NTRODUCCIÓN • Epidemiología de la Enfermedad de Alzheimer. El aumento de la esperanza de vida, debido en parte a los avances en este último siglo de la medicina moderna, da como resultado una mayor población de adultos mayores en nuestra sociedad. Junto a este aumento de la esperanza de vida, han aparecido enfermedades asociadas al envejecimiento, de entre las cuales destacan las demencias. Las demencias son las principales causas de dependencia, incapacidad y muerte en los adultos mayores (Reitz 2011, Cornutiu 2015). De hecho, la Enfermedad de Alzheimer (EA) es la sexta causa de muerte en Estados Unidos según la Alzheimer’s Association (2009). El término demencia describe un síndrome clínico adquirido, crónico y progresivo caracterizado por deterioro cognitivo, incapacidad para realizar las actividades de la vida diaria y alteraciones neuropsiquiátricas. La EA es la causa más común de demencia primaria, seguida por la demencia vascular y la demencia por Cuerpos de Lewy (Prince et al., 2013). El coste de cuidar a este elevado número de personas que padecen una demencia se incrementa cada año. De hecho se estima que en el año 2020 habrán 42.3 millones de personas que padecerán una demencia y este número puede aumentar hasta los 81.1 millones de personas en 2040 (Ferri et al., 2005). Según la OMS la mayoría de los países europeos gastan un 1% del PIB en demencias, especialmente en enfermeras internas o en residencias para ancianos (2012 WHO report “Dementia: a health priority”, Batsch y Mittelman 2015). • Anatomía patológica de la EA Así, la EA se caracteriza por dos lesiones anatomo-patológicas cerebrales fundamentales: la deposición de placas amiloideas por un mal procesamiento de Aβ y la formación de ovillos neurofibrilares. Las placas seniles son lesiones del neuropilo de forma esferoidal y de 20-100μm de diámetro, están constituidas por una zona central de amiloide rodeada de neuritas distróficas y de algunas células gliales. Las neuritas distróficas son prolongaciones de distintas neuronas que confluyen en una misma placa. El componente fundamental del amiloide cerebral es el Aβ, pero también se han encontrado otros componentes como inmunoglobulinas, factores del complemento, fibrinógeno o apolipoproteína E (ApoE). Las placas se encuentran repartidas por todo el encéfalo, predominando en hipocampo, corteza entorrinal y neocórtex (Duyckaerts et al., 2009). La otra lesión insignia de la EA son los ovillos neurofibrilares. Éstos están constituidos por filamentos helicoidales dobles, los cuales están compuestos fundamentalmente por la proteína tau y neurofilamentos anormalmente fosforilados que corresponden a proteínas que forman parte del citoesqueleto neuronal normal (Alberts et al., 2008). De forma normal, la proteína tau actúa de forma multimérica estabilizando los microtúbulos de las neuronas al formar puentes entre las fibras de tubulina; principalmente se encuentra en células del tejido nervioso como las neuronas, astrocitos y oligodendrocitos (Alberts et al., 2008). En la EA esta proteína se hiperfosforila y conduce a un ensamblaje y desensamblaje alterado de los microtúbulos dando lugar un bloqueo en el transporte de orgánulos y proteínas en el citoplasma neuronal, en los axones y en las dendritas con su consecuente disfunción y degeneración (Ballard et al., 2011). Asimismo, la proteína tau hiperfosforilada en los axones y dendritas forma agregados intraneuronales, que a medida que se entrelazan con filamentos celulares aumentan de tamaño y generan ovillos neurofibrilares que inducen a la apoptosis celular. Estos ovillos son insolubles y se presentan como uno de los principales marcadores tisulares de la enfermedad (Ballard et al., 2011). Las regiones con más afectación son hipocampo, corteza entorrinal, neocórtex, complejo amigdalino y núcleos del prosencéfalo basal (Duyckaerts C et al., 2009). • Criterios diagnósticos y biomarcadores. Los criterios diagnósticos empleados por los profesionales para determinar la existencia de EA no tienen un origen común, pese a que la mayoría de éstos emplean las directrices establecidas por la United Status National Institute for Communicative Disorders and Stroke y The Alzheimer’s