Antibiotic resistant bacteria, such as vancomycin-resistant Enterococcus (VRE) are an increasing problem in hospitalized patients and commonly cause infections following antibiotic therapy. Infections with VRE generally begin by colonization of the intestinal tract. In normal conditions, our gut is colonized by hundreds of commensal bacterial species, the microbiota, that suppress intestinal colonization by VRE, a phenomenon known as “colonization resistance” (CR). However, administration of antibiotics alters the composition of the microbiota, which allows VRE to densely colonize the intestine and subsequently disseminate to the bloodstream where it can put in serious danger the life of the patient. Thus, understanding how and which members of the microbiota confer CR and how antibiotics promote intestinal colonization by VRE, is crucial if we want to prevent VRE infections. Unfortunately, the absence of techniques to study complex bacterial populations has hampered, until the last recent years, the research in this clinically relevant field. For this reason, it is not completely understood how antibiotics change the microbiota and promote infections by VRE, which are the members of the microbiota that are key for conferring colonization resistance against VRE and the mechanisms by which they confer protection. Thus in this thesis, the main objectives proposed are (i) to understand how antibiotics change the composition of the microbiota and subsequently promote intestinal colonization by VRE, (ii) identify commensal bacterial species that are key for conferring protection and (iii) study mechanisms by which these commensal bacteria may confer protection against VRE. We first studied the effect of oral vancomycin treatment on the human gut microbiota through 16s rRNA high-throughput sequencing. This antibiotic is frequently given to patients to treat Clostridium difficile infections and subsequently can promote secondary infections by VRE. Our analysis showed that vancomycin promotes drastic changes on the composition of the microbiota, including the depletion of all bacterial species from the phylum Bacteroidetes, one of the most prevalent phyla inhabiting in the human intestinal tract. Moreover, our analysis indicates that the microbiota never recovers its baseline state, even after 22 weeks post-antibiotic cessation. Importantly, the microbiota recovery rate was different depending on the subject analyzed. While some patients recovered most of their baseline bacterial species, up to 89% of their baseline bacterial species were not recovered in other patients. Moreover, using a mouse model we were able to demonstrate that the microbiota recovery rate upon vancomycin treatment was clinically relevant since a lower microbiota recovery upon vancomycin cessation is associated with an increased susceptibility to VRE intestinal colonization. Subsequently, using the same VRE infection mouse model, we analyzed the impact of other antibiotics of different spectrum (ciprofloxacin, neomycin, ceftriaxone, ampicillin, clindamycin, besides vancomycin) on the gut microbiota composition and on the VRE colonization capacity, both during the treatment and two weeks after antibiotic cessation. Our analysis shown, as expected, that different antibiotics promoted different changes in the composition of the microbiota, being vancomycin and clindamycin those that promoted a higher number of changes, while neomycin or ciprofloxacin had a minor effect on the microbiota composition. The changes in the composition of the microbiota were associated with the capacity of VRE to colonize the intestinal tract since those antibiotics that promote more alterations on the microbiota allowed a higher level of VRE intestinal colonization. Subsequently, applying correlation analysis and Linear Discriminatory analysis, we were able to identify several bacterial taxa that are associated with VRE resistance. These taxa include the genera Alistipes, Barnesiella, Oscillibacter and some members of the families Lachnospiraceae and Ruminococcaceae. We next isolated and administered these bacteria to vancomycin-treated mice to test their capability to restore colonization resistance. We demonstrated that the administration of a combination of 4 bacterial isolates to mice (Alistipes, Barnesiella, Oscillibacter and a bacterium from Ruminococcaceae family) drastically diminished the capacity of VRE to colonize the intestinal tract of antibiotic-treated mice. We next performed metatranscriptomic and metabolomic analysis to identify in vivo functions expressed and metabolites produced by the identified protective commensal bacteria in order to determine possible mechanisms by which these bacteria could be suppressing VRE intestinal colonization (e.g. production of inhibitory molecules, competition for nutrients). In addition, we also analyzed the in vivo transcriptome of VRE to determine the functions express by this pathogen to colonize the intestinal tract, and we performed nutrient arrays to identify nutrients that the pathogen could be using for its growth in the intestinal tract. The analysis performed determined that (i) oral inoculation of mice with the protective bacterial mixture