Facultad de Medicina y Odontología Departamento de Medicina Programa de Doctorado 3042 Medicina Tesis Doctoral Marcadores de angiogénesis, inflamación y coagulación en pacientes con glioblastoma Presentada por: Gaspar Reynés Muntaner Dirigida por: Dra. Ana Lluch Hernández Dr. Jaime Font de Mora Saínz Dra. Vicenta Martínez Sales RESUMEN Valencia, mayo de 2017 El glioblastoma (GB) es el tumor cerebral maligno más frecuente y es, además, el de peor pronóstico. Según datos de Central Brain Tumor Registry of the United States (CBTRUS), un registro detallado de tumores del sistema nervioso central (SNC) en Estados Unidos, el GB representa el 15% de todos los tumores del SNC (benignos y malignos) con una incidencia de 3,2 casos por 100.000 habitantes/año y una ratio hombre/mujer de 1,57. En Europa, algunos registros han comunicado datos de incidencia ligeramente superiores. Extrapolando las cifras a nuestro país, la incidencia anual del GB se puede situar en torno a los 1.500 casos. Desde que se estableció, en 2005, la combinación de radioterapia (RT) y temozolomida (TMZ) como nuevo estándar terapéutico del GB tras la cirugía, se han hecho pocos avances en el tratamiento de la enfermedad, cuya mediana de supervivencia supera escasamente el año. En los últimos años se ha profundizado en el conocimiento de las características moleculares del GB, lo que ha permitido establecer subtipos con implicaciones pronósticas pero, hasta el momento, con escasas repercusiones terapéuticas. El GB es un tumor con un alto índice mitótico. Otra de sus características histológicas es la proliferación microvascular, una superposición de células endoteliales de aspecto glomeruloide. Estas formaciones se acompañan con frecuencia de trombosis vascular y de necrosis rodeada de células en pseudoempalizada. Además, el GB puede estar infiltrado por una variedad de células inflamatorias, que en algunos estudios han mostrado valor pronóstico. Estas características histológicas son la expresión de una alta actividad proliferativa, con formación de áreas hipóxicas como consecuencia, por una parte, del rápido crecimiento tumoral y, por otra, de la frecuente aparición de trombosis vasculares. La hipoxia y las alteraciones génicas del tumor inducen una intensa respuesta proangiogénica. Trabajos sucesivos han ido aportando información sobre las complejas interrelaciones entre angiogénesis, coagulación e inflamación en el GB. Estudios recientes, además, muestran la importancia de la respuesta inflamatoria inducida por el GB para aumentar su capacidad de evasión del sistema inmunitario. Los fenómenos de angiogénesis, coagulación e inflamación tienen lugar a través de una gran variedad de proteínas secretadas por las células tumorales, inflamatorias y endoteliales, y de sus respectivos receptores. Estas proteínas pueden ser detectadas en muestras de tumor, pero también en sangre periférica, y algunas de ellas han mostrado utilidad, ya sea como factores pronóstico o como marcadores de respuesta o progresión, en ensayos clínicos con antiangiogénicos. Además, otros elementos circulantes pueden aportar información al respecto. El recuento de células endoteliales circulantes (CEC) está elevado en diversas patologías que cursan con daño vascular, entre ellas el cáncer. Las micropartículas (MP) son pequeñas vesículas de aproximadamente 0,5 a 1 m de diámetro formadas por en la membrana celular de las plaquetas y de diversas células, en las que la fosfatidilserina ha pasado de la cara interna a la externa de la membrana, favoreciendo así la formación de complejos enzimáticos de la cascada de coagulación. Las MP también están aumentadas en la sangre periférica de pacientes con cáncer y tienen capacidad procoagulante, aumentando el riesgo de trombosis. Además, promueven la angiogénesis y tienen actividad proinflamatoria. Algunos estudios han evidenciado la asociación de los niveles basales o evolutivos de CEC y de MP con la supervivencia, en pacientes con GB bajo diferentes tratamientos. Sin embargo, las diversas formas utilizadas para su selección y recuento dificultan la comparación de los resultados. También ciertas características de la neuroimagen, como el edema y la necrosis, tienen interés como potenciales factores pronóstico, por su relación con la proliferación tumoral y la angiogénesis. Dada la intensa actividad angiogénica del GB, se han ensayado varios fármacos antiangiogénicos, tanto en el tratamiento inicial como en la progresión, pero sus resultados, hasta ahora, han sido modestos. Se ha observado, por otra parte, que algunos fármacos quimioterápicos, administrados a bajas dosis y de forma continua (quimioterapia metronómica) tienen un efecto antiangiogénico mediado por diferentes mecanismos. Además, en el caso concreto de la TMZ, este forma de administración facilita la depleción de