INTRODUCCIÓN La infertilidad es una condición clínica que afecta al 15% de las parejas en edad reproductiva; de las cuales un 28% se ven afectadas por diferentes patologías que resultan en la ausencia de gametos, dentro de este porcentaje se incluyen pacientes con fallo ovárico precoz, mujeres postmenopáusicas y pacientes masculinos diagnosticados de azoospermia no-obstructiva o cualquier otra patología que conlleve la ausencia de espermatozoides funcionales o, al menos, espermátidas elongadas que permitan su uso en tratamientos de reproducción asistida. Estas patologías producen infertilidad en el 1% de las mujeres y el 0.63% de los hombres, en la población general; como consecuencia el uso de gametos de donantes es caso obligado para estos pacientes. Además, aquellas parejas que sean portadores de cualquier trastorno genético con un alto riesgo de transmisión de enfermedades graves a su descendencia o pacientes con fallo recurrente en procesos de fecundación in vitro son considerados como candidatos para terapias que implican donación de gametos. Otro grupo de pacientes que podrían beneficiarse del uso de gametos artificiales son aquellos pacientes que han sido tratados de cáncer en su infancia y han desarrollado infertilidad secundaria al tratamiento contra el cáncer recibido en una etapa en la que no podían preservar sus propios gametos previamente al tratamiento anti tumoral. Por último, existe un grupo poblacional que no sufre de infertilidad y que podría beneficiarse del uso de gametos artificiales generados in vitro; es el caso de parejas del mismo sexo, padres/madres solteras y mujeres post-menopaúsicas. Es por ello que la generación in vitro de gametos artificiales puede ser una excelente oportunidad para estos pacientes para desarrollar sus deseos de ser padres teniendo descendencia genéticamente relacionada. Además del claro beneficio médico para los pacientes de reproducción asistida que subyace tras los modelos de generación de gametos artificiales, su generación contribuiría a una mejor comprensión del proceso de especificación de la línea germinal en humanos de la cual se desconocen sus bases moleculares debido a las restricciones éticas que hacen complicado trabajar con embriones humanos o realizar ensayos funcionales con células germinales obtenidas a partir de células madre pluripotentes o progenitores germinales humanos; así como una mejor conocimiento en potenciales tratamientos de trastornos relacionados con la infertilidad y otras enfermedades genéticas que son susceptibles de ser transmitidas a la descendencia. Las células germinales son la fuente de variabilidad genética y responsables de producir el zigoto totipotente después de la fecundación a partir del cual comienza el proceso de embriogénesis. Durante este período la línea germinal se distingue como un grupo independiente de células conocidas como células germinales primordiales (PGCs de sus siglas en inglés). Los mecanismos que rigen la especificación de la línea germinal en el reino animal varía significativamente según el filo a considerar e incluso, en algunos casos, entre especies muy próximas entre sí. Estas células germinales son cruciales en organismos con reproducción sexual, y en concreto en mamíferos, para completar su ciclo vital. La línea germinal se forma en el momento de la gastrulación a partir de un pequeño grupo de células fundadoras especificadas durante el desarrollo embrionario, estas células PGCs escapan a su destino somático dado por el entorno físico en el que se encuentran dentro del embrión para adquirir un estatus germinal, que las dotará de unas características específicas que les permitirán llevar a cabo con éxito el proceso de meiosis y formar los gametos haploides maduros y funcionales: óvulos y espermatozoides. Actualmente se tiene un relativamente amplio conocimiento acerca de la especificación de la línea germinal durante el desarrollo temprano en mamíferos, aunque este se basa principalmente en el modelo murino debido a la facilidad de acceso a material biológico en todas las etapas de desarrollo y a la relativa facilidad para llevar a cabo modelos funcionales con animales. En este caso las células germinales se originan en la base del alantoides (o epiblasto posterior) en día embrionario 6.25 (E6.25) como un pequeño grupo de aproximadamente 40 células que comienzan a expresar el gen Prdm1 (también conocido como Blimp1) seguido de Prdm14 . Estas células son inducidas mediante señales extrínsecas secretadas por el ectodermo extraembrionario, específicamente BMP4 y BMP8b (bone morphogenetic proteins, en inglés). A su vez, existe una señalización inhibitoria en el eje anterior posterior que procede del endodermo visceral anterior (AVE) que en conjunto con las señales de especificación