultivadas al 3% pO2 mostraron elevados niveles de expresión de los genes OCT4 y SOX2 en los primeros pases, pero su expresión disminuyó conforme se acumulaban pases, lo cual sugiere que estos dos factores estarían implicados en la inducción de la pluripotencia. Sin embargo, en pases avanzados, estas células mostraron elevados niveles de expresión de los genes KLF4 y c-MYC, sugiriendo el papel de mantenimiento de la pluripotencia de estos dos factores. Por su parte, las CMPD cultivadas al 21% pO2, mostraron menores niveles de expresión de los cuatro factores OSKM a lo largo de los pases. En conjunto, nuestros datos sugieren que la tensión de oxígeno ambiental acelera la pérdida de la pluripotencia durante el cultivo a largo plazo. Este resultado fue consistente con otros hallazgos, lo cual sugiere que un microambiente con bajo contenido de oxígeno proporciona una condición óptima para el mantenimiento de las propiedades de las células madre. Nuestros resultados muestran que las CMPD cultivadas al 3% pO2 conservaban unos niveles constantes de la proteína BMI-1 a lo largo de los pases. Sin embargo, los niveles de BMI-1 en las CMPD cultivadas al 21% pO2 no se mantuvieron constantes, sino que se desplomaron conforme se acumulaban los pases. Se sabe muy poco sobre la regulación post-transcripcional de BMI-1. Recientemente, se ha sugerido que BMI-1 es una proteína de corta duración. Algunos investigadores han publicado que BMI-1 podría ser un sustrato de AKT; la activación de la vía de señalización de AKT coincide con la fosforilación de BMI-1 lo cual le confiere mayor estabilidad. Por el contrario, la vía de señalización de p38 dependiente de estrés oxidativo hace que BMI-1 se degrade y pierda su capacidad modificadora de la cromatina. Además, también se ha sugerido que los niveles de BMI-1 están regulados por degradación proteasomal. Colectivamente, estas observaciones apoyan la noción de que los niveles de BMI-1 están regulados por las vías de señalización dependientes de estrés oxidativo en las células madre. Curiosamente y a pesar de ello, las CMPD de pase 5, cultivadas al 21% pO2 mostraron mayores niveles de BMI-1, tanto a nivel génico como proteico. Así pues, se procedió a silenciar la expresión del gen BMI-1 en dichas células, hasta equiparar los niveles de proteína en las CMPD cultivadas bajo ambas presiones de oxígeno. A continuación, analizamos los efectos de dicho silenciamiento sobre la senescencia y la pluripotencia de las CMPD. Los resultados obtenidos demuestran que los niveles de expresión de p16INK4a no se vieron afectados, sin embargo, los de OCT4 y SOX2 sí. Tras reducir los niveles de BMI-1 en las CMPD jóvenes cultivadas al 21% pO2, los factores OCT4 y SOX2 incrementaron su expresión hasta igualarse a la de las CMPD jóvenes cultivadas al 3% pO2. Es decir, este resultado sugiere, que el silenciamiento parcial de BMI-1 es capaz de rescatar la expresión de OCT4 y SOX2 en las CMPD cultivadas bajo tensión de oxígeno ambiental. En conjunto, podemos concluir que el cultivo in vitro mantenido a tensión de oxígeno ambiental provoca una senescencia prematura inducida por estrés oxidativo y una pérdida de la expresión de los factores de pluripotencia en las CMPD. Además, los niveles de BMI-1 deben mantenerse en un equilibrio que permita la proliferación normal de las células madre, al tiempo que previene la senescencia de las células madre, y por tanto, el mantenimiento de la homeostasis de las células madre.