NAGIOS: RODERIC FUNCIONANDO

Identification of new biomarkers for phenotypical characterization in peripheral neuropathies

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Identification of new biomarkers for phenotypical characterization in peripheral neuropathies

dc.contributor.advisor	Pallardó, Federico V.
dc.contributor.advisor	García Giménez, José Luis
dc.contributor.author	Seco Cervera, Marta
dc.contributor.other	Departament de Fisiologia	es_ES
dc.date.accessioned	2017-09-22T12:08:49Z
dc.date.available	2018-09-23T04:45:05Z
dc.date.issued	2017	es_ES
dc.date.submitted	15-09-2017	es_ES
dc.identifier.uri	http://hdl.handle.net/10550/61012
dc.description.abstract	Introducción Las neuropatías periféricas hereditarias son aquellas enfermedades que afectan al sistema nervioso periférico y cuya etiología reside en un desorden genético hereditario. La neurodegeneración que presentan este tipo de enfermedades se caracteriza por una pérdida progresiva de la función y/o estructura en las neuronas. En el caso de axonopatias el proceso empieza en los extremos distales de los axones largos seguido de una progresión hacia las partes más proximales. Este tipo de desórdenes plantea dificultades en el diagnóstico clínico debido a la variabilidad de síntomas clínicos y a las diferentes variaciones fenotípicas que se presentan en los pacientes. Especies reactivas del oxígeno (ERO) y especies reactivas del nitrógeno (ERN) son generadas en el metabolismo normal de la célula. Mecanismos enzimáticos y no enzimáticos están presentes también en la célula para mantener estas especies reactivas en equilibrio. Alteraciones en los mecanismos de defensa o en los mecanismos que generan ERO y ERN producen lo que se denomina como estrés oxidativo. Este desbalance, conlleva a un aumento de las especies reactivas dando lugar a daño en el ADN, lípidos y proteínas. La generación de este daño produce ciertas marcas en cada uno de estos tipos de moléculas que pueden ser detectados y utilizados como marcadores de estrés oxidativo. La enfermedad de Charcot-Marie-Tooth (CMT; ORPHA166) es la neuropatía hereditaria más común y recoge a un grupo heterogéneo de desórdenes con características clínicas, neurofisiológicas, genéticas y patológicas comunes. Las características clínicas que definen este tipo de pacientes son: debilidad y deterioro muscular de las extremidades distales, reflejo osteotendinoso disminuido o ausente, pérdida de la sensibilidad distal y frecuentemente deformidades esqueléticas. Este fenotipo y las características clínicas observadas en pacientes con CMT son consecuencia de una progresiva pérdida axonal en los nervios sensitivos y motores. Este desorden tiene un origen genético diverso con más de 75 genes asociados a la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth. El desorden genético que con más frecuencia se encuentra en pacientes con la enfermedad de CMT es una duplicación intracromósomica que incluye a la parte del gen codificante para la proteína periférica de mielina de 22 kDa (PMP22). Este tipo de alteración define un subtipo de la enfermedad denominado CMT subtipo 1A (CMT1A). PMP22 es una proteína integral de la membrana altamente expresada por las células de Schwann mielinizantes del sistema nervioso periférico. Esta proteína forma parte de la región compacta de la vaina de mielina donde tiene una función estructural además de participar en los primeros pasos de la formación de ésta. PMP22 además actúa como mediador entre la célula de Schwann y la matriz extracelular, regulando la proliferación celular y la apoptosis, y ha sido relacionada con las uniones intracelulares. La enfermedad de Charcot-Marie-Tooth, como ya se ha descrito, presenta un fenotipo heterogéneo con un amplio rango de alteraciones genéticas y genes implicados. Además, el debut en la infancia, la diferente progresión y severidad de los pacientes de CMT y la falta de tratamiento para esta enfermedad hereditaria potencia la necesidad de encontrar nuevos biomarcadores de diagnóstico, pronóstico y monitorización de los efectos terapéuticos de los ensayos clínicos. La ataxia de Friedreich (FRDA; OMIM 229300) es una enfermedad mitocondrial neurodegenerativa con una herencia autosómica recesiva, aunque dentro de las ataxias hereditarias es la más prevalente. A pesar de este último hecho, se considera una enfermedad rara o poco frecuente con