provenientes del ectodermo extraembrionario restringen el desarrollo de la línea germinal al epiblasto posterior. Prdm1 está considerado como el regulador mayoritario en la especificación de la línea germinal en ratón, su expresión es esencial en la supresión del programa somático, lo que va a permitir la expresión de factores específicos de célula primordial germinal como son Tfap2c, que codifica para AP2 (un factor crítico en la especificación que a su vez participa en la represión de genes somáticos), y Nanos3 (que presenta un rol en la supresión de la apoptosis y participa en la supervivencia y migración de las PGCs); así como marcadores de pluripotencia Sox2, Oct4 y Nanog. La expresión de Prdm1 está promovida en parte por LIN28A, una proteína de unión a microRNAs que interacciona con el microRNA Let7 cuya función es el silenciamiento del mensajero de Prdm1. Así mismo, LIN28A presenta un papel clave en el establecimiento y mantenimiento de la red de pluripotencia puesto que en combinación con OCT4, SOX2 y NANOG es suficiente para inducir este estado en fibroblastos generando así células madre pluripotentes inducidas (iPSCs). El siguiente gen de relevancia en el establecimiento de la línea germinal murina es Prdm14. Su activación también es dependiente de la señalización por BMPs, y actúa sinérgicamente con Prdm1 induciendo la readquisición de pluripotencia e iniciando la reprogramación epigenética necesaria para la especificación; además, junto con Nanog mantiene activas las redes de señalización implicadas en pluripotencia. Prdm14 se expresa en las PGCs entre los estadíos E6.5 y E13.5-14.5; inicialmente su expresión es independiente de PRDM1 pero su mantenimiento depende estrictamente de este. Una vez desencadenada toda esta red de señalización, las PGCs quedan especificadas alrededor del estadio E7.25 como un pequeño grupo de células fosfatasa positivas en el mesodermo extraembrionario (base del alantoides). Una vez que las PGCs son especificadas comienzan a expresar Fragilis (también conocido como Ifitm3) y Stella (Dppa3), mientras que mantienen la expresión de Oct4, Nanog y fosfatasa alcalina. El siguiente proceso clave es el inicio de la migración de las PGCs. El hecho de que las células germinales se especifiquen fuera del embrión propiamente dicho puede ser debido a un mecanismo de plasticidad evolutiva que separa la especificación de las líneas germinal y somática; como consecuencia, las PGCs han de migrar a su localización definitiva que es la gónada. A día 8.5 de desarrollo embrionario, una vez finalizado el proceso de especificación, las células germinales primordiales comienzan a migrar y proliferar a través del endodermo subyacente, alrededor del día E9.5 atraviesan el mesodermo y comienzan a migrar bilateralmente colonizando las crestas gonadales (gónada primitiva), proceso que finaliza aproximadamente a día E11.5. Cuando las PGCs alcanzan la cresta gonadal comienzan a proliferar activamente y forman lo que se conocen como gonocitos, los precursores de las células madre pluripotentes de los gametos, caracterizadas por un alto ratio núcleo/citoplasma. Es a partir de este momento cuando las células germinales cambian su programa de expresión genética, una vez más, y su perfil epigenético, comenzando a expresar genes implicados en la supervivencia y maduración como son Dazl, Vasa y los incluidos en la familia Daz (Daz2 o Boule). Estos genes codifican para un conjunto de proteínas de unión a RNA implicadas en un compendio de procesos celulares como son la identidad sexual, proliferación, supervivencia, migración y regulación de elementos transponibles. Este grupo de proteínas está altamente conservado a lo largo de la evolución y suelen encontrarse asociadas formando grandes complejos en el citoplasma conocidos como cuerpos P. Algunas de estas proteínas con funciones importantes en la línea germinal son, VASA, NANOS, PUMILIO, DND1, DAZL PIWI Y TUDOR. Por ejemplo, DAZL parece ser un elemento crítico en meiosis y DAZ funciona como un regulador clave en el proceso de espermatogénesis en ratón. Todo este conocimiento se ha usado como base para entender el mecanismo de especificación de la línea germinal en mamíferos, suponiendo un mecanismo similar entre todos ellos, con las diferencias obvias. Recientemente se ha comprobado gracias a los modelos in vitro, que las diferencias entre humano y ratón parecen ser más amplias de lo considerado previamente; ya a nivel morfológico existe una clara divergencia en el desarrollo embrionario de ambas especies, el embrión de ratón implanta a día E4.5 y forma una estructura ovoide de ejes proximal-distal y anterior-posterior bien definidos. Sin embargo, tanto humanos como otros mamíferos no-roedores, presentan un embrión plano, en forma de disco bilaminar que