Abstract: Scientific background and study aims: The use of dental implants as an alternative for mouth rehabilitation has proven its efficacy showing high survival rates. A key aspect of dental implant osseointegration is related to adequate primary stability, ensured by the mechanical interlocking at the bone to implant interface and depends in part by the implant geometry, surface roughness and surgical technique for implant bed preparation. Several factors are involved in the interaction between the implant surface and the surrounding parent bone during osseointegration. One of them is the implant macro-design, that may provide different shear stress depending on the bone density of the insertion site. According to its features, implant macro-design could affect in more or less extent on the stress yielded on bone, triggering a host response inducing vascular and cellular events, that cause a cell mediated interfacial bone remodeling. It consists of the resorption of mineralized bone “cortical bone” and consequently a "primary stability dip", that concurs simultaneously with a new bone apposition towards the implant surface as an increase of the biologic- “secondary stability”. Different implant thread designs and thread pitches were proposed to improve the osseointegration. In this sense implant geometry prove to affect the bone-to-implant contact (BIC) values. Modified macro-geometry and different microgeometries of implants has shown to have a stimulatory effect on osseointegration, suggesting its features should be made related to the biological and mechanical micro-environment. Moreover, other features such as the healing chamber design and apical configurations have proven to improve osseointegration. Dental implants macro-design often are supplemented with titanium surface modification in such a way to improve their bioactivity and clot retention capacity during bone healing. These modifications increase the three-dimensional surface area and confer different topographical characteristics for cell homing. The surface roughness is quantified and reported as Ra or Sa, depending on if the parameter is classified as two-dimensional or three-dimensional respectively. It provide an enhanced activation of platelets, cell adhesion and protein adsorption toward implant surface, with effects on osseointegration process in terms of BIC and implant stability during early healing stages, through an increase of osteogenic activity and osteoconductivity of titanium. Several methods for implant surface treatments (e.g., etched surfaces, sandblasted and acid etched surfaces, hydroxyapatite-coated surfaces, grit-blasted surfaces, laser ablation, fluoride treatment) have been proposed. Among them, the resorbable blasted media (RBM) surface is obtained through the grit-blasting of calcium phosphate bioceramic (CaP) particles at high velocity, in which the particle size determines the roughness degree as a particle-free titanium surface. The RBM surfaces showed BIC values that were comparable to other blasting surfaces, such as titanium dioxide (TiO2) or aluminum oxide (Al2O3) and similar biomechanical strength and removal torque measurements were obtained by calcium- and magnesium- enhanced implants. Recent evidence reinforces the concept that the implant geometry and the density of the bone are key factors involved in the degree of primary stability. However, osseointegration is strongly influenced by the implant surface, which plays a role during the early phase of healing through resorptive and appositional events. At this regard, different topographic sites confer different healing patterns, such as occurring at the cortical and the marrow compartments at both flat- (dog jaw) and long- bones (sheep tibia). This behavior is observed in rabbit tibiae as well, and despite inherent experimental model differences, the effects of equal implant geometries have been tested, but at different implant surface modifications, and evidencing the effect of surface treatment on the BIC values reached. Therefore, it is presumable that both the cortical and marrow compartments provide distinct biological and physical features at bone-to-implant interfacial remodeling and direct bone apposition toward the implant surface. Their nature demarcates the transition from primary to secondary/biological stability after an implant stability dip in the osseointegration process. However, there is a scarcity of data based on bi-cortically placed dental implants with different macro-designs and equal surface roughness, and a lack of studies regarding bone-healing pattern on implant surfaces at different bone compartments and bone environments are still missing. Based on the above mentioned aspects, and the gap of information at this regard, the general aim of this thesis was a more consistent understanding of osseointegration values (new bone, old bone, bone marrow and BIC [new bone + old bone]) of two different implant macro-designs, with equal RBM surface treatment in different topographic sites in rabbit tiabiae (diaphysis or metaphysis). Thus, the following objectives were disaggregated from this primary objective, to exploit in more detail the study sample, as shown below: VI. To document the sequential healing during osseointegration of implants with RBM surface treatment at 2, 4 and 8 weeks in a rabbit model. VII. To evaluate the effect of two different implant macro-designs on the sequential osseointegration values at 2, 4 and 8 weeks. VIII. To evaluate the effect of different bone topographic site of rabbit´s tibiae on osseointegration process. IX. To evaluate the effect of implant macro-design regarding the topographic site at rabbit`s tibiae, on osseointegration. X. To evaluate the bone-healing pattern at the cortical and marrow compartments in the diaphysis and metaphysis of rabbit´s tibiae. Material and methods The study protocol was approved by the Ethics Committee of Valencia University, Valencia, Spain (Protocol ref.: A1432625410189), which followed the guidelines established by the Council Directive of the European Union (53/2013; February 1, 2013) for animal care and experimentation in agreement with the ethical and legal conditions established by Royal Decree 223, March 14 and October 13, 1988. -Study design A experimental pre-clinical study involved twenty-seven males, albino New Zealand rabbits, 24 weeks of mean age and weighing 3–4 kg. The animals were segmented into three groups composed of 9 animals each and sacrificed at 2, 4 and 8 weeks, respectively. Implants were put into the animals in a random allocation, a resulting in the imposition of four dental implants in each rabbit; two in each tibia, one in the diaphysis, and the other in the metaphysis. Before surgery, the animals were put in one of the three groups by random allocation, each group representing a healing period. Two implants each with a different macro-design were installed in each tibia. The position of each implant, i.e., the diaphysis or metaphysis, was randomly assigned. The aleatory choice was carried out electronically (www.randomization.com ) by an independent author neither involved in the selection of the animals nor in the surgical procedures. Two distinct implant macro-designs were used, Ticare® implants (Mozo-Grau, Valladolid, Spain) made of commercially available pure grade-IV titanium treated with resorbable blast media (RBM) (implant surface blasted with calcium phosphate bioceramics particles, resulting in a moderately rough (Ra = 1.53 ± 0.24) surface) were used. All implants had a dimension of 3.75 mm of diameter and 8 mm of length and a conical connection with a 45° polish neck with a self-tapping feature closer to the apex. Ticare Inhex® : the implant body had a little conicity and a large area of micro-threads at the coronal portion, and higher number of triangular threads per unit length