un debut en la infancia y que presenta una progresiva pérdida de las neuronas sensitivas en el ganglio dorsal de la raíz y la columna posteriores de la médula. Además de presentar alteraciones en el sistema nervioso periférico, el sistema nervioso central también está afectado detectando alteraciones en el núcleo dentado del cerebelo de estos pacientes. Al mismo tiempo de estas características neurológicas, otras enfermedades concomitantes se han descrito en pacientes de FRDA. Así, los pacientes de FRDA pueden presentar, además de mostrar las características neurológicas, escoliosis, diabetes tipo II y cardiomiopatía hipertrófica. Esta última es la principal causa de muerte en pacientes de FRDA. El fenotipo observado en pacientes de FRDA está causado por una alteración en el número de repeticiones del tripéptido guanina-adenina-adenina (GAA) en el primer intrón del gen que codifica FXN que codifica para la proteína frataxina. Alelos con hasta 36 repeticiones son considerados como normales, mientras que más de estas repeticiones puede conllevar la generación de expansiones patogénicas. En el caso de ataxia de Friedreich las repeticiones fluctúan entre 44 y 1700 y generan la disminución de expresión de la proteína frataxina. La función principal de frataxina no está claramente corroborada, sin embargo, esta proteína se ha visto implicada en diversas funciones. Una de las primeras descritas fue en relación a su capacidad para unir hierro ejerciendo un papel de almacenaje de hierro. Por otro lado, también se la ha relacionado con la formación de los clústers hierro-azufre, imprescindibles para el correcto funcionamiento en la mitocondria de los complejos I, II y III de la cadena de transporte electrónico y la enzima aconitasa, y en la biosíntesis de grupo hemo. Este tipo de ataxia, presenta diferencias en las características clínicas, así como en la progresión de la enfermedad. Además, la presencia de enfermedades concomitantes incrementa la complejidad de esta neuropatía por lo que se está incrementando el estudio de posibles biomarcadores pronóstico de esta enfermedad. No obstante, no existen biomarcadores fiables que puedan estratificar los pacientes según su enfermedad/es concomitante/s (diabetes, escoliosis y cardiomiopatía hipertrófica). Los microARNs (miARN) son pequeñas secuencias de 22 nucleótidos localizadas en regiones intragénicas y/o intrínsecas de transcritos que codifican para proteínas. Tras su procesamiento por el complejo Drosha-DGCR8 y Dicer, dos hebras complementarias se generan y una es incorporada al complejo de silenciamiento inducido de ARN. Este complejo se une por complementariedad a la secuencia de ARN mensajero de la proteína diana controlando su degradación, y por tanto los niveles de proteína. Estas pequeñas moléculas genómicas han sido descritas como biomarcadores de diferentes enfermedades. Están además implicadas en el desarrollo y correcto funcionamiento del sistema nervioso. Por ello estudios de los perfiles de expresión de estos miARN puede proveer de más conocimiento acerca de los mecanismos patológicos de las enfermedades neurodegenerativas además de servir como biomarcadores de progresión de la enfermedad y monitorización de los tratamientos que se utilicen durante los ensayos clínicos. Hipótesis y objetivos Dada la heterogeneidad fenotípica observada tanto en los pacientes de Charcot-Marie-Tooth como en los de ataxia y la ausencia de marcadores de pronóstico y seguimiento de ensayos clínicos fiables, la necesidad de encontrar nuevos biomarcadores es más que patente. Análisis de marcadores de estrés oxidativo y de expresión de proteínas pueden proporcionar un perfil de expresión diferencial entre pacientes leves, pacientes severos y controles que puede utilizarse como biomarcadores en este tipo de pacientes. Por otra parte, estudios de expresión diferencial de miARN pueden dilucidar diferencias en el perfil de expresión entre pacientes de FRDA o los diferentes modelos celulares de ataxia de Friedreich y sus respectivos controles que pueden ser nuevos biomarcadores para esta neuropatía. El principal objetivo de este estudio es encontrar biomarcadores de estratificación clínica, pronóstico y/o monitorización de ensayos clínicos en la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth y en la ataxia de Friedreich. Para ello se pretende llevar a cabo los siguientes objetivos