O6-alquilguanin-ADN-metiltransferasa (MGMT), una enzima capaz de revertir la acción metiladora de los agentes alquilantes. Finalmente, la administración continua permite alcanzar una densidad de dosis mayor que la obtenida con la pauta convencional de TMZ. El objetivo general de los trabajos que se presentan aquí es la identificación de factores pronóstico relacionados con la angiogénesis, inflamación y coagulación en pacientes con glioblastoma. Además, se ha realizado un ensayo clínico de TMZ metronómica en combinación con irinotecán, en pacientes con GB recidivado. Conjuntamente, estos estudios han mostrado que los pacientes con GB a los que se tomó una muestra de sangre antes de la cirugía presentaban niveles significativamente elevados, con respecto a controles sanos, de una serie de marcadores de angiogénesis (factor de crecimiento endotelial vascular A [VEGFA] y receptor 1 soluble del VEGF [sVEGFR1]), de inflamación (proteína C reactiva [CRP], interleucina 6 [IL6], factor de necrosis tumoral alfa [TNF-α], fibrinógeno [Fg] y ácido siálico [AS]) y coagulación (generación endógena de trombina [GT] y fragmentos 1+2 de la protrombina [F1+2]). Además, se observaron fuertes correlaciones entre los marcadores de inflamación, destacando la correlación de la CRP con todos los demás factores de inflamación estudiados. También se observó una correlación negativa entre los niveles circulantes de VEGFA y el sVEGFR1. Los niveles de estos marcadores no se asociaron a la supervivencia de los pacientes. Por el contrario, la presencia de necrosis tumoral en la neuroimagen por resonancia magnética se asoció a peor supervivencia. En un estudio posterior determinamos los niveles de CEC (seleccionadas mediante como CD146 y lectina1 de Ulex europaeus) y de MP (positivas para anexina V conjugada con isotiocianato de fluoresceína), así como la GT y el tiempo de coagulación dependiente de fosfolípidos procoagulantes (TCDFP). Se tomaron muestras de sangre periférica de controles sanos y de pacientes con GB, antes de iniciar la radioquimioterapia y al final de la misma. Los niveles de CEC y de MP estaban significativamente elevados en los pacientes en relación a los controles Encontramos una esperable y muy importante correlación positiva entre niveles de MP y GT, y una correlación negativa de ambos parámetros con el TCDFP. Además, se observó una disminución significativa de los niveles circulantes de MP y de los valores de GT después del tratamiento. Niveles basales elevados de CEC (>20 células /mL, nivel correspondientes al percentil 99 de los controles) se asociaron a peor supervivencia global (SG); la mediana de SG de los pacientes con recuento de CEC mayor y menor de 20 células /mL fue de 19 y 72 semanas, respectivamente (P=0,033). Se determinó el estado de metilación de MGMT en muestras de tumor parafinado, que mostró una clara asociación con la SG (mediana de SG de 66 semanas frente a 30 semanas para pacientes con tumores metilados y no metilados, respectivamente; P<0,004). Con el fin de estudiar la eficacia y toxicidad de la TMZ metronómica asociada con irinotecán quincenal (puesto que se ha descrito un efecto sinérgico entre ambos fámacos), se llevó a cabo un ensayo clínico multicéntrico en dos fases. La fase I tenía como objetivo la identificación de la dosis máxima tolerada (DMT) de irinotecán en combinación con una pauta fija de TMZ a la dosis de 50 mg/m2/día, distribuida en tres tomas diarias. Una vez establecida la DMT de irinotecán en 100 mg/m2, se inició la fase II del estudio, que incluyó a 27 pacientes con GB recidivado. La mediana de la supervivencia libre de progresión (SLP) fue de 11,57 semanas y la SLP a 6 meses fue del 20,8%. La toxicidad fue aceptable en general, salvo por un paciente que presentó una clínica compatible con tromboembolismo pulmonar y murió. Estos resultados se sitúan en el rango de otros esquemas de tratamiento en recidiva. En este ensayo clínico se determinaron los niveles basales de VEGF, sVEGFR1, TSP1, MP y GT. A excepción de la TSP1, todos los marcadores estudiados presentaban niveles más altos en los pacientes que en los controles. Sin embargo, ninguno de ellos mostró asociación con los resultados clínicos. En definitiva, estos estudios muestran que diversos marcadores de angiogénesis, inflamación y coagulación están elevados en los pacientes con GB, y ponen de manifiesto importantes correlaciones entre ellos. También se ha observado una asociación negativa entre la presencia de necrosis tumoral y supervivencia. El estudio clínico llevado a cabo demuestra que la combinación de TMZ metronómica e irinotecán es factible, aunque sus resultados clínicos no superan a los de otros estudios en GB recidivado. Finalmente, se ha observado que los niveles de CEC antes del inicio de la radioterapia con TMZ concomitante tienen valor pronóstico.