and with little thread depth compared to Quattro® model. Moreover, the implant had a double self-tapping at the apical portion. Ticare Inhex Quattro® : the implant body had a marked conicity. Fewer micro-threads at the coronal portion and a lower number of macro-threads were present compared to Ticare Inhex® implants. The threads were squared in the middle part of the implant and become triangular and deeper at the apex. Aggressive self-tapping at the apex. -Clinical procedures The rabbits were anesthetized with intramuscular injection of Ketamine (22mg/kg) and xylazine (2.5 mg/kg) were administered at 50% and intravenous injection of Propofol (1.5mg/kg) and maintained with 2% of isoflurane. Before surgery, the skin at the proximal tibia was shaved and disinfected with Betadine. A preoperative antibiotic Enrofloxacin 5mg/Kg (ALSIR® 2,5%, Esteve Veterinaria, Barcelona, Spain) was administered subcutaneously, and 3 ml of articaine at 2% with 0.01 mg/ml epinephrine infiltrative anesthesia was also administered intramuscularly in the surgical area of each leg. The skin of both tibiae was incised in the proximal region (Fig. 1c). Two experimental sites were identified in each tibia (Fig. 1d). The recipient sites were prepared using drills with increasing diameter under irrigation with sterile saline according manufacturer. A distance of about 8-10 mm was maintained between the two osteotomies. Two implants with different macro-design were randomly installed in each tibia, and were screwed until the implant shoulder was leveled with the bone surface. The apex of the implants was placed in close contact with or into the cortical bone opposing the coronal cortical compartment, aiming to obtain a bicortical anchorage. The cover screws were placed on the implants, and the flaps were subsequently sutured in layers with resorbable sutures to allow a submerged healing (Vicryl 5/0, Ethicon, Sommerville, NJ, USA), and Nylon 3/0 (Ethilon 3/0, Ethicon, Sommerville, NJ, USA). -Pre- and Post-operative care, housing and husbandry All animals were kept in individual cages during its acclimatization period before intervention (2 weeks) and during post-operative care at the Animal Room Service Unit, University of Valencia, Spain, in purpose-designed and acclimatized rooms at 21ºC with 12 h dark/light ambiance. The animals were fed with a standard diet and had free access to water. The analgesic pattern consisted in 2.5mg/kg of morphine intraoperative, 0.02 mg/kg buprenodale, buprex, 0.2 mg/kg meloxicam (every 12 hours during 3 days) and antibiotic therapy with Enrofloxacin 2.5 mg/Kg (ALSIR® 2,5%, Esteve Veterinaria, Barcelona, Spain) (every 24 hours during 7 days) post-operatively. -Euthanasia Nine rabbits of each three groups were euthanized after 2, 4 and 8 weeks, respectively. The same sedation and anesthesia protocols, such as for the surgery, were applied and the euthanasia induction was performed with 50mg/kg intravenous sodium pentobarbital. A small electric saw was used to obtain the sections of the tibia containing each implant. -Histological preparation Implant samples were dehydrated by sequential solvent exchange and embedded in methyl methacrylate containing poly-(methyl methacrylate). After adding benzoyl peroxide (1 g/100 mL), samples were polymerized and were then sawed using a diamond wheel on a precision table top cut-off machine Accutom-5 (Struers, Copenhagen, Denmark) and then were wet ground and polished using a LaboPol-21 system (Struers, Copenhagen, Denmark) and SiC foils. Approximately 80 μm thin sections were obtained. The samples were stained at 55 C with toluidine blue for 30 min, washed with tap water for 2 minutes and let dry. -Histological examination Overlapping calibrated digital images of the tissues surrounding the whole implant surface (about 20 images/implant) were recorded with a bright field Leica DM4000 B microscope (Leica Microsystems GmbH, Wëtzlar, Germany) and DFC420 digital camera using a 5 objective and the Leica Applications Suite version 4.4.0 software. Individual images were merged to compose each implant side using the Photoshop program (Adobe Photoshop CC 2015.0.0, Adobe Systems Incorporated, San José, CA, USA, http://www.adobe.com/Photoshop). The image processing program ImageJ 1.48 (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA; http://imagej.nih.gov/ij) was used for histological measurements. Lines were drawn by hand on calibrated images showed on the computer screen at a 400 magnification by an independent and calibrated assessor not involved in study. The BIC was evaluated as the sum of new and old bone, and percentages in relation to the length of the implant surface examined calculated. The apical portion of the implant that extruded beyond the compact cortical layer was excluded from the analyses. -Data analysis Differences between implant designs across the healing periods were analyzed with the Mann–Whitney U-test for independent variables. Differences between implants placed in the diaphysis and metaphysis were also performed using a Wilcoxon rank-sum test. A multivariate general lineal model analysis was performed to explore the interaction between the two independent variables (design/position) over BIC values at different healing stages. Each factor with two categories: design (Ticare Inhex® /Ticare Quattro® ) and position (diaphysis/metaphysis). This approach was chosen because previous reports observed that the positions of the implants can be used as independent replicates regarding outcome variable, since bone quality varies between implantation sites (topographic sites) at same degree as between experimental units. The level of significance was set at α=0.05. Results To isolate the possible effect of implant macro-geometry on bone formation, both implants had the same surface treatment. In order to appreciate the behavior of both implant macro-designs in two different bone environment, they were placed in two topographic zones within the same tibia, one with a cortical layer and a medullar content (diaphysis) like a type II bone and the another more trabecular like a type III bone (metaphysis). The purpose of the study was to evaluate the effect of two different implant macro-designs but equal surface roughness on the sequential osseointegration at bicortically installed implants in the rabbit tibia. Data of 27 experimental animals with four implants each were analyzed. The areas between the threads were filled with woven bone at two weeks. Remodeling processes were observed after 4 and 8 weeks of healing, as shown by the lighter-staining of the lamellar bone compared to the darker-staining of the woven bone. At 2 weeks of healing a similar degree of new osseointegration was observed in both macro-designs, being 16.0±7.5% for Ticare Inhex® , and 16.3±7.2% for Quattro® implants. The old bone percentages observed were around 7.4% and 7.6% for Ticare Inhex® and Quattro® implants, respectively. Regarding implant position (diaphysis or metaphysis), there were no significant differences among the assessed parameters at this stage. Similar BIC values were observed between implant macro-designs and regarding topographic site placement being 23.5±14.4% and 23.9±13.3% for Ticare Inhex® and Quattro® implant designs, respectively. None of the differences for both macro-design and topographic sites was statistically significant. At 4 weeks of healing, the values of new osseointegration at this time of healing were 19.4±7.3% and 18.9±4.7% for the Ticare Inhex® and Quattro® designs, respectively. Old bone percentages at this stage were 2.3±2.2% and 2.4±1.6%, respectively. Grouping the data according to the implant position in the diaphysis and metaphysis, there was no significant difference for new osseointegration (p=0.10). However, a significant difference found for old bone and soft tissue values at this stage. Similar