y sub-objetivos: I. Búsqueda de biomarcadores en plasma de pacientes leves y severos de la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth con duplicación en PMP22. a. Analizar marcadores de estrés oxidativo en plasma de pacientes leves y severos de la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth con duplicación en PMP22. b. Explorar la expresión diferencial de marcadores proteómicos en plasma de pacientes leves y severos de la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth con duplicación en PMP22 y validar los posibles biomarcadores. II. Búsqueda de biomarcadores genómicos en plasma de pacientes de ataxia de Friedreich y modelos celulares de la enfermedad (células madre de la mucosa olfativa, fibroblastos y SH-SY5Y). a. Evaluación de la representación diferencial de los miARN en muestras de plasma de pacientes de FRDA y controles sanos, análisis bioinfomático de las rutas reguladas por estos miARN y validación de miARN candidatos a biomarcadores y sus rutas diana. b. Analizar la expresión diferencial de modelos celulares de la enfermedad (células madre de la mucosa olfativa, fibroblastos y SH-SY5Y), análisis bioinfomático de las rutas reguladas por estos miARN y validación de miARN candidatos a biomarcadores y sus rutas diana c. Validar el perfil de miARN de muestras de plasma de pacientes de FRDA y controles sanos en modelos celulares de la enfermedad (células madre de la mucosa olfativa, fibroblastos y SH-SY5Y) y sus rutas diana. Metodología Tras obtener la aprobación de los comités éticos y científicos de los hospitales y biobancos implicados en este estudio, se realizó la colecta de las muestras de plasma en tubos EDTA de pacientes de la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth (Subtipo 1A) y de ataxia de Friedreich y sus respectivos controles agrupados por edad y sexo. Para el caso de CMT, 42 pacientes caucásicos y 22 sujetos caucásicos sanos se unieron a estudio. Los pacientes se clasificaron según la escala CMTNS en leves si el valor era menor o igual a 15 o en severos si el valor era superior a 15. En el caso de FRDA 25 pacientes caucásicos y 25 controles caucásicos fueron incluidos en el estudio. Además de las muestras de plasma tres modelos celulares diferentes de ataxia de Friedreich fueron utilizados en este trabajo: líneas celulares de fibroblastos de pacientes de FRDA y fibroblastos de sujetos sanos; líneas celulares de células madre de la mucosa olfativa de pacientes de FRDA e individuos sanos; línea celular de deficiencia en frataxina por interferencia en células de neuroblastoma SH-SY5Y y sus controles. Para la búsqueda de biomarcadores de estrés oxidativo en muestras de plasma de CMT, se determinaron los niveles de Malondialdehido (MDA) mediante cromatografía liquida de alta presión acoplada a detección con ultravioleta (HPLC-UV). Los niveles de proteínas carboniladas se obtuvieron mediante derivatización de las muestras con el kit “Oxi-BlotTM protein oxidation detection kit” (Millipore, EE. UU.) y posterior inmunodetección con técnica “dot-blot”, en la que las muestras son adsorbidas en una membrana de nitrocelulosa y para posteriormente realizar la inmunodetección con anticuerpos específicos. También mediante esta técnica “dot-blot” se obtuvieron los niveles de proteínas nitrosiladas. Las imágenes obtenidas se densitometraron mediante el uso del software imageJ. Para obtener los niveles de glutatión, así como determinar el ratio de glutatión oxidado (GSSG) y reducido (GSH), se utilizó el kit comercial “DetectX Glutathione kit” (Arbor Assays, EE. UU). Por último, mediante el uso del kit “Cayman’s Antioxidant Assay Kit” (Cayman, EE. UU.) se determinó la capacidad antioxidante total que presentaba cada uno de los grupos analizados. Para realizar el análisis proteómico de las muestras de plasma de pacientes de la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth se realizó mediante el uso de una técnica mejorada de la electroforesis en dos dimensiones: la electroforesis diferencial en gel de dos dimensiones (2D-DIGE). Esta técnica permite identificar las proteínas con expresión diferencial entre un grupo diana (en nuestro caso el grupo leve o severo de pacientes de CMT) y un grupo control. Para ello cada una de las muestras seleccionadas de cada uno de los grupos se tiñe con un fluoróforo de los denominados cyDyes diferente. Este tipo de fluoróforos