después de la gastrulación se convierte en un disco trilaminar que contiene las tres capas germinales (ectodermo, mesodermo y endodermo). Estas diferencias estructurales conllevan también diferencias en los tiempos de desarrollo, expresión génica y señalización requerida para la pluripotencia y la segregación entre linajes. El proceso de especificación en humanos ocurre durante la tercera semana de desarrollo y culmina en la semana 4 dónde las PGCs humanas se identifican como un pequeño grupo de células con una morfología única. A modo teórico el embrión cilíndrico de ratón se ha proyectado en una estructura planar que representa el embrión humano, así el embrión de ratón a día E6.5 (cuando ocurre la especificación de las células germinales) se corresponde aproximadamente con el embrión humano en día E17. El mecanismo de señalización en la especificación parece ser exactamente el mismo en ambos modelos, de este modo nos encontramos con el mismo papel relevante de las BMPs cuyos diversos gradientes restringen la especificación de las PGCs al epiblasto posterior y el incipiente mesodermo. Los mecanismos de especificación comparten muchos puntos clave entre el modelo murino y el humano, pero con diferencias importantes. Por ejemplo, PRDM1 sigue siendo un factor relevante en este proceso, pero en humanos se ha visto que SOX17 juega un papel fundamental siendo el primer factor en ser activado y el encargado de iniciar la expresión de PRDM1. Otra diferencia notable implica a SOX2, un factor de transcripción elemental para la pluripotencia en humanos y ratón, y que se ve sobreexpresado en las PGCs en ratón; sin embargo, en humanos ocurre justamente lo contrario, SOX2 es reprimido en respuesta a la secreción de BMP4 que induce las PGCs. Por el contrario, las PGCs humanas expresan otros factores asociados con el estado de pluripotencia naïve de la masa celular interna (ICM) del embrión, como son TFCP2L1 y KLF4. Los factores de transcripción SOX funcionan en unión con otro factor de transcripción que se une a un lugar adyacente en el ADN, así la función de la proteína SOX depende tanto del contexto del ADN al que se está uniendo como de la identidad de su compañero. Así un cambio entre SOX2 y SOX17 podría ser el responsable de la activación de los genes de célula germinal y endodermo al mismo tiempo, mientras que la expresión de PRDM1 en aquellas células competentes para la línea germinal estaría inhibiendo los genes endodérmicos y permitiendo el desarrollo del perfil germinal. PRDM14, otro factor de gran importancia en la especificación en ratón presenta un perfil de expresión completamente diferente en humanos, llegando a ser incluso prescindible para este proceso. Su expresión es alta en células madre embrionarias humanas competentes para formar células germinales, pero su expresión se silencia rápidamente durante la especificación de las células primordiales humanas-like inducidas in vitro (human PGC-like cells, hPGCLCs, del inglés), hasta unos niveles mínimos. Es probable que esta rápida represión sea necesaria para la salida del estado pluripotente de las células. En este contexto, el papel asociado a PRDM14 en ratón puede haber sido asumido por SOX17 en humanos. Al igual que en ratón las células germinales humanas experimentan un proceso de migración desde el endodermo del saco vitelino, atravesando el endodermo del intestino posterior y el mesenterio dorsal hasta alcanzar las crestas genitales, proceso que tiene lugar entre las semanas 4 y 5 de desarrollo. Durante el proceso de especificación de la línea germinal, tanto en ratón como en humano, resulta fundamental que estás células experimenten un proceso de reprogramación epigenética que elimine cualquier marca epigenética previa. En el ciclo vital de los mamíferos existen dos grandes eventos de reprogramación epigenética que implican un borrado masivo de marcas de metilación. Uno durante el desarrollo de las PGCs que restaura el potencial de desarrollo y elimina las marcas de impronta. Mientras que el segundo tiene lugar en el cigoto, justo después de la fecundación, que tiene como finalidad el borrado de la firma epigenética heredada de los gametos (a excepción de la impronta) y la readquisición de la totipotencia. El primero de ellos tiene lugar en dos fases, una durante la migración de las células germinales dónde la mayoría de las marcas de metilación son eliminadas a excepción de algunas “secuencias con memoria epigenética” como es el caso de las regiones improntadas, las islas CpG del cromosoma X y las de promotores de genes relacionas con el desarrollo germinal. La segunda fase tiene lugar una vez las PGCs han colonizado las crestas genitales, momento en el que todas las secuencias metiladas remanentes sufren un proceso de desmetilación. Las PGCs