BIC values (old + new bone) were observed between implant macro-designs, but regarding topographic site placement better BIC values for diaphysis 24,5±6,2% than metaphysis 18,4±7,7 % at this stage (p=0,05). At 8 weeks of healing, the new bone increased, reaching percentages of 33.2±7.6% and 33.4±7.7% for Ticare Inhex® and Quattro® implant designs, respectively. No statistically significant differences were found between the two groups. Old bone was still present, however at very low percentages, being 1.2±1.1% and 3.3±1.1% for Ticare Inhex® and Quattro® designs, respectively (p=0.001). The new bone percentages in the diaphysis was 36.4±10.5% while in the metaphysis was 29.3±6.2%. No statistically significant differences were found. The BIC values observed between implant macro-designs do not showed a significant difference, even though slight better BIC values in favor Ticare Quattro® compared to Inhex® design were found, being 36.7±7.7 % and 34.4±7.8, respectively. However, regarding the topographic site placement, a better BIC value for diaphysis (39.5±11.1%) than metaphysis sites (30.6±6.2%) (p=0.05) was seen at this stage of healing. In the multivariate analysis it was observed that the implant position showed a statistical significance regarding BIC values at 4 and 8 weeks (p<0.05). However, the analysis fails to detect statistical significance for implant macro-designs and its interaction (design*position) over BIC values across healing stages. Is observed that Ticare Quattro® design showed a slight better BIC values at diaphysis sites across healing stages (p>0.05). Another objective was to evaluate the bone-healing pattern at the cortical and marrow compartments at equal RBM surfaces of bicortically installed implants in the diaphysis and metaphysis of rabbit tibia. The bone healing stages follow the intramembranous-type and appositional ossification mode patterns. The latter could be observed where intimate contact between the implant surface and newly formed bone from the implant bed occurred. On average, better osseointegration values were identified in the cortical compartments, and slightly higher but no statistically significant values at the diaphysis sites. Regarding the marrow compartment, better apposition rates of new bone were observed at two and four weeks at the diaphysis sites. At 2 weeks of healing, there were not significant differences among the parameters assessed between the cortical and marrow compartments in both the diaphysis and metaphysis sites. The BIC values were around 30 ± 9.9% versus 23.7 ± 6.4% for diaphysis and metaphysis sites respectively in the cortical compartment (p=0.09), and 21.1 ± 12.3 versus 13.9 ± 8.0 in marrow compartment (p=0.07). At 4 weeks of healing, significant differences were observed for old bone at cortical compartment and for new bone and soft tissue in the marrow compartments between diaphysis and metaphysis sites. No differences were detected for BIC values in the cortical compartment that were around 25.4 ± 7.8% and 21.4 ± 8.0% for diaphysis and metaphysis sites, respectively (p=0.26). However, a significant difference was found in the marrow compartment, showing BIC values of 22.1± 6.9 and 13.6 ± 8.5 (p=0.01) for diaphysis and metaphysis sites, respectively. At 8 weeks of healing, on average, better values for new and old bone were observed in the cortical compartment; a significant difference was detected between the cortical and marrow compartments for these parameters in metaphysis sites. The mineralized bone-to-implant contact at this stage did not show significant differences within the cortical compartment between diaphysis and metaphysis implant sites, with BIC% values 41.1 ± 6.8% and 39.9 ± 9.8%, respectively (p=0.61). A similar trend was observed within the marrow compartments at diaphysis and metaphysis sites. Discussion Study outcomes The main aim of the present doctoral dissertation was to assess the impact of two distinc implant macro-designs bicortically installed in two bone envirorments (diaphysis or metaphysis) within rabbit tibiae. Moreover, the bone healing patterns at cortical and marrow compartments in diaphysis and metaphysis sites were analyzed. Summary of main findings The study was performed with the aim of assessing the influence of macro-geometry on osseointegration. To isolate the possible effect of implant macro-geometry on bone formation, both implants had the same surface treatment. In order to appreciate the behavior of both implant macro-designs in two different bone environment, they were placed in two topographic zones within the same tibia, one with a cortical layer and a medullar content (diaphysis) like a type II bone and the another more trabecular like a type III bone (metaphysis). In the present study, the new bone regarding the topographic site of implantation after 2, 4 and eight weeks of healing, was found to be slightly higher, at the implants in the diaphysis compared to the metaphysis, but without reach statistical significance differences (p>0.05). The BIC values observed between implant macro-designs do not showed a significant difference, even though slight better BIC values in favor Ticare Quattro® compared to Inhex® design were found. However, regarding the topographic site placement, a better BIC value for diaphysis than metaphysis sites were seen at 4 and 8 weeks of healing (p=0.05). A multivariate general lineal model analysis was performed to explore the interaction between the two independent variables (design/position) over BIC values at different healing stages. It was observed that the implant position showed a statistical significance regarding BIC values at 4 and 8 weeks (p<0.05). However, the analysis fails to detect statistical significance for implant macro-designs and its interaction (design*position) over BIC values across healing stages. Is observed that Ticare Quattro® design showed a slight better BIC values at diaphysis sites across healing stages (p>0.05). On the other hand, the bone-healing pattern at cortical and marrow compartments at diaphysis and metaphysis sites was studied. The new bone formation in the marrow compartment showed slightly better increasing values of 13.8%, 20.4, and 24.6% at two, four and eight weeks at diaphysis sites, compared to 10.3%, 13%, and 25.1% at metaphysis sites. The same trend was observed in the cortical compartment with values around 17.8%, 21.4%, and 37% at diaphysis sites, and 15.1%, 19.7%, and 35.5% in metaphysis sites. The old bone was resorbed but was still present (<2%) after 1 month in both topographical zones. The parent old bone values observed were slightly higher in diaphysis implant sites at four and eight weeks compared to metaphysis sites in the present study sample. The BIC values not showed significant differences, except for marrow compartment at four weeks of healing, showing BIC values of 22.1± 6.9 and 13.6 ± 8.5 (p=0.01) for diaphysis and metaphysis sites, respectively. Disscussion with previous literature The histomorphometric analysis at either 2, 4 and 8 weeks were similar (P > 0.05) for both implant macro-designs. Moreover, comparing new bone percentages in relation to the topographic implant placement, after 4 and 8 weeks of healing, osseointegration was found to be slightly higher, but statistically not significant at the implants placed in the diaphysis compared to the metaphysis. These findings are contrary to those reported in a previous experiment in rabbits from Caneva et al. in 2017. Observations that could be attributable to several factors, such as the implant thread design, the surface treatment tested and the implant osteotomy protocols, differing between studies. It is known that these factors could regulate the strain applied to hard tissue in proximity to the implant. Old bone was resorbed, but was still present after 1 month of healing (<4%), with