se unen covalentemente en una proporción uno: uno a la proteína. Además, una mezcla equimolecular de ambas muestras se tiñó con otro fluoróforo Cy diferente a los anteriores para normalizar los niveles de proteínas. Las tres muestras teñidas se incorporaron a una tira de gradiente de pH inmovilizado “IPG strips” (24cm, non-lineal pH 3-10, Immobiline DryStrip, GE Healthcare, EE. UU.) y se separaron según su punto isoeléctrico. Posteriormente estas tiras se incorporaron a geles de poliacrilamida donde se realizó la segunda dimensión de la técnica y las proteínas que previamente se habían separado por punto isoeléctrico, se separaron además por tamaño molecular. Los geles fueron escaneados con “Typhoon™ TRIO” (GE Healthcare, EE. UU) y analizados con el software Decyder software (GE Healthcare, EE. UU.) que nos determinó los picos con expresión diferencial observados en cada uno de los contrastes realizados. Estos picos identificados en el gen posteriormente fueron extraídos utilizando un equipo “Ettan spot picker” (GE Healthcare, EE. UU). Cada una de las muestras obtenidas del análisis 2D-DIGE fueron analizadas por espectrometría de masas o por cromatografía liquida acoplada a espectrometría de masas, identificando así cada una de las muestras que se observaron con expresión diferencial. Para determinar la relevancia de estas proteínas en el contexto de la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth, se realizó un estudio bioinformático con la herramienta web PhenUMA, en la que se realizó un primer análisis de similitudes fenotípicas que presenta el gen mutado en estos pacientes (PMP22) y posteriormente otro análisis de relaciones fenotípicas entre los genes relacionados con PMP22 por presentar rasgos fenotípicos similares al ser alterados y los genes de las proteínas identificadas en el análisis 2D-DIGE. Por último, se realizó una validación de la proteína gelsolina mediante el uso de ensayos de inmunodetección ligados a enzimas (ELISA), en concreto el kit comercial “Human plasma (soluble) gelsolin ELISA kit” (Aviscera Biocience, EE. UU.). En el caso de los análisis genómicos de miARN, a partir de las muestras de plasma de pacientes de FRDA y controles o precipitado de las diferentes líneas celulares presentes en los tres modelos de FRDA mencionados anteriormente se aisló la fracción pequeña de ARN. En el caso de las muestras de plasma se realizó mediante el uso del kit “miRNeasy Serum/Plasma kit” (Qiagen, Termofisher, EE. UU.), mientras que en el caso de los modelos celulares se utilizó el kit “miRvana miRNA Isolation Kit” (Applied Biosystems/Ambion, EE. UU.). Una vez aislados los miARN se procedió al análisis de secuenciación de la fracción pequeña de ARN (small-RNA sequencing). Los miARN procedentes de plasma fueron analizados mediante la plataforma Ilumina. Para ello, previamente a la secuenciación se generó una biblioteca de ADN complementario (cADN) utilizando para ello los kits “RNA Library Prep Set for Illumina” (Set 1&2) (New England Biolabs, EE. UU.). Estas bibliotecas fueron empleadas para la generación de los “clústers” y la secuenciación en la plataforma de “Illumina HiScanSQ platform” (50 bp single read; Illumina, EE. UU.). Los resultados obtenidos fueron analizados para determinar su calidad mediante el software FastQC y alineadas con el genoma humano de referencia Hg18 y la base de datos de miARN miRBase v21 utilizando para ellos los paquetes “Subread” y “Rsubread”. Por otro lado, los miARN procedentes de los modelos celulares fueron secuenciados mediante la tecnología “Ion Torrent”. La generación previa de la biblioteca de cADN por tanto se realizó mediante el kit, correspondiente para esta plataforma de secuenciación, “Ion Total RNA-Seq Kit v2” (Life Technologies/Thermo fisher, EE. UU.). Estas bibliotecas de cADN se utilizaron para generar las “beads” que se incorporaron al chip que posteriormente se introduciría en el secuenciador “Ion Proton sequencer” (Life Technologies/Thermo FIsher, EE. UU.). Las secuencias obtenidas fueron alineadas con el genoma de referencia Hg19 y la base de datos de miARN miRBase v21. La expresión de los miARN procedentes de plasma fueron normalizadas y se seleccionaron aquellos que tenían una expresión diferencial con una tasa de falso descubrimiento (FDR) de 1e-4. En el caso de los miARN de modelos celulares la expresión diferencial de estos fue