restores the expression of genes encoding for transporters that internalize saccharides (cellobiose, N-acetyl-galactosamine, N-acetyl-glucosamine) and amino acids (serine), whose expression was diminished upon antibiotic treatment. (ii) Increased expression of these genes was associated with diminished intestinal availability of several nutrients including saccharides (i.e. cellobiose) and amino acids (i.e. serine, proline, leucine and threonine). (iii) Some of the nutrients consumed upon administration of the protective commensal bacteria may be crucial for VRE growth in the intestinal tract. Indeed, analysis of the VRE transcriptome in colonized mice revealed that VRE highly express in vivo transporters for the internalization of saccharides (i.e. cellobiose, N-acetyl-galactosamine, N-acetyl-glucosamine) and several branched-chain aminoacids (i.e. proline). Moreover, out of 190 carbon sources tested, the saccharides cellobiose, N-acetyl-glucosamine and N-acetyl-galactosamine are among the 10 carbon sources that promote the highest VRE growth under anaerobic conditions. Thus, although additional experiments should be performed for validation, our results support a model in which the administered protective bacteria decrease the intestinal levels of nutrients that can be utilized by VRE for growth, which reduces the capacity of this pathogen to colonize the intestinal tract.Resumen de la Tesis : “Role of the microbiota in the defense against infections by Enterococci” Introducción El tracto gastrointestinal está colonizado por centenares de especies de bacterias comensales. Se ha visto en los últimos años que dichas bacterias presentan un papel crucial en la prevención y resolución de enfermedades infecciosas. La microbiota comensal inhibe a patógenos oportunistas mediante mecanismos (i) de interacción directa, por producción de sustancias inhibitorias o competición por nutrientes (ii) indirectos, por la inducción del sistema inmune. El tratamiento con antibióticos altera la composición de la microbiota intestinal promoviendo la colonización intestinal por patógenos oportunistas (Buffie et al., 2012)⁠. Dicha situación es preocupante especialmente en el ámbito hospitalario debido al conjunto de (I) un uso intensivo de los antibióticos, (II) una alta concentración de patógenos multi-resistentes, (III) la presencia de pacientes especialmente susceptibles por su situación fisiológica (catéteres) y baja inmunidad (Arias & Murray, 2012)⁠. Por ello, se registran un gran número de enfermedades nosocomiales, especialmente complicadas de tratar por el carácter multi-resistente de las cepas colonizadoras. Entre ellas, Enterococcus faecium Vancomicina Resistente (EVR) es importante porque su prevalencia ha aumentado de 6.2% en 2011 a 7.9% en 2014 en Europa y es resistente a la mayoría de los antibióticos disponibles (Ecdc, 2015)⁠. Objetivos En la primera parte del presente trabajo, hemos investigado la relación entre el tratamiento antibiótico y la alteración de la microbiota intestinal. Los objetivos de esta primera parte son: (I) entender las alteraciones en la microbiota asociadas con el tratamiento por vancomicina tanto en pacientes como en el modelo de ratón. Vancomicina es uno de los antibióticos relacionados con la colonización intestinal y con septicemias por EVR, por ello quisimos evaluar la influencia de las alteraciones producidas en la microbiota por este antibiótico con la capacidad de colonización de EVR. (II) Estudiar la influencia de otros antibióticos de diferente espectro anti-bacteriano al de vancomicina sobre la microbiota intestinal así como la capacidad de recuperación de la misma tras el cese de tratamiento antibiótico utilizando un modelo de ratón Conociendo el efecto de diferentes antibióticos sobre la microbiota, nos centramos en la relación entre alteraciones de la microbiota y la capacidad de colonizar de EVR. En este caso nos planteamos: (III) relacionar las alteraciones de la microbiota provocadas por diferentes antibióticos con la pérdida de resistencia a la colonización por EVR, (IV) identificar bacterias comensales de la microbiota intestinal que protegen frente a la colonización intestinal por el EVR, (V) restaurar la resistencia frente a la colonización mediante la administración de dichas bacterias, (VI) identificar mecanismos por los cuales estas cepas bacterianas comensales protegen frente a EVR. Metodología Estudio de los cambios producidos por vancomicina en la microbiota intestinal de pacientes. Para cumplir el primer objetivo, hemos analizado los datos de la microbiota fecal de un estudio clínico realizado en pacientes con artritis reumatoide (AR) (Scher et al., 2013)⁠. El propósito del estudio era evaluar la posible acción benéfica de la vancomicina sobre AR mediante la disminución de bacterias pro-inflamatorias, sensibles a dicho antibiótico. Para ello, un grupo de pacientes con AR nuevamente diagnosticada se reclutaron y recibieron vancomicina vía oral durante dos semanas (250 mg cuatro veces al día) seguido de metotrexato (tratamiento para la AR). Como control, un grupo de pacientes solamente recibió metotrexato. Entre los criterios de inclusión, los pacientes no debían haber recibido tratamiento antibiótico en los