especificadas mediante las señales extrínsecas descritas anteriormente presentan un estatus epigenético estable, con el ADN globalmente metilado y el cromosoma X inactivo en hembras; esta condición representa un obstáculo para la adquisición del estado totipotente característico de las PGCs, por lo que durante el proceso de migración (E7.5 en ratón y semana 4-5 en humanos), van a experimentar un borrado epigenético global, la reactivación del cromosoma X extra en individuos XX y un remodelado de la cromatina (caracterizado principalmente por la eliminación de modificaciones represivas de las histonas, generando así una cromatina mucho más accesible). La modificación epigenética más ampliamente estudiada es la metilación del ADN, que se basa en la adición de un grupo metilo en posición 5 del anillo pirimidínico de las citosinas (C); se trata de una modificación covalente que tiene lugar principalmente en las citosinas localizadas en los dinucleótidos citosina-guanina (CpG), que a su vez, se suelen agrupar en las denominadas islas CpG, que no son más que áreas en la secuencia de ADN particularmente enriquecidas en estos dinucleótidos CpG; estas islas suelen encontrarse en regiones promotoras, y regiones 5’UTR, todas ellas regiones de ADN no codificante pero relacionado con funciones de regulación del proceso de transcripción. Cabe destacar que cada tipo celular distinto en un organismo adquiere, a lo largo del desarrollo, un patrón de metilación característico, tejido-específico; en un proceso que se suele caracterizar por un incremento en metilación respecto al estado anterior más indiferenciado y acompañado de represión transcriptómica El proceso de reprogramación epigenética viene dado principalmente por dos genes clave en el proceso de especificación de la línea germinal (basado en el conocimiento obtenido del modelo murino), que son PRDM14 y PRDM1. Ambos en conjunto son los responsables de reprimir dos ADN metilasas, Dnmt3a y Dnmt3b, implicadas en la metilación de novo del ADN; junto con otro factor, Uhrf implicado en la maquinaria de mantenimiento de la metilación del ADN en la célula. Tras este proceso las PGCs se encuentran en un estado epigenético naïve (con la inmensa mayoría de las regiones de ADN susceptibles de ser metiladas, completamente desmetiladas), más una vez iniciado el proceso de gametogénesis el genoma de los gonocitos debe de ser metilado de novo para adquirir así el perfil de metilación sexo-específico característicos de los gametos maduros. En el sexo masculino, este proceso ocurre de forma temprana tras el borrado epigenético anterior (entre E14.5-E16.5) y continúa hasta los estadios de espermatogonia; por el contrario, en hembras el patrón de metilación específico se estable en el ovocito en crecimiento tras el nacimiento del individuo. El siguiente paso crucial en el desarrollo de la línea germinal es el proceso de meiosis y gametogénesis, procesos ambos que conducen hacia la formación de los gametos haploides y maduros capaces dar lugar a un nuevo individuo tras la fecundación. La meiosis es un proceso de división celular mediante el cual una célula diploide (2n2c cromosomas) experimenta dos divisiones sucesivas, una primera división meiótica reduccional (en la cual se generan dos células hijas haploides, 1n2c), y una segunda división meiótica ecuacional en la que dos células haploides se dividen para dar lugar a otras dos células haploides cada una, pero con una única cromátida por cromosoma (1n1c). Este proceso se lleva a cabo en el microambiente de la gónada femenina gracias a la secreción del ácido retinoico (AR) por el mesonefros que se inicia síncronamente con la migración de las PGCs hacia la gónada primitiva. El AR induce el proceso de meiosis promoviendo la expresión del gen Stra8; este proceso se detiene a día E13.5 en ratón y semana 12 en humanos y se continúa en la pubertad tras la activación del eje hipotálamo-hipofisario. En el microambiente testicular los gonocitos se dividen por mitosis hasta llegar al estado de pre-espermatogonia, cuando sufren un arresto en fase G0 del ciclo celular, en este caso el proceso de meiosis no se iniciará hasta la pubertad. Esto es debido a la acción de la proteína citocromo P450 CYP26B1, sintetizada por las células de Sertoli bajo el control del gen Sry, cuya función es inducir la degradación del ácido retinoico, evitando así la entrada en meiosis de los gonocitos en este ambiente gonadal XY, hasta que se alcance la pubertad dónde los cambios hormonales provocan la represión de CYP26B1 evitando así la metabolización del ácido retinoico por parte de las células de Sertoli. En resumen, en un ambiente gonadal masculino los gonocitos experimentan sucesivas rondas de mitosis aumentando exponencialmente el número de células progenitoras