calculada utilizando los paquetes del software R denominados “EdgeR” y “DESeq” 2. Por último, se determinaron las proteínas diana de regulación de los miARN detectados con expresión diferencial mediante el uso de la sección DIANA-microT-CDS del servidor web DIANA v5.0 y “DIANA-miRPath” v3.0 para determinar las rutas moleculares en las cuales están las dianas de los miARN. Estos miARN fueron validados mediante técnicas de cuantificación basadas en la reacción en cadena de la polimerasa (RT-qPCR), así como la evaluación de los niveles de ARN mensajero de las dianas del miR-330-3p. Por último, se realizaron análisis estadísticos Chi-cuadrado para determinar si los miARN encontrados con expresión diferencial en plasmas de pacientes de ataxia de Friedreich respecto a sus controles permitían estratificar a los pacientes según su enfermedad concomitante (diabetes o cardiomiopatía). Además, se realizaron análisis de curvas de Característica Operativa del Receptor (ROC) para determinar la especificidad y la sensibilidad de los miARN. Todos estos análisis se realizaron mediante el uso del software SPSS versión 20 (IBM Corporation, EE. UU.). El resto de análisis estadísticos no especificados se realizaron mediante el uso del software “Graphpad Prism” versión 6 (GraphPad Software, EE. UU.). Resultados y discusión Las enfermedades neurodegenerativas presentan una alta variabilidad fenotípica y genotípica, por ello es de especial relevancia la obtención de nuevos biomarcadores que permitan mejorar el conocimiento sobre la estratificación de pacientes, la progresión de la enfermedad y la monitorización de tratamientos analizados en ensayos clínicos. En esta tesis se ha pretendido obtener biomarcadores de estrés oxidativo y proteómicos en plasmas pacientes de la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth con duplicación en gen de la proteína PMP22 y biomarcadores genómicos, en concreto miARN, en plasmas de pacientes de ataxia de Friedreich y modelos celulares de esta enfermedad. En la búsqueda de biomarcadores de estrés oxidativo en los plasmas de CMT, se analizaron los niveles de daño proteico por estrés oxidativo mediante los niveles de proteínas carboniladas y nitrosiladas. También se determinaron los niveles de daño oxidativo en lípidos mediante los niveles de malondialdehido (MDA). Sin embargo, no se entraron diferencias en ninguno de ellos. Tampoco se observaron diferencias en los niveles de capacidad antioxidante total, ni en los niveles de glutatión total y cociente GSSG/GSH, por lo que parece que no hay marcadores de estrés oxidativo en plasmas de pacientes de la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth con duplicación en el gen PMP22 (CMT1A). Por otra parte, en el análisis proteómico mediante la técnica 2D-DIGE, se identificaron veinte proteínas con expresión diferencial entre pacientes de CMT (pacientes leves y pacientes severos) comparados con los sujetos sanos. Estas proteínas fueron: Afamina, Región C de la cadena kappa de las inmunoglobulinas, Plasminógeno, Factor B del complemento, gelsolina, Antitrombina-III, Apolipoproteína A-IV, Haptoglobina, Clusterina, Componente C6 del complemento, Cadena del fibrinógeno, Vitronectina, Serotransferrina, Kininogeno-1, Alfa-1-antitrypsina, Alfa-2-HS-glicoproteina, Alfa-1B-glicoproteina, Proteína de unión a vitamina D, Apolipoproteína E y Apolipoproteína A-I. De estas proteínas solo diecisiete mostraron tener relación con PMP22 a través de otras proteínas que al ser mutadas tenía un fenotipo similar al observado en la duplicación de PMP22 al analizarlas con el software PhenUMA. Gelsolina es una de las proteínas identificadas con expresión diferencial entre pacientes leves de CMT y pacientes severos al compararlos con los sujetos sanos. Esta proteína está relacionada con PMP22 a través de otras proteínas relacionadas fenotípicamente con esta última y además ha sido descrita con niveles alterados en otra neuropatía, la amiloidosis familiar tipo finlandesa. Por ello se validaron los niveles de esta proteína en los tres grupos estudiados (pacientes leves, pacientes severos y controles). Sin embargo, no se observaron diferencias en los niveles de gelsolina entre estos grupos. Además, también se analizó la correlación entre la edad de los pacientes de CMT o controles y los niveles de esta proteína, ya que en el caso de la amiloidosis familiar si se