últimos tres meses. Por tanto, este estudio nos permitió evaluar los cambios de la microbiota asociados al tratamiento por vancomicina sin previo tratamiento antibiótico (lo cuál aun no se había descrito en comparación con otros estudios donde los pacientes evaluados, además de recibir vancomicina habían recibido otros antibióticos). Se recolectaron muestras fecales antes del tratamiento, al finalizar el tratamiento con vancomicina y a las 2, 6, 14 y 22 semanas tras finalizar el tratamiento. Se extrajo el ADN bacteriano de estas muestras y se determinó su composición microbiana mediante secuención masiva de la región V2-V3 del 16s rRNA, un gen presente en todas las bacterianas que permite clasificarlas taxonómicamente. Se evaluó la diversidad bacteriana en las muestras según el tratamiento recibido así como su recuperación tras el cese del tratamiento. Para ello se utilizó la distancia de disimilitud de la microbiota (Unweighted Unifrac distance), se calcularon el número de OTUs (unidad taxonómica operacional, similar al nivel de filogenético de especie), el indice de filodiversidad y el indice de Shannon. Por otro lado se identificaron las abundancias relativas a nivel de filo, género y OTUs para cada una de las muestras. Con el fin de analizar cambios en cada uno de los parámetros analizados, se utilizó el test no-paramétrico de wilcoxon y se comparó cada uno de los tiempos post-tratamiento con el tiempo pre-tratamiento. Estos análisis nos indicaron las alteraciones en la microbiota que ocurrieron en la mayoría de los pacientes. Por otro lado, evaluamos también las alteraciones en la microbiota a nivel individual para cada uno de los sujetos, calculando que porcentaje de las OTUs presentes antes del tratamiento que se recuperaban tras el cese del tratamiento antibiótico. Así, hemos demostrado que la la tasa de recuperación de la microbiota después de la retirada del tratamiento era muy variable entre sujetos. Mientras que algunos pacientes llegaban a recuperar la mayor parte de su microbiota, otros no llegaban a recuperar el 89\% de las bacterias más abundantes de su microbiota, incluso 22 semanas tras parar el tratamiento antibiótico. Estudio del efecto de los cambios producidos en la microbiota tras el tratamiento con vancomicina en la capacidad de colonización de EVR Como a nivel clínico un porcentaje de los pacientes tratados con vancomicina son colonizados por patógenos, a nivel intestinal, después de la finalización del tratamiento con vancomicina, decidimos evaluar si la diferencia observada en la recuperación de la microbiota podría influenciar la capacidad de colonización intestinal por el patógeno EVR. Para ello, hemos desarrollado un modelo de infección por EVR en ratones tratados con vancomicina. Los experimentos con ratones fueron llevado a cabo en el “Servei Central de Suport a la Investigació Experimental” de la Universidad de Valencia, utilizando hembras de 7 semanas C57BL/6J compradas a la compañía Charles River laboratories. Se trataron los ratones con vancomicina (en el agua de bebida, 0.5g/l) durante una semana, se cogió una muestra fecal para analizar la composición de la microbiota, posteriormente se infectaron oralmente con 10E6 UFCs/200 ul de EVR y se evaluaron los niveles de colonización intestinal a los dos días post-infección. Por otro lado, para otro grupo de ratones, se dejó un periodo de recuperación de dos semanas entre el final del tratamiento y la toma de muestra y infección. Para evaluar la colonización intestinal por EVR a los dos días de la infección, se plaquearón varias diluciones de una muestra fecal en medio BEA agar complementado con vancomicina y ampicilina. En nuestro modelo de tratamiento oral con vancomicina en ratones, se inducen cambios drásticos y consistentes en la microbiota intestinal, tál y como se observó en humanos. Utilizando un número de muestras elevado, se observó también una variabilidad inter-individual que nos permitió evaluar la relación entre tasa de recuperación de la microbiota después de finalizar el tratamiento y capacidad de colonización por EVR. Gracias a este modelo, hemos podido demostrar que la diferencia en la tasa de recuperación de la microbiota después de finalizar el tratamiento es clinicamente relevante ya que una recuperación de la microbiota menor en ratón se correlaciona con una capacidad de colonización por EVR significativamente más alta. Estudio de las alteraciones de la microbiota provocadas por el tratamiento con antibióticos de distinto espectro y de su efecto en la capacidad de colonización de EVR Posteriormente, hemos utilizado este modelo de infección en ratones para investigar el impacto de antibióticos de varios espectros en la microbiota intestinal y relacionar esas alteraciones con la capacidad de EVR de colonizar el intestino. Además, estos datos nos permitieron identificar bacterias comensales de la microbiota capaces de proteger frente a la colonización por EVR. Para ello, hemos tratado los ratones con antibióticos de distinto espectro (ciprofloxacina, neomicina, ceftriaxona, ampicilina, clindamicina y vancomicina), lo cual nos permitió conseguir diferentes tipos de disbiosis (alteración de la microbiota). Posteriormente, hemos infectado vía oral