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Estudio del perfil de microRNAs circulantes en pacientes con déficit de alfa-1 antitripsina. Implicaciones diagnósticas, pronósticas y terapéuticas

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Estudio del perfil de microRNAs circulantes en pacientes con déficit de alfa-1 antitripsina. Implicaciones diagnósticas, pronósticas y terapéuticas

dc.contributor.advisor	Dasí Fernández, Francisco
dc.contributor.advisor	Escribano Montaner, Amparo
dc.contributor.author	Pastor Puente, Sara
dc.contributor.other	Departament de Fisiologia	es_ES
dc.date.accessioned	2017-11-27T11:50:03Z
dc.date.available	2017-11-28T05:45:06Z
dc.date.issued	2017	es_ES
dc.date.submitted	18-12-2017	es_ES
dc.identifier.uri	http://hdl.handle.net/10550/63328
dc.description.abstract	Alpha-1 antitrypsin deficiency (AATD) is a rare and inherited genetic disease that leads to a decrease of circulating levels of alpha-1 antitrypsin, increasing significantly the risk of severe lung and liver disease in children and adults. This condition has a great variability, both genetic and clinical, which makes its prognosis difficult. MicroRNAs are small molecules around 22 that regulate gene expression. In addition, these molecules have great potential as biomarkers due to their location in body fluids, such as blood, reaching there from highly vascularized organs, including lungs and liver; they are very stable, since most of them are linked to AGO proteins and their quantity varies in pathogenic conditions, and their expression may vary before the onset of clinical symptoms. Our objective is to find a circulating microRNAs signature which could discriminate between different phenotypes, as diagnostic biomarkers and, if they develop lung or liver disease, as prognostic biomarkers. The expression profile of plasma miRNAs was performed by microarray (geneChip 3.0, Affymetrix), in 56 subjects including patients with DAAT and MS, MZ, SZ and ZZ phenotypes who had not developed pathology (neither pulmonary nor hepatic); patients with AATD and disease (both emphysema and liver disease) and healthy control subjects (MM). The miRNAs that showed statistically significant differences in some analysis of the arrays were validated by RT-qPCR. In addition, with these results, functional enrichment analyses were carried out, in order to obtain the functions that are differentially represented in the different groups of the study. RNA extraction was done with miRVANA paris kit (Ambion). The selected microRNAs were validated by RT-qPCR. Reverse transcription of differentially expressed miRNAs was performed using the TaqMan Advance miRNA cDNA synthesis kit (Applied biosystem), following the manufacturer's recommendations. This new kit allows a single retrotranscription for the entire set of microRNAs, which is possible by the addition of a poly-A tail at the 3 'end and an adapter at the 5' end of each of the microRNAs, thus being able to amplify with some universal primers. The expression of each of the miRNAs was determined by quantitative real-time PCR, using specific primers and TaqMan probes for each miRNA. Each sample was analyzed in duplicate, and the expression of each miRNA was determined by the 2-ΔCt method. For each of the validated miRNAs, it was checked if any of the co-variables (age and sex) was statistically significant by multivariate tests. If they were not, then univariate analysis of the data was carried out using the Kruskal-Wallis nonparametric test, due to sample difference between the groups; Dunn was used for the post hoc tests. The statistical analyzes were carried out with the software Graph Pad Prism 6.0, SPSS, version 22 and R. The signature of circulating microRNAs varies in patients with alpha-1 antitrypsin deficiency, which could be useful for diagnosis. MiR-122 decreases with age and DAAT. This miR is mainly hepatic, where it represents half of the miRNA and is involved in the regulation of copper and iron ions, carbohydrates and lipids. In addition, miR-93 is increased in patients with the deficiency. MiR-107 is higher in women and increases with the presence of the PiZ allele. Also miR-425 and 151a increase their expression with the PiZ allele, but being greater in homozygosis. MiR-151a inhibits the cul7-RING ubiquitin ligase complex, through the SKP1 gene that is part of the ubiquitin-proteasome system whose function is to regulate the degradation of proteins. Promising results have been found for the use of microRNAs as AATD prognostic biomarkers, but these data should be taken with caution while awaiting validation with a larger cohort of patients. There are 3 microRNAs (17, 106a and 93) which are elevated in patients with pulmonary emphysema. The 3 could be good biomarkers since, in all cases, their area under the curve is greater than 0.8. Functional analyzes show that these miRNAs regulate lung development, oxidative stress and the immune system. This supports the theory that COPD develops mainly due to protease-antiprotease imbalance, inflammation and oxidative stress. In addition, miR-107 and 23b are increased in patients with liver disease. Both microRNAs would be good biomarkers of liver disease, since the low area of the curve of both is greater than 0.8, while miR-23b reaches 100% sensitivity and specificity.	en_US