Disease and Related Disorders Association (NINCDS-ADRDA) (Tierney et al. 1988). No obstante, hay que destacar que estos criterios, pese a ser los más empleados por los profesionales, no son únicos debido a la falta de consenso para dicho diagnóstico. La EA se diagnostica según dos criterios dados por el DSM-IV-TR (Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders fourth edition) y la NINCDS-ADRDA. Según estos criterios se considera que una persona padece EA cuando sufre una deficiencia de memoria y un impedimento extra en otro factor cognitivo que interfiere con su actividad diaria; sin embargo no defiende un diagnóstico definitivo hasta que se confirma histopatológicamente post mortem por lo que un paciente solo padece la enfermedad de forma “probable” (Dubois et al., 2007). En un intento de ir más allá de las directrices propuestas por la NINCDS-ADRDA Dubois et al. (2007) propusieron nuevos criterios para diagnosticar la EA que se basaban en un criterio diagnóstico principal [(pérdida progresiva de las funciones mentales superiores, fundamentalmente la memoria seguido de la capacidad lingüística)] y además un criterio de apoyo que reflejara la confirmación biológica in-vivo mediante los denominados biomarcadores. Los biomarcadores más estudiados en la EA son cinco y se dividen a continuación. Cada uno de ellos es un indicador de un proceso fisiopatológico concreto, por lo que es importante observar el conjunto de los mismos: Biomarcador de apoyo al diagnóstico mediante Imagen Atrofia cerebral mediante MRI estructural Hipometabolismo de la glucosa por FDG-PET PiB-PET Biomarcador de apoyo al diagnóstico mediante extracción de líquido cefalorraquídeo (LCR) Disminución de Aβ en LCR Aumento de tau y p-tau en LCR Está documentado que Aβ está disminuido en LCR en los individuos que padecen de EA y también en los que padecen un estadio previo denominado Deterioro Cognitivo Leve (DCL) (Craig-Schapiro et al. 2009, Hampel et al. 2010). Por otro lado, también se puede estimar la agregación del Aβ y su deposición mediante la tomografía por emisión de positrones o PET (del inglés, Positron Emission Tomography) empleando el compuesto de Pittsburg B (PiB) que se une a las placas ya agregadas de Aβ en el tejido. Hay que destacar que este compuesto solo se une al péptido no soluble ya depositado en placas amiloideas (Clifford et al., 2010, Dubois et al., 2010) Muchos estudios prueban que tau aumenta en LCR (Graig-Schapiro et al., 2009. Hampel et al., 2010. Clifford et al., 2010) y también tau fosforilada. Ambos marcadores son indicadores de daño neuronal y apoptosis. También se emplea para estimar este factor la técnica PET para medir la incorporación de fluorodesoxiglucosa (FDG), esto se considera una forma de medir el metabolismo cerebral y la actividad sináptica. En enfermos de EA se detecta una menor entrada de FDG en el cerebro que refleja una menor toma de glucosa y por ende, un menor metabolismo (Dubois et al., 2014). El uso de biomarcadores específicos permite el diagnóstico de la EA con mayor especificidad e incluso posibilita su determinación antes de que la enfermedad inicie los síntomas (Dubois et al., 2014). Este hecho hace que la necesidad de determinar formas de diagnóstico prematuro de los diferentes tipos de demencia sea uno de los grandes retos de la ciencia y la medicina en estos momentos (Ballard et al., 2011). Es interesante señalar que los biomarcadores están presentes en la práctica clínica diaria, pero con algunas limitaciones. Por ejemplo, los biomarcadores de imagen son costosos y las repeticiones están limitadas. El principal problema del uso de los biomarcadores en LCR es que implican una punción lumbar para la obtención de dicho líquido. Esta técnica es una técnica dolorosa con efectos secundarios tras el examen como migrañas y sangrados raquídeos. Es por ello por lo que la ciencia hoy en día está sumida en la búsqueda de biomarcadores periféricos, aquellos que se encuentren en el plasma o suero de los sujetos, porque es mucho más accesible, menos doloroso y menos costoso. En la presente tesis doctoral se remarcan en aquellas proteínas que pueden ser de interés para actuar como nuevos biomarcadores de