con EVR a los ratones tratados. Los niveles de EVR excretados en heces fueron determinados por recuento de colonias en medio específico y se analizó la composición de la microbiota de los ratones gracias a la secuenciación masiva del gen 16s rRNA. En este caso también, se infectaron ratones durante el tratamiento o después de dos semanas de recuperación. Para cuantificar las alteraciones asociados a diferentes tratamientos antibióticos, hemos evaluado la perdida de biodiversidad (número de OTUs, Shannon) y de biomasa (ng ADN/g heces), una aproximación de la carga bacteriana total. Se observó una disminución de la biomasa y del indice de Shannon después de todos los tratamientos excepto ciprofloxacina. Las alteraciones más drásticas fueron asociadas al tratamiento con clindamicina y vancomicina. Por otro lado, también hemos evaluado cuanto diferentes eran las microbiota resultantes tras la administración de los diferentes antibióticos mediante NMDS (Non-metric Multi-Dimensional Scaling) y determinado los taxa significativamente alterados (a nivel de phylum y genus). Además, hemos evaluado la perdida de diversidad intra-filo e intra-género, lo que nos ha permitido determinar que durante el tratamiento con clindamicina, apenas 5 OTUs consituyen el 97\% de la microbiota total. Realizando los mismos análisis sobre las muestras obtenidas después de dos semanas de recuperación, se observó una recuperación de la microbiota en la mayoría de los casos y el establecimiento de un estado de microbiota alternativo en el caso de los ratones tratados con ceftriaxona y clindamicina. Posteriormente, el análisis conjunto de las alteraciones producidas por los distintos antibióticos con los niveles de EVR permitieron identificar aquellas bacterias comensales intestinales que se asocian a la resistencia frente a la infección (su eliminación por determinados antibióticos se asocia a un incremento de los niveles intestinales de EVR). Para ello, se realizó una correlación de spearman y se seleccionaron las bacterias por las cuales obtuvimos una correlación negativa entre su abundancia y los niveles de EVR detectados en heces a los dos días de la infección ( p-valor ajustado <0.05). Como segundo criterio, las bacterias tenían que estar presente en todos los ratones no tratados. De este modo, evitamos seleccionar bacterias no detectadas normalmente en la microbiota de los ratones pero que hubieran expandido en los tratamientos que promueven bajos niveles de colonización intestinal por EVR y nos aseguramos la posibilidad de aislar las bacterias seleccionadas para testar su capacidad protectora . Se confirmaron los resultados mediante un LDA (“linear discriminant analysis”), el cual está menos influenciado por valores extremos. De este modo, se determinó que la presencia de los géneros bacterianos Alistipes, Allobaculum, Barnesiella, Oscillibacter y de miembros no identificados de las familias Lachospiraceae, Porphyromonadaceae y Ruminococacceae se asocian a la resistencia frente a la colonización por EVR. Por otra parte, se detectó que los géneros bacterianos Escherichia/Shigella, Enterococcus, Akkermansia, Parasutterella, Lactobacillus y miembros no identificados de las familias Enterobacteriaceae, Burkholderiales y Desulfovibrionaceae se asocian positivamente con la colonización por EVR. Aislamiento de bacterias comensales de interés Para testar la capacidad protectora de las bacterias asociadas a la resistencia frente a la colonización por EVR, fue necesario aislarlas desde la flora intestinal de ratones no tratados. Para ello, se han estudiado los medios y las condiciones adecuadas para su crecimiento y aislamiento. Concretamente, se crecieron muestras cecales en varios medios de cultivos, se recogieron las comunidades bacterianas crecidas y se secuenció el gen 16s rRNA por secuenciación masiva mediante Miseq Illumina para determinar que bacterias eran capaces de crecer en cada condición. Se determinó el indice de Shannon para averiguar que medio presentaba la mayor diversidad bacteriana al mismo tiempo que se identificaron cada una de los taxones presentes en cada medio. Todas las bacterias de interés crecían en el medio “Columbia Blood Agar” incubado a 37ºC en condiciones anaérobicas por lo que utilizamos este medio para aislar las bacterias de interés. Posteriormente, una vez seleccionado el mejor medio para aislar las bacterias de interés, crecimos una muestra cecal en el medio “Columbia Blood Agar” en una dilución adecuada para obtener colonias individuales. Las colonias crecidas se aislaron y se identificaron mediante secuenciación del gen 16s rRNA por la metodología de Sanger. Esta aproximación nos permitió aislar la mayoría de los taxones de interés excepto Oscillibacter, que presentaba una abundancia relativa inferior a 0.01\% en las condiciones de cultivo utilizadas. En este caso, se diseñaron una par de cebadores específicos de la familia Ruminococcaceae (a la cual pertenece el género Oscillibacter) para poder determinar directamente por PCR (sin necesidad de secuenciar el gen 16s rRNA) si la bacteria crecida era este taxón o no. Finalmente, fuimos capaces de conseguir aislados de las diferentes bacterias de interés, incluyendo Oscillibacter. Estudio de