dc.description.abstract	El déficit de alfa-1 antitripsina (DAAT) es una condición genética rara y hereditaria que conduce a la disminución de los niveles circulantes de alfa-1 antitripsina, aumentando significativamente el riesgo de padecer enfermedad pulmonar y hepática grave, en niños y adultos. Esta condición tiene una gran variabilidad, tanto genética como clínica, lo que dificulta su pronóstico. Los microRNAs son unas pequeñas moléculas alrededor de 22nt cuya función es la regulación de la expresión génica. Además, estas moléculas tienen gran potencial como biomarcadores por su localización en fluidos corporales, como la sangre, provenientes de órganos altamente vascularizados, incluyendo pulmones e hígado; son muy estables ya que la mayoría se encuentran unidos a proteínas AGO y su cantidad varía en condiciones patogénicas, pudiendo variar su expresión antes de la aparición de la sintomatología clínica. Nuestro objetivo es encontrar una firma de microRNAs circulantes que puedan discriminar entre los diferentes fenotipos, comportándose como biomarcadores diagnósticos y, si desarrollaran enfermedad pulmonar o hepática, como biomarcadores pronósticos. El perfil de expresión de los miRNAs plasmáticos se realizó mediante microarray (geneChip 3.0, Affymetrix), en 56 sujetos donde se incluyen pacientes con DAAT y fenotipos MS, MZ, SZ y ZZ que no habían desarrollado patología (ni pulmonar, ni hepática); pacientes con DAAT y enfermedad (tanto enfisema como hepatopatía) y sujetos control sanos (MM). Los miRNAs que presentaban diferencias estadísticamente significativas en algún análisis de los arrays se validaron mediante RT-qPCR. Además, con estos resultados, se llevó a cabo un análisis de enriquecimiento funcional, con el que se obtiene información sobre las funciones que están diferencialmente representadas en los diferentes grupos del estudio. La extracción del RNA se realizó con el kit miRVANA parís (Ambion). Los microRNAs seleccionados se validaron mediante RT-qPCR. La transcripción reversa de los miRNAs expresados diferencialmente se realizó usando TaqMan Advance miRNA cDNA synthesis kit (Applied biosystem), siguiendo las recomendaciones del fabricante. Este nuevo kit permite realizar una única retrotranscripción para todo el conjunto de microRNAs, siendo posible gracias a la adicción de una cola poli-A en el extremo 3’ y un adaptador en el extremo 5’ de cada uno de los microRNAs, pudiéndose amplificar así con unos primers universales. La expresión de cada uno de los miRNAs se determinó mediante PCR cuantitativa a tiempo real, utilizando primers y sondas TaqMan específicos para cada miRNA. Cada muestra se analizó por duplicado, y la expresión de cada miRNA se determinó por el método 2-ΔCt. Para cada uno de los miRNAs validados se comprobó si alguna de las co-varibles (edad y sexo) era estadísticamente significativa mediante tests multivariantes. En el caso de que no lo fueran, se procedió al análisis univariante de los datos con el test no paramétrico de Kruskal-Wallis, debido a diferencia de muestra entre los grupos; para los tests post hoc se utilizó Dunn. Los análisis estadísticos se realizaron con los software Graph Pad Prism 6.0, SPSS, versión 22 y R. La firma de microRNAs circulantes varía en pacientes con déficit de alfa-1 antitripsina, lo que podría ser útil para el diagnóstico. El miR-122 disminuye con la edad y con el DAAT. Este miR es principalmente hepático, donde representa la mitad del miRnoma y está implicado en la regulación de iones de cobre y hierro, glúcidos y lípidos. Además, el miR-93 está incrementado en los pacientes deficitarios. El miR-107 está más elevado en mujeres y aumenta con la presencia del alelo PiZ. También los miR-425 y 151a aumentan su expresión con el alelo PiZ, pero siendo mayor en homocigosis. El miR-151a inhibe el complejo ubiquitina ligasa cul7-RING, a través del gen SKP1 que forma parte del sistema ubiquitina-proteasoma cuya función es regular la degradación de las proteínas. Se han encontrado resultados prometedores para el uso de los microRNAs como biomarcadores pronósticos del DAAT pero son datos que habría tomar con cautela a la espera de su validación con una cohorte más grande de pacientes. Existen 3 microRNAs (17, 106a y 93) que están elevados en los pacientes con enfisema pulmonar. Los 3 podrían ser buenos biomarcadores ya que, en todos los casos, su área bajo de la curva es mayor de 0,8. Los análisis funcionales muestran que estos miRNAs regulan el desarrollo pulmonar, el estrés oxidativo y el sistema inmune. Esto apoya la teoría de que la EPOC se desarrolla, principalmente, por el desequilibrio proteasa-antiproteasa, la inflamación y el estrés oxidativo. Además, Los miR-107 y 23b están incrementados en pacientes con hepatopatía. Ambos microRNAs serían buenos biomarcadores de enfermedad hepática, ya que el área bajo de la curva de ambos es mayor de 0,8, mientras que el miR-23b alcanza el 100% de sensibilidad y especificidad.	es_ES
dc.format.extent	396 p.	es_ES
dc.language.iso	es	es_ES
dc.subject	microRNAs	es_ES
dc.subject	déficit de alfa-1 antitripsina	es_ES
dc.subject	microRNAs circulantes	es_ES
dc.subject	ponóstico	es_ES
dc.title	Estudio del perfil de microRNAs circulantes en pacientes con déficit de alfa-1 antitripsina. Implicaciones diagnósticas, pronósticas y terapéuticas	es_ES
dc.type	doctoral thesis	es_ES
dc.subject.unesco	UNESCO::CIENCIAS MÉDICAS	es_ES
dc.embargo.terms	0 days	es_ES