DESARROLLO DE UN SISTEMA DE DETECCIÓN DE MUTACIONES SOMÁTICAS DE INTERÉS CLÍNICO MEDIANTE SECUENCIACIÓN MASIVA EN MUESTRAS ONCOLÓGICAS INTRODUCCIÓN. La descripción de los mecanismos moleculares de algunos de los tumores más frecuentes ha permitido el desarrollo de nuevos fármacos capaces de antagonizar moléculas propias de los tumores. Esto implica la necesidad de determinar la existencia de determinadas alteraciones génicas cuya presencia va asociada a la decisión terapéutica en el uso de estos fármacos. Por lo que ha sido necesario el desarrollo de técnicas de análisis genético que sean lo suficientemente sensibles para detectar la presencia de mutaciones somáticas de interés clínico, a la vez que lo suficientemente óptimas en términos de consumo económico, de muestra y que proporcionen una respuesta rápida. OBJETIVOS. Desarrollar y validar un sistema de detección rápido, sensible, reproducible y fácilmente integrable en la rutina clínica, para detectar mutaciones de interés clínico. Este sistema debe ser escalable y modulable, y el diseño del método de validación debe ser extrapolable a otras plataformas de secuenciación. METODOLOGÍA. A partir de biopsias incluidas en parafina de pacientes con cáncer colorrectal metastásico (CCRM) se analizaron muestras portadoras de mutaciones en los genes BRAF/KRAS/NRAS y no portadoras. Se seleccionaron las condiciones de amplificación por técnicas de PCR para obtención de los amplicones, y se secuenciaron mediante el sistema 454 GS Junior de Roche. Se validaron los resultados obtenidos por medio de la exactitud, precisión, sensibilidad y concordancia con otros métodos estandarizados para asegurar la fiabilidad de los resultados. RESULTADOS. Se diseñaron y optimizaron las condiciones para la amplificación de las zonas de interés de los genes descritos. Los resultados de las carreras analizadas nos permitieron establecer una calidad del proceso con un promedio de Passed Filter del 45.94% y de Dot+Mixed del 17.73%. Así como unos rendimientos de la técnica expresados en coberturas de 135.000 lecturas por carrera, 8.300 lecturas por muestra y 1.000 lecturas por amplicón. La exactitud del método de análisis mostró un error relativo inferior al 9% en muestras comerciales, portadoras de mutación al 50%, aumentando cuando se analizan en muestras con varias mutaciones y a porcentajes más bajos. De la precisión en términos de repetibilidad (intra-run) se obtuvieron coeficientes de variación (CV) del 8-23%, y de repetibilidad (inter-run) del 8-15%. Al estudiar la sensibilidad y especificidad analíticas se observó que al 2% de presencia de la mutación y a 1000 lecturas de cobertura, se obtuvieron valores del 100% de sensibilidad y 97% de especificidad analítica. Se obtuvieron unas concordancias con nuestro sistema de secuenciación NGS del 100% para el kit BRAF Mutation analysis, del 81% con el test cobas KRAS Mutation y del 63-85% para NRAS con el método de Sanger, todos los casos con un p-valor < 0.05. La participación en los controles de calidad hizo visible que los resultados de nuestro método eran fiables. Los resultados mutacionales de la población analizada coincidieron con datos reportados en poblaciones equiparables. CONCLUSIONES. El método desarrollado en este trabajo permite una detección rápida y fácilmente integrable en la rutina clínica para la detección de mutaciones de interés oncológico. Mediante el uso de este panel es posible detectar estas mutaciones con una sensibilidad del 2% en el exón 15 del gen BRAF y en los exones 2, 3 y 4 de los genes KRAS y NRAS. El diseño de la validación es aplicable a otras plataformas de NGS.