observó una relación entre los niveles de esta proteína y la edad. En el caso de los pacientes de CMT, una ligera correlación se observó entre la edad y los niveles de gelsolina, pero no suficiente para que las diferencias en los niveles de gelsolina puedan ser explicados por las diferencias de edad. En el caso de los pacientes no se observó correlación. Todos estos resultados muestran que gelsolina no es un buen biomarcador para la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth. Del resto de proteínas identificadas, la proteína de unión a vitamina D ha sido descrita como biomarcador en otras enfermedades neurodegenerativas. Otras proteínas implicadas en la coagulación como son plasminógeno y la antitrombina III se han descrito como alteradas en diferentes enfermedades del sistema nervioso. Otras proteínas como son la cadena gamma del fibrinógeno y la vitronectina también se encuentran alteradas en otras neuropatías. Por su parte los factores B y componente C6 del complemento están relacionados con enfermedades neurodegenerativas y distrofias neuroaxonales respectivamente. Las lipoproteínas clusterina (también conocida como Apolipoproteína J), Apolipoproteína A-IV, Apolipoproteína E y Apolipoproteína A-I han sido encontradas con niveles alterados en diferentes neuropatías además de en nuestro estudio. Esto indicaría una alteración del metabolismo de las lipoproteínas en la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth y se explicaría por su papel en la organización de las zonas ricas en lípidos derivados de colesterol, por ello este estudio muestra diferentes proteínas con expresión diferencial, y con asociación con otras enfermedades neurodegenerativas, que pueden ser posibles biomarcadores proteómicos para la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth. El estudio de biomarcadores en la ataxia de Friedreich se realizó mediante el análisis del miRNoma en plasmas de pacientes y en tres modelos diferentes de esta enfermedad ya que estas moléculas puedes ser potenciales biomarcadores de diagnóstico, pronóstico y monitoreo de ensayos clínicos. En el caso del miRNoma de las tres líneas celulares hemos detectado diferente perfil de expresión entre los casos y los controles de cada una de ellas (fibroblastos, células madre de la mucosa olfativa y líneas celulares de SH-SY5Y). Al comparar los diferentes perfiles de expresión de los 3 modelos no se encontraron miRNAs que aparecieran en todos ellos, pero si se detectaron al realizar comparaciones entre un grupo y otro de los dos grupos restantes. Así, hsa-miR-10b-5p se encuentra en los perfiles de expresión de fibroblastos y líneas celulares SH-SY5Y. hsa-miR-409-3p, hsa-miR-3117-3p, hsa-miR-106b-3p, hsa-let-7a-2-3p, hsa-miR-15a-3p, and hsa-miR-106b-5p están expresados diferencialmente en líneas celulares SH-SY5Y y células madre de mucosa olfativa. hsa-miR-10b-5p, hsa-miR-106b-3p, hsa-miR-15a-3p, and hsa-miR-106b-5p fueron validados en las tres líneas celulares. Además, también se analizaron las rutas en las que están implicadas las dianas de los miARN detectados con expresión diferencial. El metabolismo de lípidos es una ruta que tiene algunas dianas de los miARN detectados (la sintetasa de ácidos grasos y la acil-CoA ácido graso sintasa 4) y ha sido descrita como alterada en modelos de mosca de FRDA. Otra ruta destacada en el contexto de ataxia de Friedreich es la ruta de señalización de AMPK donde FOXO3 es una de las dianas además de Akt, mTORC y la propia AMPK. FOXO3 es un factor de transcripción que fomenta la expresión del gen FBXO32 gen cuya expresión puede potenciar la atrofia o hipertrofia muscular. La expresión de este gen fue analizada en las tres líneas celulares observando que su nivel estaba elevado en todas ellas. En el análisis del miRNoma de las muestras de plasma, encontramos siete miARN circulantes que tienen expresión diferencial entre pacientes de ataxia de Friedreich y sujetos control (hsa-miR-128-3p, hsa-miR-625-3p, hsa-miR-130b-5p, hsa-miR-151a-5p, hsa-miR-330-3p, hsa-miR-323a-3p, hsa-miR-142-3p). Además, al realizar análisis para estratificar los pacientes encontramos que el mir-323a-3p presenta niveles más elevados en aquellos pacientes con cardiomiopatía hipertrófica con una alta sensibilidad (88.9%) y una aceptable especificidad (62.5%). Este miARN puede ayudar a los clínicos en la generación de algoritmos que predigan