de gametos hasta alcanzar un punto en el detienen su ciclo celular. En este estado permanecen hasta que el individuo alcanza su madurez sexual durante la pubertad, caracterizada por la activación del eje hipotálamo-hipofisario-gonadal; momento en el cual las pre-espermatogonias retoman sus duplicaciones mediante mitosis y a la vez entran en meiosis para producir espermatozoides (gametos masculinos funcionales). En un ambiente gonadal femenino, por el contrario, la presencia de ácido retinoico permite a los gonocitos (que previamente habían experimentado varios procesos de duplicación por mitosis, durante la migración de las PGCs y al colonizar la gónada indiferenciada) entrar en meiosis, generando la reserva ovocitaria total del individuo. Al igual que en machos, estas células sufrirán un proceso de arresto, pero en este caso en meiosis I, que finalizará igualmente al llegar la pubertad, dónde los gradientes hormonales serán los responsables de reclutar una cohorte de ovocitos en cada ciclo para su maduración hacia gametos femeninos completamente funcionales. Las gónadas consisten en glándulas endocrinas encargadas de la producción de hormonas sexuales y de la maduración de las células sexuales o gametos. En la gónada madura la población de células de soporte establece una estrecha relación con las células germinales aportando el soporte físico y la secreción de importantes factores que desempeñan un rol clave en la supervivencia y maduración de los futuros gametos. Se genera así una estructura permisiva para la maduración de las células germinales tempranas, promoviendo la proliferación y meiosis de estas células y generando gametos haploides maduros y funcionales; este compartimento altamente especializado se conoce como nicho gonadal. Al comienzo del desarrollo embrionario el sistema reproductivo resulta indistinguible entre sexos, y se encuentra conformado por una gónada indiferenciada y dos conductos acompañantes, el Mülleriano y el de Wolff; el primero de ellos es el precursor del tracto reproductivo femenino (oviducto, útero y la parte superior de la vagina), mientras que el segundo dará lugar al tracto reproductivo masculino, (que incluye el epidídimo, el conducto deferente y las vesículas seminales). Las gónadas se forman como órganos bipotentes que pueden desarrollarse como testículos u ovarios dependiendo del sexo de las células somáticas e independientemente del contenido cromosómico (XX o XY) de las células germinales que las colonicen. Esta plasticidad de la gónada embrionaria de mamíferos está asociada con un estado de equilibrio transcripcional transitorio en el cual los genes relacionados con el destino masculino y femenino se expresan a niveles muy similares. La determinación del sexo ocurre entonces cuando este equilibrio se rompe hacia un lado u otro, esto ocurre cuando en las gónadas XY se comienza a expresar el gen Sry (localizado en el cromosoma Y), suceso que tiene lugar después del día E10.5 en ratón seguido inmediatamente de la expresión de Sox9 (gen dependiente de Sry) a día E11.2, y responsable del establecimiento del programa testicular. La expresión de Sox9 induce la diferenciación de las células de la gónada a diferenciarse hacia células de Sertoli, que reclutará células de su entorno para formar los llamados cordones testiculares, al tiempo que producen la hormona antimulleriana (AMH) responsable de la degeneración del conducto de Müller. Al parecer la gónada bipotente indiferenciada presenta una tendencia natural hacia el desarrollo del fenotipo femenino ante la ausencia de una señalización específica masculinizante; puesto que no existe ningún gen específico para la determinación del ovario como es el caso de Sry en la gónada masculina. El programa femenino comienza en ratón relativamente más tarde que su contraparte masculina, alrededor del día E11.4-11.6 vía activación de la expresión de WNT4/RSPO1 y FST (folistatina). Así como ocurría en el proceso de gametogénesis, durante la especificación gonadal, las células de soporte se comportan de forma diferente según se hable de la gónada masculina o femenina. En el testículo inmaduro los progenitores de las células de soporte comienzan a proliferar inmediatamente después de la activación de Sry; mientras que en el ovario estos progenitores entran en un estado quiescente alrededor del día E12.5 en ratón lo que podría ser explicado como un mecanismo de protección frente a un cambio en su destino. La mayor parte de los hitos alcanzados en este campo se han conseguido en el modelo murino. El primer trabajo acerca de derivación de células germinales in vitro se llevó a cabo a principios de los años 2000 y básicamente se reportaba una diferenciación espontánea de un cultivo de células madre embrionarias de ratón, en el que