statistical significant better values in Quattro® group. This pattern of healing is in agreement with other studies performed in animals and humans. Noteworthy to mention, bone morphology in diaphysis is predominantly occupied by a marrow content in comparison to metaphysis that presents more trabecular bone. These findings are in agreement with the assumption that osseointegration is faster in zones where the bone apposition is not preceded by bone resorption as previous observed in a dog model by Abrahamsson et. al in 2003 and confirmed in miniature pigs by Buser et al. in 2004. It appears likely that bone formation started from the cortical compartments (in contact with mineralized parent bone) and, subsequently, proliferated toward into the marrow compartments. It is known that resorptive processes occur before new bone apposition in zones where the mineralized bone is present, conveying a slightly longer healing period to reach complete osseointegration. The implants in the present study were in close contact to pristine bone due to its bicortically stabilization, a condition that favors osseointegration on the implant surface. A pattern of healing that were documented for osseointegration in different pre-clinical models. The parent old bone in recipient site is responsible of mechanical interlocking, and thereafter it is relevant during implant stability dip, where takes place a cell mediated interfacial bone remodeling. This is typically described to occur in the area of contact between the pristine bone wall and implant surface, where remodeling arise in the proximity of microcracks followed by bone apposition in void spaces resulting in secondary stability. The results from the present study are in agreement with other studies such as Leonard et al. in 2009; that showed that macro-design did not significantly affect the BIC rates under the absence of loading conditions. However, the scientific literature does not differentiate the discrepancies regarding implant positioning within rabbit tibiae, a factor that may probably contribute to results due to the different bone density. At this regard, a previous report suggests that implant macro-design features, such thread pattern and thread pitch, can be responsible for differences in the amount of bone and degree of apposition toward the implant surface. Therefore, consideration of specific implant macro-design should be made relative to the biological and mechanical microenvironment, as suggested by Vivan-Cardoso et al. in 2015. In keeping with the observations mentioned above, the healing pattern at cortical and marrow compartments was further analyzed in the two bone environments (diaphysis and metaphysis) within rabbit tibiae. Indeed, in the present study, the new bone formation in the marrow compartment showed slightly better increasing values at diaphysis implantation sites, values of 13.8%, 20.4, and 24.6% at two, four and eight weeks at diaphysis sites, compared to 10.3%, 13%, and 25.1% at metaphysis sites. The same trend was observed in the cortical compartment with values around 17.8%, 21.4%, and 37% at diaphysis sites, and 15.1%, 19.7%, and 35.5% in metaphysis sites. Is observed that parent old bone values observed were slightly higher in diaphysis implant sites at four and eight weeks compared to metaphysis sites in the present study sample. In the context of topographic sites of implantation, our results found to be contradictory to those reported in a previous study from Caneva et al. in 2017, where the new bone formation developed at a much higher speed at the implants placed in the metaphysis that those in the diaphysis. Though, these differences could be attributable to various factors, as mentioned previously. The authors attributed the findings to the denser pattern of the trabecular bone in the metaphysis compared to the diaphysis tibiae, an event that may have empowered osseointegration. On the other hand, the bone formation that was supposed to be reinforced by the bone marrow did not work out, since this scarcely contributed to its formation in the middle section of the implants placed in the diaphysis compared to what was found in the coronal and apical sections. Methodological differences could be mentioned for this aspect; In the study of Caneva et al. in 2017, there were demarcated three sections (coronal, middle, and apical) to test the differences among compartments in the rabbit tibiae. In the present study, the three sections were demarcated in the same manner, but the cortical compartment is considered as the sum of the cortical and apical regions as a whole, independently of the marrow compartment (middle). Although, in both studies, the extreme regions of the implants were in close contact with pristine bone due its bicortical stabilization. On the other hand, it is possible to conclude that osseointegration seems to be favored by the existence of a blood clot, and prejudicated by the presence of the yellow fatty bone marrow in the long bone model, such as sheep tibiae. In this sense, Morelli et al. in 2014 employed the sheep tibia model, where two osteotomies for implant installation are prepared in each tibia. At the control sites, no further treatments were performed while, at the test sites, bone marrow was removed from the osteotomy site with a curette to an extent that exceeded the implant dimensions. As a result, the apical portion of the implants at the control sites was in contact with bone marrow while, at the test sites, it was in contact with the blood clot. On average, new bone apposition was better in the cortical compartment, as seen in the present study. Moreover, it was observed that new bone apposition was faster in the fatty bone marrow group compared to blood clot groups at marrow compartments after 4 weeks but without reach statistical significance. However, these authors further concluded that osseointegration appeared to be favored by blood clots, because at 12 weeks of healing the test group showed better new bone values, statistically significant only at the marrow compartment, even though in this study the implants were not placed bicortically. However, despite inter-species differences impeding direct comparisons. Efforts, limitations and recommendations for future search This study was conducted in agreement with ARRIVE guidelines that encourages the good practices and quality of reporting in experimental animals. The novelty of the present work lies in the fact that there is no other study aiming to assess the impact of distinct implant macro-designs with equal moderately-rough RBM surface treatment in two different bone environments onto the osseointegration values and the healing patterns at the cortical and marrow compartments within the same rabbit tibiae. This allows us to isolate the macro-design effects on osseointegration, thus helping us separately evaluate the dynamics of the healing pattern in distinct bone densities. However, due to the absence of functional load, these parameters reflect the structural connection between implant and bone, and not the functional properties of the bone to implant interface. There is scarce pre-clinical evidence regarding sequential healing of bicortically installed implants with two macro-designs and equal surface treatment, attempting to assess its interaction in two topographic sites. Despite that the interaction of factors was assessed, only the topographic site seems to contribute to values at 4 and 8 weeks. Regrettably, it is difficult to determine to which extent each implant macro-design contributes to these findings observed at the diaphysis or metaphysis sites. The scarce sample did not permit a proper statistical comparison. Note to mention, the findings of the interaction are merely exploratory and should be interpreted with caution. Thus, more studies are needed to explore the impact