la cardiomiopatía en este tipo de enfermos, contribuyendo a un diagnóstico y pronóstico temprano previo a la detección por procedimientos estándar. En el análisis de las rutas en las que participan las dianas de los siete miARN encontramos la oxidación de los ácidos grasos y el metabolismo central del carbono, ambas alteradas en FRDA y que pueden contribuir al daño cardiaco en los pacientes de ataxia de Friedreich. Otra ruta, también observada en el caso del estudio del miRNoma en las tres líneas celulares, fue la ruta de señalización AMPK. En este caso además de AMPK, AKT y mTORc, otras proteínas de la ruta como FOXO1, PTEN, ATM o PI3K están también reguladas por estos miARN. Para determinar la importancia de estos miARN en el contexto celular se validaron en los modelos celulares descritos anteriormente (fibroblastos, SH-SY5Y y células madre de la mucosa olfativa), observando que los niveles del miR-330-3p estaban alterados en todos ellos. Por ello se pretendió determinar los niveles de expresión génica de algunas de sus dianas (FOXO1, LDHA, PDHA, and SOD2), observando que la expresión de estas dianas no está regulada por el miR-330-3p en exclusividad, pero este puede estar ejerciendo un papel importante en la fisiopatología de la ataxia de Friedreich. Otras rutas con dianas de los miRNA son la ruta de señalización por insulina cuya desregulación también ha sido descrita en modelos animales y celulares de ataxia de Friedreich y que tiene como consecuencia la aparición concomitante de diabetes tipo II en pacientes de esta enfermedad. Por último, es destacable la ruta de señalización Wnt/β-catenin en la que algunos miRNA tienen como diana la catenina CTNNB1, mientras que otros entre ellos miR-323a-3p tienen como diana la ATPasa transportadora de calcio del retículo sarcoplásmico, ATP2A2. Nosotros proponemos que la disminución de estas proteínas por parte de estos miARN puede generar un aumento de Ca+2 que conduzca a la activación de genes de crecimiento y remodelación cardiaca favoreciendo la aparición de la hipertrofia cardíaca en pacientes de FRDA. Además, como se ha explicado anteriormente el miR-323-3p tiene unos niveles más elevados en pacientes con este tipo de patología y se encuentra sobreexpresado en los modelos celulares de células madre de mucosa olfativa y SH-SY5Y, lo que concuerda con nuestra hipótesis. Todos estos hechos ponen de relevancia la importancia de los miARN en la fisiopatología de la ataxia de Friedreich proporcionando diversos candidatos para la terapia personalizada de estos pacientes y generando nuevo conocimiento acerca de las bases moleculares y fisiológicas que subyacen a esta neuropatía. Conclusiones Este estudio mejora el conocimiento acerca de la fisiopatología de estas enfermedades neurodegenerativas raras. Se muestra una serie de posibles biomarcadores implicados en rutas fisiológicas y moleculares subyacentes a estas enfermedades, que están afectados también en otras enfermedades neurodegenerativas. Por último, proponemos el miR-323a-3p como biomarcador de cardiomiopatía hipertrófica en pacientes con ataxia de Friedreich así como un posible mecanismo por el cual una desregulación de éste generaría el defecto cardíaco.	es_ES
dc.description.abstract	The Charcot-Marie-Tooth disease (CMT; ORPHA166) is the most common hereditary neuropathy. CMT disease contains a heterogeneous group of disorders with similar clinical, neurophysiological, genetic and pathological features. The clinical expression and individual phenotype is the consequence of a progressive axonal loss of both motor and sensory nerves. The most frequent genetic defect underlying CMT is an intrachromosomal duplication on human chromosome 17p12, the locus defining CMT subtype 1a (CMT1A). In this duplicated region, the gene encoding the peripheral myelin protein of 22 kDa (PMP22) is located. PMP22 is a specific integral membrane protein expressed by the myelinating Schwann cells of peripheral neurons at elevated levels and it has been involved in myelin formation and maintenance. Furthermore, PMP22 has been associated with the formation of intercellular junctions of epithelial cells, and cell proliferation and apoptosis regulation. Friedreich’s ataxia (FRDA; OMIM 229300), an autosomal recessive neurodegenerative mitochondrial disease, is the most prevalent hereditary ataxia. This rare, childhood-onset disease