aparecían unas estructuras que se asemejaban a folículos conteniendo ovocitos, que además eran capaces de formar psuedo-blastocistos al ser activados partenogenéticamente. Los primeros ensayos acerca de generación de células germinales in vitro se basaban en protocolos de diferenciación a partir de cultivos de células embrionarias, al principio de forma espontánea y después forzando el proceso mediante la adición de citoquinas al medio. En la última década los protocolos de generación de células germinales in vitro se han optimizado enormemente, derivando en un proceso en varias en etapas, la primera de ellas sería inducir una población celular competente para responder a las señales que especifican la línea germinal, lo que en el modelo murino se conoce como células de tipo epiblasto (EpiLCs, del inglés epiblast-like cells). Sobre esta población se inducen las PGC-LCs que a su vez podrán ser maduradas hacia espermatozoides u ovocitos dependiendo de las condiciones usadas. En este punto la derivación ha sido abordada utilizando distintas estrategias como la adaptación de las condiciones de cultivo, mediante trasplantes in vivo, y mediante co-cultivo o agregación con células somáticas gonadales. En este último punto se ha alcanzado recientemente un hito puesto que se ha conseguido reproducir el ciclo completo de la línea germinal femenina in vitro en ratón; induciendo PGC-LCs a partir de ESC e iPSCs y generando ovarios reconstituidos in vitro mediante agregación de estas PGC-LCs con células somáticas aisladas de gónadas embrionarias que se cultivaron in vitro produciendo estructuras semejantes a folículos secundarios y ovocitos que pudieron ser fecundados y dieron lugar a descendencia sana y fértil. Una metodología similar se ha usado para reproducir la espermatogénesis in vitro, generando testículos artificiales que fueron capaces de madurar los progenitores germinales dando lugar a espermatozoides funcionales. Todos estos trabajos ponen de manifiesto la importancia del nicho para lograr gametos totalmente maduros y funcionales y de ahí el interés de producir una gónada artificial in vitro. Las aproximaciones que han mostrado mejores resultados implican el uso de células somáticas gonadales aisladas de embriones, sin embargo, esto implica un obstáculo para su futura aplicación clínica. Una alternativa interesante sería la de reproducir el nicho gonadal in vitro (células de Sertoli o granulosa) mediante reprogramación de otro tipo celular somático o a partir de células madre. ANTECEDENTES La derivación in vitro de células germinales a partir de células madre pluripotentes ha sido conseguida recientemente, así como la posibilidad de convertir directamente una línea somática específica en una completamente diferente mediante la sobreexpresión de factores clave. Resultados preliminares obtenidos en nuestro grupo de investigación mostraron que la combinación de seis factores específicos de la línea germinal era suficiente para reprogramar un cultivo de células somáticas humanas (46, XY) hacia células germinales-like inducidas (iGC-LCs). Estas células inducidas in vitro expresaban marcadores de espermatogénesis, entrada y progreso en meiosis y la capacidad de colonizar el nicho testicular después del xenotrasplante en ratón. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS Basándonos en este conocimiento previo, la tesis doctoral que se presenta a continuación se basa en la hipótesis de que es posible inducir células germinales in vitro a partir de fibroblastos específicos de cada paciente recapitulando las características fenotípicas, transcriptómicas y epigenéticas de las células germinales, así como su capacidad para llevar a cabo el proceso de meiosis y formar, por ende, células haploides. Así mismo, y puesto que el nicho es fundamental para el desarrollo de estas células hacia gametos completamente maduros se ha propuesto un modelo de cultivo de tejido gonadal in vitro que permita un incremento en la eficiencia de producción de gametos maduros. Para poder contrastar la hipótesis formulada, se diseñaron los siguientes objetivos: Objetivo general: Estudiar nuevos protocolos para la caracterización, mantenimiento y maduración de las células germinales inducidas in vitro (iGC-LCs) obtenidas por reprogramación directa de células somáticas. Objetivos específicos: 1. Completar la caracterización de las iGC-LCs a nivel fenotípico, transcriptómico y epigenético. 2. Evaluar mediante técnicas moleculares la capacidad de las iGC-LCs para formar células haploides. 