of different macro-designs with equal surface roughness of different manufacturing methods (e.g. SLA, anodized, etc) on osseointegration in rabbit model, and considering the impact of loading conditions. Also, there is no certain data on the extent to which the rabbit tibia model, in its diaphysis or middle shaft, provides amounts of fatty bone marrow that may affect osseointegration after eight weeks of healing. Thus, it would be of interest to isolate its effect in a further study in the rabbit tibia model. Further studies are warranted with a greater sample size to answer these aspects, but this is a tough challenge, taking into consideration the ethical and economic aspects that may be involved in consideration of the replacement, refinement, or reduction (3Rs) criteria for the use of animals in research. Conclusions In summary this thesis concluded that: I. The sequential osseointegration pattern of RBM surfaces is successful in the rabbit model. II. The implant macro-designs does not significantly affect the osseointegration process in the absence of loading across healing stages. III. Bone morphometry and density may affect the bone apposition onto the implant surface. The apposition rates were slightly better in diaphysis compared to metaphysis topographic sites. The BIC values were significantly higher at 4 and 8 weeks in diaphysis sites. IV. There is no interaction between implant macro-design and the topographic site as shown by the multivariate analysis. Though, it was observed that Ticare Quattro® implant macro-design showed slightly better BIC values at diaphysis sites across the healing stages. V. The new bone apposition was better in the cortical- compared to the marrow- compartment. The apposition rates were slightly better at both cortical and marrow compartments in diaphysis compared to metaphysis sites.Antecedentes científicos y objetivos de estudio: El uso de implantes dentales como alternativa para la rehabilitación oral ha demostrado su eficacia y mostrando altas tasas de supervivencia. Un aspecto clave de la osteointegración del implante dental está relacionado con la obtención de una estabilidad primaria adecuada, asegurada por el enclavamiento mecánico entre el tejido óseo y la interfaz del implante, la cual depende en parte de la geometría del implante, la rugosidad de la superficie y la técnica quirúrgica para la preparación del lecho implantario. Varios factores están involucrados en la interacción entre la superficie del implante y el hueso nativo circundante durante la osteointegración. Uno de ellos es el macro-diseño del implante, que puede proporcionar diferentes esfuerzos de corte dependiendo de la densidad ósea del sitio de inserción. De acuerdo con sus características, el macro-diseño del implante podría afectar en mayor o menor medida el estrés producido en el hueso, provocando una respuesta del huésped que induce eventos vasculares y celulares, que causan una remodelación ósea interfacial mediada por células. Esta consiste en la reabsorción del "hueso cortical" mineralizado, y por consiguiente, en una "disminución de la estabilidad primaria", que concurre de forma simultánea con una nueva aposición ósea hacia la superficie del implante o aumento de la "estabilidad secundaria" o biológica. Se han propuesto diferentes diseños de rosca de implantes y pasos de rosca para mejorar la osteointegración. En este sentido, la geometría del implante puede afectar los valores de contacto hueso a implante (BIC). La macro-geometría modificada y las diferentes microgeometrías del implante han demostrado tener un efecto estimulante sobre la osteointegración, lo que sugiere que sus características deben estar relacionadas con el microentorno biológico y mecánico. Además, otras características, como el diseño de la cámara de curación y las configuraciones de la zona apical, han demostrado mejorar la osteointegración. El macro-diseño de los implantes dentales a menudo se complementa con la modificación de la superficie de titanio para mejorar su bioactividad y la capacidad de retención de coágulos durante la osteointegración. Estas modificaciones aumentan de forma tridimensional el área de superficie y confieren diferentes características topográficas para facilitar la atracción de células. La rugosidad de la superficie se cuantifica y se informa como Ra o Sa, dependiendo de si el parámetro se clasifica como bidimensional o tridimensional respectivamente. Esta rugosidad proporciona una activación mejorada de las plaquetas, la adhesión celular y la adsorción de proteínas hacia la superficie del implante, con efectos en el proceso de osteointegración en términos de BIC y estabilidad del implante durante las etapas tempranas de curación a través de un aumento de la actividad osteogénica y la osteoconductividad del titanio. Se han propuesto varios métodos para el tratamiento de la superficie del titanio (por ejemplo superficies grabadas, superficies pulidas con chorro de arena y grabadas con ácido, superficies recubiertas con hidroxiapatita, superficies pulidas con chorro de arena y ablación con láser, superficies con tratamiento de fluoruro). Entre ellos, la superficie del medio chorreado reabsorbible (RBM) se obtiene a través del arenado de alta velocidad con partículas de fosfato de calcio biocerámico (CaP), en la que el tamaño de partícula determina tanto el grado de rugosidad, como una superficie de titanio libre de partículas. Las superficies RBM han mostrado valores BIC comparables a otras superficies, como el dióxido de titanio (TiO2) u óxido de aluminio (Al2O3), obteniendo mediciones de resistencia biomecánica y torque de extracción similares a los obtenidos en implantes mejorados con calcio y magnesio. Evidencia científica reciente refuerza el concepto de que la geometría del implante y la densidad del hueso son factores clave involucrados en el grado de estabilidad primaria. Sin embargo, la osteointegración está fuertemente influenciada por la superficie del implante, que desempeña un papel importante durante la fase temprana de la curación del tejido a través de eventos de resorción y aposición ósea. A este respecto, los diferentes sitios topográficos confieren diferentes patrones de curación, como los que ocurren en los compartimentos cortical y medular tanto en los huesos planos (mandíbula de perro) como en los huesos largos (tibia de oveja). Este comportamiento también se observa en tibias de conejo, y a pesar de las diferencias inherentes en los modelos experimentales, se han probado los efectos de geometrías de implantes iguales, pero con diferentes modificaciones en la superficie, y se evidencia el efecto del tratamiento de la superficie en los valores BIC reportados. Por lo tanto, es presumible que tanto los compartimentos corticales como los de la médula ósea tengan características biológicas y físicas distintas en el remodelado interfacial hueso-implante y la aposición ósea directa sobre la superficie de titanio. Su naturaleza delimita la transición de la estabilidad primaria a la estabilidad secundaria o biológica, que concurre de forma simultánea a la caída de la estabilidad primaria del implante durante el proceso de osteointegración. Sin embargo, hay una escasez de datos basados en implantes con diferentes macro-diseños e igual rugosidad de la superficie instalados de forma bicortical, así como también una falta de estudios respecto al patrón de curación ósea sobre la superficie del implante en diferentes compartimentos y entornos óseos. Sobre la base de los aspectos antes mencionados, y la brecha de información a este respecto, el objetivo general de esta tesis es mejorar el entendimiento de los valores de osteointegración (hueso nuevo, hueso viejo, médula ósea y BIC [hueso nuevo + hueso viejo]) de dos macro-diseños de implantes diferentes, con similar tratamiento de superficie RBM en diferentes sitios topográficos en