is characterized by a progressive loss of sensory neurons in the dorsal root ganglia (DRG) and posterior columns. The cerebellar dentate nucleus is also affected. Other non-neurological features of FRDA are scoliosis, diabetes and cardiac hypertrophy. The last is the primary cause of death in these patients. FRDA is most often caused by a homozygous GAA repeat expansion mutation (typically between 600 and 1200 repeats) in the first intron of the frataxin gene (FXN), which have been proposed as causes of decreased expression of the mitochondrial protein frataxin. The principal function of Frataxin is not clear yet, but it has been described its role in iron homeostasis and Iron-Sulfur Cluster formation. Oxidative stress and proteomic analysis would provide differences between mild CMT patients, severe CMT patients, and controls that could be used as new biomarkers of disease progression. On the other hand, miRNAs analysis would provide different expression profile signatures between patients and controls that may help in the identification of different phenotypes in FRDA’s patients. Furthermore, the miRNome characterization in cellular models of the disease, may help to the comprehension of the special function of differential expressed miRNAs in the physiopathology of Friedreich ataxia. Carbonylation and nitrosylation of proteins, malondialdehide levels, total antioxidant capacity, and glutathione levels did not show differences between mild CMT patients, severe CMT patients, therefore any oxidative stress biomarker was identified for this disease. However, in our 2D-DIGE proteomic analysis we found seventeen proteins (Plasminogen, Complement factor B, Gelsolin, Antithrombin-III, Apolipoprotein A-IV, Haptoglobin, Clusterin, Complement component C6, Fibrinogen gamma chain, Vitronectin, Serotransferrin, Kininogen-1, Alpha-1- antitrypsin, Alpha-2-HS-glycoprotein, Vitamin D-binding protein, Apolipoprotein E, and Apolipoprotein A-I) with a close phenotypic relationship with PMP22 and differential expression compared to controls. One of these candidate proteins, gelsolin, was validated by Enzyme-linked InmunoSorbent Assay (ELISA). However, no differences were found between the three groups analysed. On the other hand, small-RNA sequencing and bioinformatic miRNAs analysis provides different expression miRNA’s profile between plasma samples from patients or cellular models of the disease compared to their respective controls. In the smallRNA-seq analysis in cellular models, we found selected miRNAs shared in at least two of three cell models, which had a relevant role in pathways that were affected in Friedreich’s ataxia. In case of plasma samples, we found different expression profile of miRNAs (hsa-miR-128-3p, hsa-miR-625-3p, hsa-miR-130b-5p, hsa- miR-151a-5p, hsa-miR-330-3p, hsa-miR-323a-3p, and hsa-miR-142-3p) between plasma samples of patients and those obtained from healthy subjects. In addition, we found that hsa-miR323a- 3p was a marker for phenotypic differentiation in FRDA patients suffering from cardiomyopathy and may play a role in Ca+2 regulation in heart. Finally, we found that some circulating miRNAs detected in plasma were also detected in some of the cellular models analysed, reinforcing the hypothesis that these miRNAs play a relevant role in the pathophysiology of FRDA. Taking all together this study, we improve the knowledge about physiopathology of these neuromuscular diseases. In addition, we provide different possible proteomic biomarkers that were previously associated with other neurodegenerative diseases, and should be validated in CMT. Furthermore, we propose miR-323a-3p as biomarker of cardiomyopathy in patients of FRDA.	en_US
dc.format.extent	206 p.	es_ES
dc.language.iso	en	es_ES
dc.subject	biomarcadores	es_ES
dc.subject	neuropatias periféricas	es_ES
dc.subject	proteómica	es_ES
dc.subject	estrés oxidativo	es_ES
dc.subject	mirnómica	es_ES
dc.title	Identification of new biomarkers for phenotypical characterization in peripheral neuropathies	es_ES
dc.type	doctoral thesis	es_ES
dc.subject.unesco	UNESCO::CIENCIAS DE LA VIDA::Biología humana ::Fisiología humana	es_ES
dc.subject.unesco	UNESCO::CIENCIAS DE LA VIDA::Fisiología humana ::Neurofisiología	es_ES
dc.subject.unesco	UNESCO::CIENCIAS DE LA VIDA::Biología humana ::Genética humana	es_ES
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