3. Desarrollar un modelo de nicho gonadal in vitro para el mantenimiento de la viabilidad de las iGC-LCs. METODOLOGÍA Para llevar a cabo esta tesis se ha partido de vectores de expresión lentivirales que contenían la secuencia codificadora consenso (CCDS) de seis factores relacionados con la línea germinal (PRDM1, PRDM14, LIN28A, DAZL, VASA y SYCP3, referida a partir de aquí como i6F); los sobrenadantes virales obtenidos en la línea celular HEK 293T se utilizaron para la transducción lentiviral de un cultivo de fibroblastos neonatales humanos (46, XY), mientras que como control negativo se utilizaron los lentivirus vacíos (condición MOCK). Para la inducción de las células germinales se empleó un medio enriquecido con factores de crecimiento previamente empleados en el mantenimiento in vitro de células madre espermatogoniales e implicados de algún modo en el proceso de gametogénesis. El óctel empleado incluye, LIF, GDNF, Forskolin, bFGF, 2-mercaptoetanol, SCF y ácido retinoico. Tras un proceso de reprogramación de catorce días se observan cambios morfológicos en la condición i6F con la formación de pequeñas colonias de células redondas. Se aíslan tres poblaciones diferentes para su evaluación: MOCK control, la población total reprogramada con la condición i6F, y las colonias i6F reprogramadas y manualmente aisladas. Así mismo y según el experimento, se aislaron a partir de estas colonias células individuales para su análisis a nivel de ploidía, y una población 1N mediante tinción con ioduro de propidio y FACS. Para la caracterización de las iGC-LCs a nivel fenotípico se llevó a cabo un análisis inmunocitoquímico de marcadores específicamente relacionados con la línea germinal (Tabla 1). Para la caracterización transciptómica se analizaron los niveles de expresión de genes implicados en la línea germinal mediante RT-qPCR (Tabla 2). La confirmación del borrado epigenético se llevó a cabo utilizando tres técnicas complementarias basadas en distintos principios, la detección inmunocitoquímica de los marcadores de metilación 5mC y 5hmC, los arrays de metilación y la conversión-secuenciación por bisulfito (Tabla 3). Para el análisis de generación de células haploides se emplearon dos aproximaciones moleculares de análisis de célula única, PCR para del gen de la AMELOGENINA y array de hibridación genómica comparada (aCGH). El modelo in vitro de nicho gonadal de explantes de tejido testicular tanto murino como humano, se abordó mediante el cultivo y mantenimiento de estos tejidos en medio basal alpha-MEM suplementado con KOSR o AlbuMAX. Las piezas tisulares se cultivaron sobre bloques de agarosa embebidas en este medio, creando así una interfase líquido-gas para la mejora de la supervivencia del cultivo de tejidos. Tras el tiempo de cultivo determinado en cada diseño experimental, las piezas de biopsia testicular se analizaron a nivel morfológico de visu, mediante histología con tinción hematoxilina-eosina, y a nivel transcriptómico mediante RT-qPCR para genes relacionados con la línea somática, pluripotencia y estadíos tempranos y tardíos de la línea germinal (Tabla 4). RESULTADOS Y DISCUSIÓN Los resultados obtenidos en este proyecto de tesis valida el protocolo de reprogramación directa de células somáticas mediante el uso de 6 factores relacionados con la línea germinal (i6F) para la obtención de células iGC-LCs con fenotipo germinal in vitro. Estas células se caracterizan por formar colonias de células redondas en cultivo (Figura 17), que expresan marcadores de células primordiales germinales tempranas, tales como CDH1, SOX17, TFCP2L1 y Brachyury (Figura 21). Así mismo, la co-localización de los marcadores espermatogénicos UTF1, PLZF, VASA, DAZL y HIWI, lo que refuerza la existencia de una población pre-meiótica en las colonias de iGC-LCs (Figura 20). La presencia de células germinales en diferentes estados de diferenciación puede ser debida a la aleatoridad de la internalización de las particulares lentivirales portadoras de los distintos factores de reprogramación durante el proceso de transducción, y la sobreexpresión simultanea de factores relacionados con estadíos diferentes en el desarrollo de la línea germinal; así como, la introducción a tiempo inicial del ácido retinoico en el medio de cultivo, que está forzando a las células hacia la entrada en meiosis. Las iGC-LCs derivadas in vitro mostraron una correcta reprogramación epigenética propia del proceso de especificación de la línea germinal en mamíferos. Este hecho se pone de manifiesto por los cambios en el porcentaje de metilación de las regiones diferencialmente metiladas (DMRs) estudiadas (H19, SNRPN, PEG3 y KvDMR1); que adoptan un perfil correspondiente al de un gameto femenino (Figura 23). Este proceso de reprogramación epigenética viene acompañado de un borrado general de la metilación representado por la hidroxilación del grupo metilo en posición 5 de algunas citosinas. El paso de 5mC a 5hmC es por tanto un indicio del proceso de borrado epigenético. El estudio de estas marcas epigenéticas