tibias de conejo (diáfisis o metáfisis). Por lo tanto, los siguientes objetivos se desagregaron de este objetivo principal, para explotar con más detalle la muestra de estudio, como se muestra a continuación: I. Documentar la curación secuencial durante la osteointegración de implantes con tratamiento de superficie RBM a las 2, 4 y 8 semanas en conejos. II. Evaluar el efecto de dos macro-diseños de implantes diferentes en los valores de la osteointegración secuencial a las 2, 4 y 8 semanas. III. Evaluar el efecto de diferentes sitios topográficos en la osteointegración en tibias de conejo. IV. Evaluar el efecto del macro-diseño de implantes respecto al sitio topográfico en la osteointegración en tibias de conejo. V. Evaluar el patrón de curación ósea en los compartimentos cortical y medular en la diáfisis y la metáfisis en tibias de conejo. Material y métodos: El protocolo de estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Universidad de Valencia, Valencia, España (Protocolo ref .: A1432625410189), que siguió las pautas establecidas por la Directiva del Consejo de la Unión Europea (53/2013; 1 de febrero de 2013) para el cuidado de animales y experimentación de acuerdo con las condiciones éticas y legales establecidas por el Real Decreto 223, 14 de marzo y 13 de octubre de 1988. -Diseño del estudio El presente estudio experimental preclínico incluyó veintisiete conejos machos albinos de Nueva Zelanda, con 24 semanas de edad media y un peso de 3 a 4 kg. Los animales se asignaron en tres grupos compuestos de 9 animales cada uno, y que fueron sacrificaron a las 2, 4 y 8 semanas, respectivamente. Antes de la cirugía, los animales fueron asignados de forma aleatorizada a uno de los tres grupos en función del período de curación. Los implantes se colocaron siguiendo una asignación aleatoria, lo que resultó en la colocación de cuatro implantes dentales en cada conejo; dos en cada tibia, uno en la diáfisis y la otro en la metáfisis, cada uno con un macro-diseño diferente. La asignación aleatoria fue realizada electrónicamente (www.randomization.com) por un autor independiente que no participó en la selección de los animales ni en los procedimientos quirúrgicos (Danielle Botticelli). Los dos distintos macro-diseños utilizados fueron implantes Ticare® (Mozo-Grau, Valladolid, España) hechos de titanio comercialmente puro de grado IV, tratados con un medio arenado reabsorbible (RBM) (la superficie del implante es chorreada con partículas biocerámicas de fosfato de calcio, lo que resulta en una superficie de rugosidad moderada [Ra = 1.53 ± 0.24]). Los implantes disponen una dimensión de 3,75 mm de diámetro y 8 mm de longitud, una conexión cónica con un cuello pulido de 45 ° y una capacidad de corte autorroscante en la proximidad del ápice. Ticare Inhex® : el cuerpo del implante tiene poca conicidad y una gran área de micro espiras en la porción coronal, posee un mayor número de hilos de rosca triangular por unidad de longitud con poca profundidad de hilo respecto al modelo Quattro® . El implante muestra un doble corte autorroscante en la porción apical. Ticare Inhex Quattro® : el cuerpo del implante tiene una marcada conicidad. Presenta menor cantidad de micro espiras en la porción coronal y un menor número de macro espiras por unidad de longitud en comparación con los implantes Ticare Inhex® . Las espiras son forma cuadrada en la parte media del implante, y se tornan triangulares y profundas hacia la parte apical. El implante muestra un corte autorroscante más agresivo. -Procedimientos clínicos. Los conejos se anestesiaron con una inyección intramuscular de ketamina (22 mg/kg) y xilazina (2,5 mg/kg) al 50%, y se les administró una inyección endovenosa de propofol (1,5 mg/kg), la anestesia se mantuvo con isofluorano al 2%. Antes de la cirugía, la piel de la tibia proximal se afeitó y se desinfectó con Betadine. Se administró un antibiótico pre operatorio por vía subcutánea Enrofloxacino 5 mg/Kg (ALSIR® 2,5%, Esteve Veterinaria, Barcelona, España), así como 3 ml de articaína al 2% con 0,01 mg/ml de epinefrina infiltrados por vía intramuscular en la zona quirúrgica de cada pierna. Se realiza una incisión a espesor total en la región proximal de cada tibia (Fig. 1c). Se procede a identificar los dos sitios experimentales en cada tibia (Fig. 1d). Lo sitios de implantación se prepararon empleando fresas de diámetro incremental e irrigando con solución salina estéril acorde a la recomendación del fabricante. Se mantuvo una distancia aproximada de 8-10 mm entre las dos osteotomías. Se instalaron aleatoriamente dos implantes con un macro-diseño diferente en cada tibia, y se sumergieron hasta que el hombro del implante se niveló con la superficie del hueso. La porción apical de los implantes se coloca en contacto directo o dentro del hueso cortical opuesto al compartimiento cortical coronal, con el objetivo de obtener un anclaje bicortical. Los tapones de cierre se atornillaron a los implantes y el colgajo se sutura posteriormente por planos, se emplean suturas reabsorbibles para permitir una curación sumergida (Vicryl 5/0, Ethicon, Sommerville, NJ, EE. UU.) y Nylon 3/0 (Ethilon 3/0). , Ethicon, Sommerville, NJ, EE. UU.). -Cuidado pre y postoperatorio, vivienda y cría Todos los animales se mantuvieron en jaulas individuales durante su período de aclimatación antes de la intervención (2 semanas) y durante el cuidado postoperatorio en la Unidad de Servicio de Almacenamiento de Animales de la Universidad de Valencia, España, en habitaciones especialmente acondicionadas y aclimatadas a 21ºC con 12 h de oscuridad/iluminación. Los animales fueron alimentados con una dieta estándar y tuvieron acceso libre a fuentes de agua. El patrón analgésico consistió en 2,5 mg/kg de morfina intraoperatoria, 0,02 mg/kg de buprenodale, buprex, 0,2 mg/kg de meloxicam (cada 12 horas durante 3 días) y tratamiento antibiótico con enrofloxacina 2,5 mg/kg (ALSIR® 2,5%, Esteve Veterinaria, Barcelona, España) (cada 24 horas durante 7 días) después de la operación. -Eutanasia Nueve conejos de cada unos de los tres grupos fueron sacrificados después de 2, 4 y 8 semanas, respectivamente. Se aplicaron los mismos protocolos de sedación y anestesia empleados para la cirugía, la inducción de la eutanasia se realizó con 50 mg/kg de pentobarbital sódico intravenoso. Se usó una pequeña sierra eléctrica para obtener las secciones de la tibia que contienen cada implante. - Preparación histológica. Las muestras de implantes se deshidrataron mediante intercambio secuencial de solventes y se incluyeron en metacrilato que contiene poli-(metil metacrilato). Después de agregar peróxido de benzoilo (1g/100 ml), las muestras se polimerizaron, luego se cortaron con un disco de diamante en una máquina de corte de precisión de mesa Accutom-5 (Struers, Copenhague, Dinamarca), estas se lijaron y pulieron con el sistema de pulido LaboPol-21 (Struers, Copenhague, Dinamarca) y láminas de SiC (SiC foils). Se obtuvieron láminas delgadas de aproximadamente 80 μm de espesor. Las muestras se tiñeron a 55ºC con azul de toluidina durante 30 minutos, se lavaron con agua durante 2 minutos y se dejaron secar. -Evaluación histológica Las imágenes digitales calibradas superpuestas de los tejidos que rodean toda la superficie del implante (aproximadamente 20 imágenes/implante) se registraron con un microscopio de luz Leica DM4000 B (Leica Microsystems GmbH, Wëtzlar, Alemania) y una cámara digital DFC420 utilizando un objetivo 5x y el programa Leica Applications Suite version 4.4.0. Las imágenes individuales se fusionaron para componer cada lado del implante utilizando el programa Photoshop CS 6 (Adobe Photoshop CC 2015.0.0, Adobe Systems Incorporated, San José, CA, EE.UU., http://www.adobe.com/Photoshop). El programa de procesamiento de imágenes ImageJ 1.48 (National Institutes of Health, Bethesda, MD, EE. UU., http://imagej.nih.gov/ij) se