EA. MATERIAL Y MÉTODOS Se reclutaron 22 pacientes diagnosticados con deterioro cognitivo leve (DCL) y 20 pacientes diagnosticados con la enfermedad de Alzheimer (EA) siguiendo las recomendaciones de la NINCDS-ADRA. Todos los pacientes fueron diagnosticados en el servicio de Neurología del Hospital Clínico de Valencia por la Dra. Alonso. También se seleccionaron 24 sujetos sanos sin antecedentes de demencia que se sometían a una intervención con anestesia raquídea como grupo control. En todo momento se respetaron los principios fundamentales establecidos en la Declaración de Helsinki, en el consejo de Europa relativo a los derechos humanos y la biomedicina, en la Declaración de la UNESCO sobre el genoma humano y los derechos humanos, así como los requisitos establecidos en la legislación española en el ámbito de la investigación biomédica, la protección de datos de carácter personal y la bioética. Este proyecto fue aceptado por el Comité Ético del Hospital Clínico de Valencia. Los criterios de exclusión se detallan en el apartado Métodos de la presente tesis doctoral. Se realizó una punción lumbar siguiendo los procedimientos estándar. Se recogieron 12mL de líquido cefalorraquídeo en un tubo de poliprolileno y se transportó al laboratorio donde se procesaron todas las muestras. El LCR se centrifugó a 2000xG a 4ºC durante 10 minutos. Se recogió el LCR y el sobrenadante fue pipeteado y posteriormente se alicuotó en volúmenes 500 μl y se congeló a -80ºC hasta su uso en los análisis bioquímicos teniendo en cuenta los ciclos de congelación/descongelación. Aquellas muestras de LCR contaminadas con células sanguíneas en una cantidad superior a 500 eritrocitos/ml fueron descartadas del estudio. Las muestras de sangre fueron recolectadas en tubos para suero. En este caso se depositó la sangre en tubos sin anticoagulante durante 30 min aproximadamente, tras este tiempo la sangre se centrifugo a 1500 G durante 15 min y las muestras de suero se alicuotaron y congelaron a -80º C hasta su posterior análisis. La concentración de las proteínas de interés se llevó a cabo por ELISA (Enzyme-Linked Inmunosorbent Assay) a través de un enzimoinmunoensayo tipo sándwich. La técnica de ELISA es una combinación que emplea la especificidad de los anticuerpos con la sensibilidad de las enzimas para determinar la concentración de un antígeno concreto. Se utilizaron placas de 96 pocillos incubadas con un anticuerpo monoclonal humano contra la proteína que se pretende determinar. El tratamiento estadístico y el montaje de la base de datos siguió diferentes pasos: análisis descriptivo, los test de sensibilidad, ANOVA, realización de curvas ROC, análisis factorial y análisis discriminante. RESULTADOS • Proteínas determinadas en LCR: Aβ, tau y p-tau. Los niveles de Aβ disminuyen significativamente en los pacientes de DCL y EA. Tanto los pacientes del grupo DCL como los del grupo EA presentaron menores niveles de Aβ comparándolos con los sujetos del grupo control. La concentración de Aβ se correlaciona con la severidad de la enfermedad dado que el grupo EA presentó menores niveles de Aβ que el grupo DCL (p<0.05). Los niveles de tau aumentan significativamente en los sujetos del grupo DCL y EA respecto a los sujetos del grupo control. Finalmente, los niveles de tau fosforilada aumentan significativamente en los sujetos de los grupos de DCL y EA respecto a los sujetos del grupo control. • Proteínas determinadas en suero: RCAN1, RAGE, Clusterina, PKR. Los niveles de RCAN1 fueron significativamente mayores en sujetos del grupo DCL que en sujetos con EA. Los niveles de RAGE fueron significativamente mayores en los sujetos del grupo de EA y no se encontraron diferencias significativas entre los sujetos de los grupos DCL y control. Los sujetos del grupo EA presentan menor concentración de clusterina que el grupo control y DCL. No se encontraron diferencias significativas entre sujetos del grupo control y DCL. Finalmente, encontramos menor concentración de PKR en el grupo EA con respecto a los sujetos controles. • Estudio de la especificidad y la sensibilidad de los biomarcadores mediante curvas ROC. Las áreas bajo la curva (AUC) de los biomarcadores empleados en la práctica