la capacidad protectora frente a la colonización por EVR de las bacterias comensales aisladas Posteriormente, la capacidad protectora de las bacterias aisladas fue testada en un modelo de ratones tratados con vancomicina. Se trataron los ratones una semana con vancomicina, se les administró una mezcla de las bacterias de las cuales queríamos testar la capacidad protectora los tres días siguientes a la finalización del tratamiento. Dos semanas tras parar el tratamiento antibiótico, se recogió una muestra fecal que nos permitió verificar mediante secuenciación masiva del gen 16s rRNA si dichas bacterias habían colonizado los ratones. Tras la recogida de dicha muestra, los ratones se infectaron vía oral con EVR. Los niveles de colonización intestinal por EVR se determinaron mediante plaqueo de muestras fecales a los dos días tras la infección, como en los previos experimentos ya descritos. Como grupo control, se infectó un grupo de ratones tratados con vancomicina que no recibió la mezcla de bacterias protectoras. En este modelo de ratones tratados con vancomicina se administraron Alistipes, Allobaculum, Barnesiella, Oscillibacter y miembros no identificados de las familia Ruminococacceae. No se administraron bacterias de la familia Lachnospiraceae (también asociadas con la resistencia frente a EVR, porque de manera habitual el ratón recupera estás bacterias tras el tratamiento con vancomicina mientras que no recupera las bacterias que si se administraron). Mediante este modelo, se obtuvo una disminución de más de 100 veces en la capacidad de EVR de colonizar el intestino, en el grupo que recibió las bacterias comensales en comparación con el grupo de ratones que no las recibió. Como control del experimento, administramos la bacteria Klebsiella pneumoniae, no asociada con la resistencia a la colonización por EVR. Como cabía esperar, la administración de dicha bacteria no confirió protección. Posteriormente, verificamos que la biomasa (aproximación de la abundancia bacteriana) de los ratones tratados con vancomicina no estaba disminuida con respecto a los ratones no tratados, indicando que probablemente el mecanismo por el cual las bacterias comensales suministradas protegían frente a EVR no se trataba de un mecanismo de inhibición inespecífico debido a la ocupación de un nicho vacío. Antes de averiguar el mecanismo de protección frente a la infección por EVR, intentamos simplificar la mezcla de bacterias administrada. Para ello, se utilizó el modelo descrito para probar la actividad protectora de la mezcla de bacterias, administrando las bacterias individualmente. Ninguna bacteria administrada por si misma consiguió una disminución de la colonización por EVR igual a la obtenida tras la administración de la mezcla completa, aunque varias de las bacterias administradas si que disminuyeron la capacidad de colonización por EVR pero en menor medida. Posteriormente, se administró la mezcla de bacterias, eliminando Oscillibacter de la misma (individualmente no producía ningún tipo de disminución de la colonización por EVR) ó Allobaculum (los análisis por LDA no lo habían identificado como una de las bacterias más relevantes dentro de las asociadas con la resistencia frente a EVR). Como resultado, decidimos administrar una nueva mezcla de bacterias que contenía Alistipes, Barnesiella, Oscillibacter y un aislado no identificado de las familia Ruminococacceae. Estudio del mecanismo de protección por el cual las bacterias comensales identificadas protegen frente a EVR. Posteriormente, para averiguar el mecanismo de protección frente a la infección por EVR, nos hemos centrado en dos enfoques complementarios, (i) la determinación de las alteraciones a nivel intestinal, entre otros el cambio en la disponibilidad de los diferentes nutrientes, asociados con la administración de la mezcla de bacterias y (ii) la caracterización de los requerimientos genéticos y nutricionales de EVR para colonizar el intestino y crecer. (i) Para determinar como nuestros probióticos influencian la colonización por EVR, nos hemos centrado en mecanismos de interacción directa (competición por nutrientes, producción de sustancias inhibitorias). No hemos estudiado mecanismos de acción indirecta (inducción de la respuesta inmune) ya que en un estudio anterior se describió que la microbiota es capaz de eliminar EVR en ausencia de componentes fundamentales del sistema inmune (Ubeda et al., 2013)⁠. Hemos decidido investigar la actividad de los probióticos mediante técnicas ómicas que nos permiten apreciar tanto la producción de substancia inhibitorias como mecanismos de competición nutricional. Para conseguir las muestras necesarias para dicho estudio, hemos tratados ratones con vancomicina durante una semana y posteriormente los ratones alojados de dos en dos en jaulas, recibieron las bacterias protectoras o PBS (Tampón fosfato salino). Dos semanas después de finalizar el tratamiento, se separaron los ratones y uno fue sacrificado para conseguir el contenido del ciegomientras que el otro ratón fue infectado con EVR para determinar los niveles de colonización intestinal. Ratones que se encuentran en la misma jaula recuperan una microbiota muy similar tras el cese del tratamiento antibiótico por lo que el ratón infectado con EVR nos indicaba si esa microbiota protege o no frente a la infección, mientras que el otro ratón de la misma jaula nos aporta las muestras necesarias para los estudios ómicos. Posteriormente, se realizó un análisis meta-transcriptómico sobre las muestras de estos ratones tratados que recibieron la mezcla de bacterias protectoras o no, así como de ratones no tratados, con el fin de determinar que funciones bacterianas se recuperaban gracias a la administración de las bacterias protectoras. 