utilizó para realizar las mediciones histológicas. Las líneas se dibujaron a mano en imágenes calibradas que se muestran en la pantalla de la computadora con un aumento de 400x, y fue realizado por un asesor independiente y calibrado que no participa en el estudio. El BIC se evaluó como la suma de hueso nuevo y viejo, y se calcularon los porcentajes en relación con la longitud de la superficie del implante examinada. La porción apical del implante que se extruyó más allá de hueso cortical se excluyó del análisis. -Análisis de los datos Las diferencias entre los diseños de implantes a lo largo de los períodos de cicatrización se analizaron con la prueba U de Mann-Whitney para las variables independientes. Las diferencias entre los implantes colocados en la diáfisis y la metáfisis también se realizaron utilizando una prueba de suma de rangos de Wilcoxon. Se realizó un análisis multivariado de modelo lineal general para explorar la interacción entre las dos variables independientes (diseño/posición) sobre los valores BIC en diferentes etapas de curación. Cada factor tiene dos categorías: diseño (Ticare Inhex®/Ticare Quattro® ) y posición (diáfisis/metáfisis). Se eligió este enfoque porque los informes anteriores observaron que las posiciones de los implantes se pueden usar como réplicas independientes con respecto a la variable de resultado, ya que la calidad ósea varía entre los sitios de implantación (sitios topográficos) en el mismo grado que entre las unidades experimentales. El nivel de significancia se estableció en α = 0.05. Resultados: El presente estudio experimental preclínico se realizó siguiendo las directrices de la guía para la conducción de investigación en animales de experimentación (ARRIVE), por lo que la selección y el uso de animales se han considerado cuidadosamente. Para aislar el posible efecto de la macro-geometría del implante en la formación ósea, ambos implantes tuvieron el mismo tratamiento de superficie. Para apreciar el comportamiento de los dos macro-diseños de implantes en dos ambientes óseos diferentes, se colocaron en dos zonas topográficas dentro de la misma tibia, uno con una capa cortical y un contenido medular (diáfisis) similar a un hueso tipo II y la otra con un hueso más trabecular similar a un hueso tipo III (metáfisis). El propósito del estudio fue evaluar el efecto de dos macro-diseños de implantes diferentes, pero con igual rugosidad de la superficie en la osteointegración secuencial de implantes instalados de forma bicortical en la tibia de conejo. Se analizaron los datos de 27 animales experimentales con cuatro implantes cada uno. Las áreas entre las espiras se rellenaron con hueso tejido (woven bone) a las dos semanas. Se observaron procesos de remodelación después de 4 y 8 semanas de cicatrización, evidenciado por la tinción más clara del hueso lamelar en comparación con la tinción más oscura del hueso tejido. A las 2 semanas de cicatrización, se observó un grado similar de nueva osteointegración en ambos macro-diseños, siendo 16.0±7.5% para Ticare Inhex® , y 16.3±7.2% para los implantes Quattro® . Los porcentajes de hueso viejo observados fueron de alrededor de 7.4% y 7.6% para los implantes Ticare Inhex® y Quattro®, respectivamente. Con respecto a la posición del implante (diáfisis o metáfisis), no hubo diferencias significativas entre los parámetros evaluados en esta etapa. Se observaron similares valores de BIC entre los macro-diseños de implantes 23.5±14.4% y 23.9±13.3% para los diseños de implantes Ticare Inhex® y Quattro® , y la ubicación topográfica del sitio de implante con valores BIC de 21.5±7.5 y 25.5±14.6 para diáfisis y metáfisis respectivamente. Ninguna de las diferencias tanto para los macro-diseños como sitios topográficos fueron estadísticamente significativas (p>0.05). A las 4 semanas, los valores de hueso nuevo fueron 19.4±7.3% y 18.9± 4.7% para los diseños Ticare Inhex® y Quattro®, respectivamente. Los porcentajes de hueso viejo en esta etapa fueron 2.3±2.2% y 2.4±1.6%, respectivamente. Al agrupar los datos según la posición del implante en la diáfisis y la metáfisis, no hubo diferencias significativas para los valores de hueso nuevo (p=0.10). Sin embargo, en esta etapa se encontró una diferencia significativa para los valores de hueso viejo y tejido conectivo (p<0.05). Se observaron valores de BIC similares entre los macro-diseños de implantes, pero en relación con la ubicación del sitio topográfico, mejores valores de BIC se observaron en la diáfisis 24,5±6,2% respecto a la metáfisis 18,4±7,7%. Esta diferencia fue estadísticamente significativa (p=0.05). A las 8 semanas, el hueso nuevo aumentó, alcanzando porcentajes de 33.2±7.6% y 33.4±7.7% en los implantes Ticare Inhex® y Quattro®, respectivamente. No se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre los dos grupos (p>0.05). El hueso viejo todavía estaba presente, sin embargo, en porcentajes muy bajos de 1.2±1.1% y 3.3±1.1% para los diseños de Ticare Inhex® y Quattro®, respectivamente (p=0.001). Los porcentajes de hueso nuevo en la diáfisis fueron de 36,4±10,5%, mientras que en la metáfisis de 29.3±6.2%. No se encontraron diferencias estadísticamente significativas (p>0.05). Los valores de BIC observados entre los dos macro-diseños de implantes no mostraron una diferencia significativa, a pesar de que se encontraron valores de BIC ligeramente mejores de 36.7±7.7% a favor de Ticare Quattro® en comparación con el diseño de Inhex® con 34.4±7.8. Sin embargo, con respecto a la colocación del sitio topográfico, se observó un mejor valor de BIC en la diáfisis (39.5±11.1%) comparado a la metáfisis (30.6±6.2%), diferencia que fue estadísticamente significativa (p=0.05). En el análisis multivariado se observó que la posición del implante mostró una significancia estadística con respecto a los valores de BIC a las 4 y 8 semanas (p <0.05). Sin embargo, el análisis no detecta una significancia estadística respecto a la interacción del sitio topográfico y los macro-diseños de implantes (diseño * posición) respecto a los valores BIC durante las etapas de curación. Se observa que el implante Ticare Quattro® mostró valores BIC ligeramente mejores los sitios de diáfisis a través de las etapas de curación (p> 0.05). Otro objetivo fue evaluar el patrón de cicatrización ósea en los compartimentos cortical y medular. Se observó patrones de osificación de tipo intramembranoso y aposicional. Este último se pudo observar cuando se produjo un contacto íntimo entre la superficie del implante y el hueso recién formado en el lecho implantario. En promedio, se identificaron mejores valores de osteointegración en los compartimentos corticales, y valores ligeramente más altos pero no estadísticamente significativos en la diáfisis. Respecto al compartimento medular, se observaron mejores tasas de aposición de hueso nuevo a las dos y cuatro semanas en la diáfisis. A las 2 semanas de cicatrización, no hubo diferencias significativas entre los parámetros evaluados entre los compartimentos cortical y medular en los sitios de diáfisis y de metáfisis. Los valores de BIC fueron de alrededor de 30.0±9.9% versus 23.7±6.4% en la diáfisis y metáfisis, respectivamente en el compartimento cortical (p=0.09), y 21.1±12.3 versus 13.9±8.0 en el compartimento medular (p=0.07). A las 4 semanas, se observaron diferencias significativas en los valores de hueso viejo en el compartimiento cortical, y para los valores de hueso nuevo y tejido conectivo en los compartimentos de la médula entre los sitios de diáfisis y metáfisis. No se detectaron diferencias para los valores de BIC en el compartimento cortical, que reportan ser de 25.4±7.8% y 21.4±8.0% en los sitios de diáfisis y metáfisis, respectivamente (p=0.26). Sin embargo, se encontró una diferencia significativa en el compartimento medular, que muestra valores BIC de 22.1±6.9 y 13.6±8.5 en la diáfisis y metáfisis, respectivamente. Diferencia