clínica (Aβ, tau y p-tau medidas en LCR) dan muy buen resultado. Sin embargo, ninguna curva ROC de proteínas medidas en suero deja un AUC aceptable en ninguno de los casos. • Análisis de componentes principales. Realización de un set de biomarcadores. Este hecho nos hizo pensar que la medida de las proteínas por separado podía dar información demasiado distinta. Asimismo, siguiendo la bibliografía consultada y viendo que en nuestra muestra era viable, procedimos a realizar una reducción de factores a partir de la que calculamos un set de biomarcadores. Sobre la base de la idea de Doecke y colaboradores (Doecke et al. 2012), nos planteamos la obtención un set de biomarcadores que uniera la sensibilidad y la especificidad de los biomarcadores determinados en suero. Precisamente el análisis de componentes principales (PCA) identificó dos factores que explican la varianza total de la muestra y nos permite realizar análisis con estos factores que son la combinación de las proteínas séricas de nuestro estudio. Con estos dos factores realizamos dos nuevas curvas ROC. Resulta notable el potencial valor diagnóstico del Factor 1, que tiene una AUC de 0.82 sobre nuestra muestra y que es estadísticamente significativo. Este resultado nos sugiere que este set de 4 proteínas aporta información al diagnóstico de la EA, que ya de por sí es suficientemente complicado. • Capacidad de predicción del set de biomarcadores periféricos. Con el fin de valorar la capacidad de predicción de los biomarcadores séricos, se aplicó un análisis discriminante. En este análisis la variable de agrupación (Y) fue el grupo de diagnóstico y las variables independientes (X) fueron las proteínas séricas de nuestro estudio; el objetivo final es que la función calculada a partir de estas proteínas sea capaz de discriminar entre los dos estados (control o EA). Así, este análisis clasifica a los sujetos de nuestra muestra de forma correcta en el 79.4% de los casos por lo que podemos afirmar que nuestro set de biomarcadores permite discriminar entre sujetos controles y sujetos con EA con el porcentaje mencionado arriba. Además la sensibilidad y especificidad de este set, aplicado sobre nuestra muestra, son del 65% y del 88%. DISCUSIÓN / CONCLUSIONES En los últimos años los criterios diagnósticos de la EA han sufrido una evolución. Hasta ahora se utilizaban los criterios United Status National Institute for Communicative Disorder and Stroke y The Alzheimer’s Disease and Related Disorders Association (NINCDS-ADRDA). Estos criterios recaen en la clínica y sólo alcanzan el diagnóstico de Alzheimer probable, requiriéndose para el diagnóstico definitivo la confirmación histopatológica post mortem. No obstante recientemente aparecen unos nuevos criterios introducidos por Dubois y colaboradores basados en el uso de biomarcadores y pruebas de imagen (Dubois et al. 2007). Estos biomarcadores se realizan en LCR, prueba invasiva y dolorosa, por lo que muchos investigadores nos centramos en la búsqueda de biomarcadores plasmáticos. • Resultados de biomarcadores medidos en LCR: Aβ, tau y p-tau Diferentes estudios se han centrado en medir en LCR los biomarcadores de Aβ, tau total y tau fosforilada (Buchhave et al., 2012; Craig-Schapiro et al., 2009; Hampel et al., 2010). En todos ellos los niveles de Aβ están muy disminuidos en enfermos de EA y moderadamente disminuidos en enfermos de DCL. Los resultados presentados en este trabajo aportan evidencia adicional a los resultados de la bibliografía consultada. El motivo por el cual Aβ está más disminuido en LCR en los enfermos de EA que en los sujetos del grupo DCL se debe a que hay una menor cantidad de péptido amiloide circulante en el líquido ya que está en su mayoría agregado en formas de placas amiloides. El sistema empleado (ELISA) sólo es capaz de medir el péptido amiloide en su forma soluble. Por otro lado, los niveles de tau total y tau fosforilada presentados en los resultados también coinciden con la bibliografía consultada (Buchhave et al., 2012; Craig-Schapiro et al., 2009; Hampel et al., 2010) y muestran un aumento de los niveles de dichas proteínas en el LCR de enfermos de EA y DCL, que se corresponde con el aumento en la