28 KOs (Kegg Orthology, ORFs anotados con la base de datos KEGG) no se detectaron después del tratamiento con vancomicina pero estaban expresados en el grupo de ratones que recibió la mezcla de bacterias protectoras y en los ratones no tratados. Estos KO codifican entre otros para transportadores que permiten la internalización de azucares (transportadores lactosa/L-arabinosa; para la celobiosa, el myo-inositol, la N-acetil-galactosamina y el D-glucosaminato), así como su metabolización (restauración del la vía de las pentosas fosfatos). Se detectó también el incremento de un receptor sensitivo a la serina así como KOs correspondientes a pasos de la síntesis de la histidina y de la lisina. Para averiguar si estas diferencias en expresión génica entre el grupo de ratones que recibió las bacterias intestinales o no se reflejaban en cambios en la concentración de los diferentes metabolitos, hemos analizado el metaboloma intestinal de las muestras anteriores. Este análisis se hizó en colaboración con el centro de investigación Príncipe Felipe (CIPF) mediante estudio de resonancia magnética nuclear (RMN). Gracias a este estudio, hemos confirmado que (i) la disponibilidad intestinal en azucares es baja en ratones no tratados (ii) dicha disponibilidad aumenta drásticamente después del tratamiento con vancomicina (iii) la administración de nuestras bacterias protectoras disminuye la disponibilidad intestinal de azucares después del tratamiento. Concretamente, hemos podido demostrar estas conclusiones para la celobiosa (un azúcar de la dieta). Además, se ha constatado que las bacterias protectoras modifican el metaboloma intestinal incrementando algunos metabolitos que se han asociado con la interferencia frente a la colonización intestinal por patógenos (i.e. ácidos grasos de cadena corta, fenol). Por otra parte, se detectó una alteración importante de las concentraciones de varios aminoácidos. Entre ellos destacamos un aumento de la concentración de serina durante el tratamiento y su disminución en el grupo de ratones que recibió las bacterias protectoras. Estos resultados sugieren que las bacterias administradas podrían estar compitiendo con EVR para el consumo de diferentes azucares y posiblemente de algunos amino ácidos. Además, el incremento en ácidos grasos de cadena corta y fenol podría participar en la resistencia a la colonización por EVR inhibiendo su crecimiento. Por otro lado, averiguamos los requerimientos nutricionales de EVR.Con este fin, hemos identificado los genes expresados por EVR in vivo. En primer lugar hemos secuenciado el genoma de EVR. En segundo lugar, utilizando secuenciación masiva, hemos obtenido el transcriptoma de EVR in vivo en ratones tratados con antibióticos y colonizados por EVR. Se secuenció el meta-transcriptoma completo de la muestra y posteriormente se mapearon las secuencias obtenidas contra el genoma de EVR. Así, se determinó el transcriptoma de EVR in vivo en presencia de la microbiota intestinal. Los resultados obtenidos indican que unos de los genes altamente expresados in vivo por EVR corresponden a transportadores de N-acetil-galactosamina y celobiosa, justo los azúcares que podrían estar siendo utilizados por las bacterias comensales, como indicaron nuestros estudios metabolómicos y metatranscriptómicos.Por otra parte, EVR expresaba transportadores para la internalización de varios amino ácidos (i.e un transportador para la internalización de glicina betaina/prolina, arginina/ornitina y aminoácidos ramificados). Posteriormente, para determinar que relevancia tiene la disponibilidad de diferentes fuentes de carbono para el crecimiento de EVR, hemos realizado un “array” de nutrientes (metodología Biolog). Básicamente, un “array” consiste en una placa de 96 pocillos con una única fuente de carbono por cada pocillo. Se inocula el “array” con EVR en un medio que contenga los nutrientes necesarios a su crecimiento excepto el carbono. Posteriormente, midiendo el crecimiento de EVR en cada pocillo, se puede determinar que fuentes de carbono la bacteria testada utiliza y con que eficacia. Hemos puesto a punto la metodología necesaria con el fin de poder realizar dichos “arrays” en las condiciones anaeróbicas que se encontrarían en el intestino (aplicación de un aceite en la superficie del pocillo del “array” con el fin de impedir la entrada de oxígeno). Los resultados obtenidos del “array” de nutrientes indican que el crecimiento de EVR está influenciado por el tipo de fuente de carbono disponible. Cabe destacar que unos de los azúcares que permiten un mayor crecimiento de EVR son la N-acetilgalactosa y la celobiosa, los azúcares que podrían estar siendo secuestrados tras la administración de las