se ha llevado a cabo mediante inmunocitoquímica (Figura 24). Finalmente, para completar la caracterización de las células iGC-LCs, se obtuvieron células individuales manualmente aisladas de las colonias de iGC-LCs, y se evaluó la presencia de células haploides mediante dos técnicas moleculares distintas. La primera técnica consistió en la evaluación del gen de la AMELOGENINA, un gen asociado a los cromosomas sexuales que difiere en tamaño entre el cromosoma X e Y, de modo que según el tamaño de banda obtenido en la PCR se puede deducir si la célula analizada presenta un cromosoma X, un cromosoma Y, o ambos cromosomas sexuales XY al igual que las células somáticas usadas para la reprogramación (Figura 25). Finalmente, se utilizó una técnica de diagnóstico genético preimplantacional (aCGH) para la evaluación del contenido cromosómico total en células individuales iGC-LCs. El array de CGH ofrece una herramienta de análisis de la ploidía mucho más exhaustiva puesto que presenta la capacidad de analizar todo el conjunto de cromosomas de una sola vez (Figura 26). A pesar de la baja eficiencia del proceso, ambas técnicas indican que hay una media de 1-3% de células haploides en las colonias generadas por reprogramación in vitro. Finalmente, y dada la importancia del nicho para el correcto desarrollo y maduración de las células germinales se ha propuesto un modelo in vitro para el mantenimiento de este microambiente con el fin de emplearlo para generar gametos funcionales a partir de los progenitores germinales previamente inducidos in vitro. Se mantuvo el tejido cultivado in vitro hasta 4 semanas en el caso del modelo murino, con una morfología normal en base a la estructura de los túbulos seminíferos (Figuras 27 y 32). Sin embargo, ninguna de las condiciones testadas fue capaz de iniciar el proceso de espermatogénesis in vitro. El cultivo de muestras humanas mostró una mayor dificultad a la hora de mantener su viabilidad a largo plazo (Figura 38), aunque sí es posible el mantenimiento de la población indiferenciada de la línea germinal. CONCLUSIONES 1. La reprogramación directa de células somáticas mediante expresión ectópica de seis factores transcripcionales relacionados con la línea germinal (PRDM1, PRDM14, LIN28A, DAZL, VASA y SYCP3) resulta en la formación de colonias de células germinales inducidas (iGC-LCs) que muestran características morfológicas y fenotípicas propias de células germinales. 2. Las colonias de iGC-LCs generadas in vitro están compuestas de un conjunto heterogéneo de poblaciones celulares germinales en distintos estadios de diferenciación que expresan genes de especificación germinal tempranos, pre-meióticos y post-meióticos, tal y como muestra la expresión de estos marcadores analizada mediante RT-qPCR. 3. Las iGC-LCs son capaces de iniciar y completar el proceso de meiosis y producir células haploides, tal y como sugieren los resultados del análisis molecular mediante PCR de AMELOGENINA y array de hibridación genética compada (aCGH), sobre célula única. El aCGH, técnica molecular que permite el análisis de la totalidad de los cromosomas, mostró una eficiencia de generación de células haploides entre 1-2% de la población de iGC-LCs. 4. El análisis epigenético de células haploides (post-meióticas) aisladas de las colonias de iGC-LCs mostró una pérdida de metilación en las regiones diferencialmente metiladas (DMRs) de impronta paterna y un aumento en los DMRs maternos, que correlaciona con un fenotipo ovocitario. 5. El cultivo en interfase gas-líquido de tejido testicular de ratones neonatos demostró la capacidad para mantener la estructura del tejido in vitro, así como el mantenimiento de la población germinal endógena, pero no su progreso hacia gametos maduros, tal y como muestran los resultados de expresión génica de marcadores de pluripotencia, germinales, post-meióticos y somáticos. 6. El mantenimiento de tejido testicular humano para la maduración de células germinales primordiales no es viable a largo plazo en las condiciones testadas. La adición de ciertos factores de crecimiento y hormonas podría contribuir a una mejor simulación del nicho gonadal que permitiera la maduración de progenitores germinales obtenidos in vitro y su progresión en meiosis para producir gametos artificiales funcionales. 7. Este estudio demuestra que se pueden generar iGC-LCs in vitro, aunque con baja eficiencia; así mismo, se requiere más conocimiento sobre la generación de un nicho gonadal in vitro capaz de acoger y colaborar en la maduración de estas células para mejorar la eficiencia de generación de gametos artificiales funcionales.En las instrucciones comenta que sólo es necesario en caso de que la tesis esté escrita en otro idioma distinto del inglés. Si debo adjuntarlo por favor, háganmelo saber.