formación de ovillos neurofibrilares propio de la enfermedad. Estas tres proteínas (Aβ, tau total y tau fosforilada) son los únicos biomarcadores admitidos en la práctica clínica hasta el momento por ser los más sensibles a la hora de obtener una confirmación biológica del diagnóstico clínico de EA, el problema radica en tener que determinarlos en LCR ya que la punción lumbar presenta efectos secundarios derivados de la intervención. • Resultados de los biomarcadores medidos en suero: Clusterina, RAGE, RCAN1 y PKR. La clusterina o Apo J es una proteína capaz de interactuar con Aβ y promover o prevenir su agregación mediante la interacción con la astroglía o con la BHE (Nuutinen et al. 2009). Los resultados presentados muestran una disminución significativa de los niveles de clusterina en el suero de sujetos con EA respecto al suero de los controles. Además, estos resultados se correlacionan con los presentados sobre la concentración de Aβ en los sujetos EA que, recordemos, presentaban una disminución de este péptido a medida que avanzaba la enfermedad. Nosotros pensamos que esto se debe a que la clusterina a concentraciones de Aβ elevadas tiende a agregar junto al péptido, siendo proamiloidogénica (Yerbury et al. 2007). De esta forma, se co-incorpora junto a su sustrato en agregados insolubles, lo cual indicaría una disminución en el suero. Los resultados presentados muestran un mayor nivel de RAGE en el suero de enfermos con EA respecto a sujetos controles. Este resultado se correlaciona con la disminución ya observada en los niveles de Aβ en los sujetos con EA. Por lo tanto, pensamos que existe una facilitación por parte de RAGE que permite al Aβ entrar de nuevo en el cerebro, como ya está descrito (Kook et al. 2013). Nuestros resultados muestran una disminución de RCAN1 en el suero de los sujetos de EA respecto al suero de los sujetos DCL. Sin embargo no encontramos diferencias significativas entre los niveles de sujetos controles y sujetos EA. RCAN1 está sobreexpresada en pacientes con EA (Wu et al. 2014). Esta sobreexpresión estaría directamente relacionada con la muerte neuronal y la formación de ovillos neurofibrilares, dado que un aumento de RCAN1 implica una regulación negativa de la calcineurina (Cook et al. 2005; Ermak et al. 2011) que es una defosforilasa de tau. Datos previos de nuestro laboratorio muestran que, además, RCAN1 es capaz de inducir a GSK3β. Por tanto la sobreexpresión de esta enzima aumentará la hiperfosforilación de tau al inhibir la calcineurina y, a la par, estimular a GSK3β. Además, los resultados sugieren que Aβ induce la expresión de RCAN1, cerrando un círculo que uniría las dos lesiones insignia de la EA (Lloret et al. 2011). Para interpretar este resultado, pensamos que es importante tener en cuenta que Aβ soluble induce la expresión de RCAN1 (Lloret et al. 2011). Como ya hemos mencionado, en los enfermos de EA la cantidad de Aβ circulante es menor porque existe una mayor deposición en forma de placas seniles. Los resultados obtenidos de RCAN1 nos sugieren que esta inducción podría no producirse en los sujetos con EA, y por ello, no detectamos diferencias respecto a los controles. Los resultados presentados muestran que los sujetos con EA tienen un menor nivel de PKR en suero, significativamente distinto que los sujetos controles. Se ha descrito que PKR está relacionada con un aumento de la actividad de BACE1 en condiciones de estrés oxidativo, ya que esta proteína se vería inducida por PKR (Dumurgier et al. 2013). Este hecho provoca un aumento en la síntesis de Aβ que está relacionada directamente con el desarrollo de la EA. Además, se ha visto que Aβ es capaz de activar PKR, promoviendo un bucle que produce una mayor cantidad de Aβ mediante la activación de BACE (Porta et al. 2007). Asimismo Bose y colaboradores mostraron en su trabajo que PKR induce la fosforilación de tau, además de apoptosis, en neuroblastomas expuestos a Aβ (Bose et al. 2011). Todos los biomarcadores mencionados en esta discusión se entrelazan y ponen de manifiesto la complicada fisiopatología de la EA. • Estudio de la sensibilidad y especificidad de los biomarcadores. Una prueba relevante de la capacidad de una molécula