bacterias protectoras identificadas. Curiosamente, EVR es capaz de crecer utilizando a la serina como única fuente de carbono. El conjunto de nuestros resultados sugiere la hipótesis de una competición nutricional para la celobiosa y la N-acetilgalactosa como mecanismo de protección frente a la colonización intestinal por EVR. Se ha visto que EVR utiliza muy eficientemente estos dos azucares in vitro y que expresa los transportadores para su utilización in vivo. Por otra parte, la administración de las bacterias protectoras disminuye la disponibilidad de azucares in vivo, entre los cuales se pudo identificar la celobiosa. Además, se vio un incremento de transportadores para el consumo tanto de celobiosa como de N-acetilgalactosa en el grupo de ratones que recibió las bacterias protectoras. Además, se ha visto que EVR puede utilizar la serina como fuente de carbono y que las concentraciones de este aminoácido están incrementadas después del tratamiento con vancomicina y disminuidas en el grupo de ratones que recibió las bacterias protectoras. En concordancia con la disminución de las concentraciones de serina en el grupo de ratones que recibió las bacterias protectoras, se detectó la expresión de un receptor sensor de serina (tsr). Sin embargo, el análisis realizado no nos permitió identificar transportadores asociados a la utilización de serina in vivo por EVR. Finalmente, el incremento de ácidos grasos de cadena corta y de fenol en el grupo de ratones que recibió las bacterias protectoras podría intervenir en el mecanismo de protección frente a la colonización por EVR, inhibiendo su crecimiento. Para confirmar que nuestras bacterias compiten con EVR mediante la utilización de nutrientes requeridos para su crecimiento, especialmente de los azucares celobiosa y la N-acetilgalactosa, será necesario confirmar (i) confirmar la disminución de N-acetilgalactosa mediante espectrometría de masas, ya que no pudo ser detectada por NMR, (ii) realizar ensayos de competición por el nutriente entre las bacterias comensales administradas y EVR con el fin de demostrar su papel como mecanismo protector frente a EVR. Conclusiones Estudio del efecto de la administración oral de vancomicina sobre la composición de la microbiota intestinal humana. (I) La vancomicina oral induce cambios drásticos y permanentes en la microbiota intestinal humana, incluyendo la eliminación de todas las unidades taxonómicas operativas (OTUs) pertenecientes al filo Bacteroidetes. (II) Al parar el tratamiento con vancomicina, la tasa de recuperación de la microbiota varía considerablemente entre distintos sujetos, lo que podría influir, tal y como se ha validado en ratones, el nivel de susceptibilidad a la colonización intestinal por el Enterococo-vancomicina resistentes (EVR). Estudio de las alteraciones en la microbiota intestinal causadas por la administración de diferentes antibióticos de distinto espectro sobre la capacidad de colonización intestinal por EVR. (III) Los tratamientos con antibióticos de diferente espectro (ciprofloxacino, neomicina, ceftriaxona, ampicilina, clindamicina y vancomicina), causan alteraciones más amplias en la microbiota intestinal murina de lo esperado según su espectro de acción. (IV) Todos los antibióticos estudiados (ciprofloxacino, neomicina, ceftriaxona, ampicilina, clindamicina y vancomicina) provocan una disminución de la riqueza de la microbiota de ratón. Dos semanas después del final del tratamiento, la riqueza de la microbiota sólo recupera sus niveles basales en el caso del tratamiento con neomicina. La mayoría de los antibióticos estudiados (con la excepción de la ciprofloxacina) también causan una disminución en la diversidad y biomasa de la microbiota de ratón. Dos semanas después de la retirada de los tratamientos antibióticos, la diversidad de microbiota no recupera los niveles basales excepto después del tratamiento con neomicina. Por el contrario, la biomasa de la microbiota recupera sus niveles basales dos semanas después del cese de cualquiera de los antibióticos estudiados. (V) Todos los tratamientos probados en el presente trabajo (ciprofloxacina, neomicina, ceftriaxona, ampicilina, clindamicina, vancomicina) provocan una disminución en la abundancia de los filos Actinobacteria y TM7 y los géneros Turicibacter, Ruminococcus, Allobaculum y Coprobacillus en la microbiota fecal de ratón. (VI) La abundancia del filo Firmicutes en muestras fecales de ratón se ve disminuida por el tratamiento con ampicilina, ceftriaxona y clindamicina, mientras que la vancomicina, cuyo espectro de acción está dirigido frente a este filo, no disminuye la abundancia de este filo en muestras fecales tanto de ratón como humanas. No obstante, a excepción de la ciprofloxacina, todos los antibióticos disminuyen la riqueza bacteriana detectada dentro del filo Firmicutes en muestras fecales de ratones. (VII) La abundancia de filo Bacteroidetes disminuye con el tratamiento con vancomicina, pero no ciprofloxacina, neomicina, ceftriaxona, ampicilina o clindamicina, que de hecho inducen un aumento del género Bacteroides, incluído dentro del filo Bacteroidetes. Por otro lado, la riqueza bacteriana dentro de este filo aumenta después del tratamiento con neomicina y