para ser considerada un buen biomarcador es la curva ROC. Nosotros comprobamos que las curvas ROC de los biomarcadores en LCR presentan áreas bajo la curva elevadas, lo cual indica una alta especificidad y sensibilidad. Este no es el caso de los biomarcadores determinados en suero en nuestra muestra, ya que, de todos ellos, la mayor AUC viene dada por la clusterina y es de 0.75, ligeramente inferior al valor umbral de 0.8 para ser considerado como aceptable. Nuestro set de biomarcadores plasmáticos propuestos (que incluye RCAN, clusterina, PKR y RAGE) presenta una AUC de 0.81, que determina una capacidad diagnóstica elevada, con un AUC de 0.81. Este resultado nos sugiere que las proteínas periféricas que hemos determinado sí que son, en conjunto, biomarcadoras de la EA. Además, consideramos que este set de biomarcadores aporta una evidencia añadida a los biomarcadores periféricos que están siendo objeto de investigación (Thambisetty et al. 2010; Henrisken et al 2014, Hye et al. 2014). Otro aspecto que refuerza el valor predictivo de este set de biomarcadores es el porcentaje de acierto en la clasificación de sujetos según las fórmulas obtenidas en el análisis discriminante. El objetivo de esta prueba es asignar a cada sujeto a su grupo diagnóstico correcto (Control o EA) empleando únicamente las proteínas del set de biomarcadores que podían introducirse en el análisis (que son clusterina, RAGE y PKR). El porcentaje de acierto en esta clasificación es del 79.4%.Alzheimer’s disease is the most common form of primary dementia and causes elevated social and economic burden. Determination of aβ, total tau and phosphorylated tau in CSF are included as criteria for AD diagnosis, but the procedure is invasive and patients show secondary complications. Moreover, determination of atrophy in the temporal lobe by MRI or determination of neuron's hipometabolism by FDG-PET are expensive techniques, not available for all the healthcare centers. Therefore, identifying noninvasive biomarkers of early AD has turned into a priority for the scientific community. This study aims to identify blood biomarkers of Alzheimer’s disease (AD) and its previous stage, mild cognitive impairment (MCI) either from blood samples and cerebrospinal fluid (CSF). In this study we recruited 24 healthy people (controls), 22 patients diagnosed with MCI and 20 patients suffering from AD. CSF was extracted by lumbar puncture and blood samples were also taken to obtain plasma and serum. The levels of aβ, total tau, phosphorylated tau, clusterin, regulator of calcineurin (RCAN1), protein kinase RNA-activated (PKR), calcineurin, receptor of advanced glycation end-products (RAGE) and ApoE genotype were determined. Patients diagnosed with MCI or AD showed lower CSF levels of aβ and higher CSF levels of total tau and phosphorylated tau than control patients. In addition, AD patients had lower serum levels of clusterin and PKR while they showed increased levels of RAGE. Finally, AD patients also showed lower levels of RCAN1 than MCI patients. We also obtained ROC curves from all the proteins measured, and aβ, tau and p-tau in CSF proved to be gold-standard parameters while our proteins had lower Area Under the Curve values. We also performed a principal components analysis to see the common factors among the variables and we use them to obtain an improved ROC curve that is representative of a set of biomarkers (composed by Clusterin, RCAN1, PKR and RAGE). These biomarkers allow us to discriminate among subjects in different stages of AD pathology. Finally, we performed a discriminant analysis to test if our set of biomarkers could classify subjects in alzheimer's patients or not alzheimer's patients. Finding blood biomarkers will be promising for early diagnosis of AD in the development of successful therapies, in this study we conclude that clusterin, RAGE and PKR could be used as biomarkers for AD. Both, clusterin and RAGE are involved in aβ clearance from the brain since they correlate with aβ levels, while PKR seems to have a role in tau phosphorilation. Also we want to remark that aβ, total tau and phosphorylated tau correlate with the clinical diagnosis of the patients.