disminuye después de ciprofloxacina, ceftriaxona, clindamicina y vancomicina. Dos semanas después de parar el tratamiento con vancomicina, clindamicina o ceftriaxona, los ratones recuperan una microbiota con menor abundancia del filo Bacteroidetes. (VIII) Vancomicina y clindamicina aumentan la abundancia del filo Proteboacteria mientras que el tratamiento con ciprofloxacino y ceftriaxona disminuye la abundancia de este filo en muestras fecales de ratón. Las alteraciones observadas dentro de este filo se detectan durante el tratamiento y dos semanas después de su retirada. (IX) Los tratamientos antibióticos que causan más alteraciones en la microbiota intestinal promueven niveles más altos de colonización intestinal de EVR en el intestino de ratón, siendo en orden decreciente, vancomicina, clindamicina, ampicilina, ceftriaxona, neomicina y ciprofloxacina, los tratamientos que promueven los niveles más altos de colonización intestinal de EVR. Dos semanas después de la retirada del tratamiento, vancomicina, clindamicina y ceftriaxona aún promueven niveles altos de colonización intestinal por EVR, la ampicilina y la ciprofloxacina promueven niveles intermedios y la neomicina, al igual que los ratones no tratados, no permite la colonización intestinal por EVR. Estudio de la capacidad protectora de los aislados comensales bacterianos frente a la colonización intestinal por EVR. (X) Una mayor abundancia relativa de Alistipes, Allobaculum, Barnesiella, Oscillibacter y taxones no clasificados de las familias Lachnospiraceae, Porphyromonadaceae y Ruminococacceae se asocia con resistencia frente a la colonización intestinal por EVR en ratones. (XI) Mayores abundancias relativas de Escherichia / Shigella, Enterococcus, Akkermansia, Parasutterella, Lactobacillus y taxones no clasificados de las familias Enterobacteriaceae, Burkholderiales y Desulfovibrionaceae se asocian con mayores niveles de colonización intestinal por EVR en ratones. (XII) La inoculación oral de ratones con una mezcla bacteriana que contiene tres aislados bacterianos pertenecientes a los taxones Alistipes, Barnesiella, Oscillibacter y un aislado bacteriano de la familia Ruminococacceae disminuye en más de 3 órdenes de magnitud los niveles de colonización intestinal por EVR. Estudio de los mecanismos por los cuales las bacterias comensales protectoras identificadas disminuyen la colonización intestinal de EVR. (XIII) La inoculación oral de ratones con una mezcla bacteriana que contiene tres aislados bacterianos pertenecientes a los taxones Alistipes, Barnesiella, Oscillibacter y un aislado de la familia Ruminococacceae restauran la expresión de genes, reducidos tras el tratamiento con vancomicina, que codifican para transportadores de azúcares (celobiose, N Acetil-galactosamina, N-acetil-glucosamina), para un receptor sensible a serina y para genes implicados en la síntesis de ácidos grasos de cadena corta (AGCC). (XIV) La inoculación oral de ratones con una mezcla bacteriana que contiene tres aislados bacterianos pertenecientes a los taxones Alistipes, Barnesiella, Oscillibacter y un aislado de la familia Ruminococacceae disminuyen la concentración intestinal del oligosacárido celobiosa, el AGCC lactato y los aminoácidos prolina, serina, leucina y treonina, que incrementan con el tratamiento con vancomicina. Por otra parte, la administración de estas bacterias aumenta la concentración de trimetilamina, fenilalanina, fenol, ácidos biliares y el butirato, 2-metilbutirato, valerato y propionato de AGCC, que disminuyen con el tratamiento con vancomicina. (XV) Durante la colonización del tracto intestinal de ratón, EVR expresa las diferentes subunidades de los transportadores responsables de la internalización de celobiosa y N-acetil-galactosamina y transportadores que permiten la internalización de aminoácidos ramificados, prolina y arginina. (XVI) De las 190 fuentes de carbono analizadas, la N-acetil-glucosamina, la N-acetil-galactosamina y la celobiosa se encuentran entre las 10 fuentes de carbono que promueven el mayor crecimiento de EVR in vitro en condiciones anaerobias. Además, EVR puede crecer utilizando únicamente serina como fuente de carbono in vitro en condiciones anaeróbicas. (XVII) Si bien deben realizarse estudios adicionales para su validación, los resultados presentados en esta tesis apoyan un modelo en el que las bacterias Alistipes, Barnesiella, Oscillibacter y el aislado no clasificado de la familia Ruminococaceae disminuyen la concentración intestinal de nutrientes que pueden ser utilizados por EVR para su crecimiento, lo que reduciría la capacidad de EVR de colonizar el tracto intestinal. Bibliografía Arias, C. a, & Murray, B. E. (2012). The rise of the Enterococcus: beyond vancomycin resistance. Nature Reviews. Microbiology, 10(4), 266–78. https://doi.org/10.1038/nrmicro2761 Buffie, C. G., Jarchum, I., Equinda, M., Lipuma, L., Gobourne, A., Viale, A., … Pamer, E. G. (2012). Profound alterations of intestinal microbiota following a single dose of clindamycin results in sustained susceptibility to Clostridium difficile-induced colitis. Infection and Immunity, 80(1), 62–73. https://doi.org/10.1128/IAI.05496-11 Ecdc. (2015). 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