estadísticamente significativa (p=0.01). A las 8 semanas, se observaron mejores valores de hueso nuevo y viejo en el compartimiento cortical; se detectó una diferencia significativa entre los compartimentos cortical y medular para estos parámetros en la metáfisis. El contacto mineralizado de hueso a implante en esta etapa no mostró diferencias significativas dentro del compartimento cortical entre los sitios de implantación en la diáfisis y en la metáfisis, con valores de BIC% de 41.1±6.8% y 39.9±9.8%, respectivamente (p = 0,61). Se observó una tendencia similar dentro del compartimento medular en los sitios de diáfisis y metáfisis. Discusión: Objetivo del estudio– El objetivo principal de la presente tesis doctoral fue evaluar el impacto de dos macros diseños de implantes distintos instalados de forma bicortical en dos entornos óseos (diáfisis o metáfisis) en tibias de conejo. Además, se analizaron los patrones de curación ósea en los compartimentos cortical y medular en los sitios de diáfisis y metáfisis. Resumen de los principales hallazgos Para aislar el posible efecto de la macro-geometría del implante en la formación ósea, ambos implantes tuvieron el mismo tratamiento de superficie. Para apreciar el comportamiento de los dos macro-diseños de implantes en dos ambientes óseos diferentes, se colocaron en dos zonas topográficas dentro de la misma tibia, una con una capa cortical y un contenido medular (diáfisis) similar a un hueso tipo II y la otra más trabecular similar a un hueso tipo III (metáfisis). En el presente estudio, se encontró que el hueso nuevo después de 2, 4 y ocho semanas de cicatrización fue ligeramente más alto, en los implantes colocados en la diáfisis en comparación con aquellos implantados en la metáfisis, pero sin alcanzar diferencias estadísticamente significativas (p>0.05). Los valores de BIC observados entre los macros diseños de implantes no mostraron una diferencia significativa, aunque se encontraron valores BIC ligeramente mejores en los implantes Ticare Quattro® en comparación con el diseño de Inhex® . Sin embargo, con respecto a la colocación del sitio topográfico, se observó mejores valores de BIC en aquellos implantes colocados en la diáfisis a las 4 y 8 semanas de cicatrización (p=0.05). Se realizó un análisis multivariado de modelo lineal general para explorar la interacción entre las dos variables independientes (diseño/posición) sobre los valores BIC en diferentes etapas de curación. Se observó que la posición del implante mostró una significancia estadística con respecto a los valores de BIC a las 4 y 8 semanas, a favor de aquellos implantados en la diáfisis (p<0.05). Sin embargo, el análisis no detecta diferencias significativas para la interacción entre el macro-diseño y el sitio topográfico (diseño*posición) sobre los valores BIC en todas las etapas de curación. Se observa que el diseño Ticare Quattro® mostró valores ligeramente mejores de BIC en los sitios de diáfisis a través en los distintos periodos de seguimiento (p> 0.05). Por otro lado, se analizó el patrón de curación ósea en los compartimentos corticales y medulares en en los implantes colocados en la diáfisis y en la metáfisis. La nueva formación ósea en el compartimento de la médula mostró valores incrementales levemente mejores del 13.8%, 20.4 y 24.6% a las dos, cuatro y ocho semanas en los sitios de diáfisis, en comparación con el 10,3%, 13% y 25,1% en los sitios de metáfisis. La misma tendencia se observó en el compartimiento cortical con valores de alrededor de 17.8%, 21.4% y 37% en los sitios de diáfisis, respecto a los 15.1%, 19.7% y 35.5% en los sitios de metáfisis. El hueso viejo se reabsorbió pero todavía estaba presente (<2%) después de 1 mes en ambas zonas topográficas. Los valores de hueso viejo observados fueron ligeramente más altos en la diáfisis a las cuatro y ocho semanas en comparación con la metáfisis en la presente muestra de estudio. Los valores de BIC no mostraron diferencias significativas, excepto en el compartimento medular a las cuatro semanas de cicatrización, mostrando valores de BIC de 22.1±6,9 y 13.6±8,5 (p=0,01) en la diáfisis y metáfisis, respectivamente. Discusión con literatura previa– El análisis histomorfométrico a las 2, 4 y 8 semanas fue similar para ambos macro-diseños de implantes (p>0.05). Además, al comparar los porcentajes de hueso nuevo en relación con la ubicación topográfica del implante, se encontró que la osteointegración era ligeramente más alta, pero estadísticamente no significativa en los implantes colocados en la diáfisis en comparación con la metáfisis a las 4 y 8 semanas de cicatrización. Estos hallazgos son contrarios a los reportados en un experimento previo en conejos reportado por Caneva y cols. en 2017. Observaciones que podrían atribuirse a varios factores, como el diseño de espira del implante, el tratamiento de superficie utilizados y los protocolos de osteotomía del implante, que difieren entre los estudios. Se sabe que estos factores pueden regular la tensión aplicada al tejido duro en la proximidad del implante. El hueso viejo se reabsorbió, pero todavía estaba presente después de 1 mes de cicatrización (<4%), con mejores valores estadísticamente significativos en el grupo de Ticare Quattro®. Este patrón de curación es comprable con otros estudios realizados en animales y humanos. Cabe mencionar que la morfología ósea en la diáfisis está ocupada predominantemente por un contenido medular en comparación con la metáfisis que presenta un hueso más trabecular. Estos hallazgos están de acuerdo con el supuesto de que la osteointegración es más rápida en zonas donde la aposición ósea no está precedida por la reabsorción ósea como se observó anteriormente en un estudio preclínico en perros reportado por Abrahamsson y cols., en 2003, y confirmado en cerdos miniatura por Buser y cols. en 2004. Parece probable que la formación de hueso comenzó a partir de los compartimentos corticales (en contacto con hueso nativo mineralizado) y que posteriormente prolifera hacia los compartimentos de la médula. Se sabe que los procesos de resorción se producen antes de una nueva aposición ósea en zonas donde el hueso mineralizado está presente, lo que conlleva un período de curación ligeramente más largo para alcanzar la osteointegración completa. Los implantes en el presente estudio estuvieron en contacto cercano con el hueso prístino debido a su estabilización bicortical, una condición que favorece la osteointegración en la superficie del implante. Un patrón de curación previamente documentado para la osteointegración en diferentes modelos pre-clínicos. El hueso viejo “nativo” del lecho implantario es responsable del enclavamiento mecánico, y es relevante durante la pérdida de la estabilidad primaria del implante, donde tiene lugar una remodelación ósea interfacial mediada por células. Por lo general, se describe que esto ocurre en el área de contacto entre la pared ósea prístina y la superficie del implante, donde la remodelación surge en la proximidad de las micro-fisuras seguidas por una aposición ósea en los espacios vacíos, y que resulta una estabilidad secundaria o biológica. Los resultados del presente estudio están de acuerdo con otros reportes como el de Leonard y cols., en 2009; que demuestra que el macro-diseño no afecta de forma significativa las tasas de BIC en ausencia de carga. Sin embargo, la literatura científica no diferencia las discrepancias con respecto a la posición del implante distintas topografías óseas, específicamente en tibias de conejo, un factor que probablemente puede contribuir a los resultados debido a las discrepancias en la densidad ósea. En este sentido, un informe anterior sugiere que las características del macro-diseño del implante, tales como como el patrón de la espira y el paso de rosca, pueden ser responsables de las diferencias en la cantidad de hueso y el grado de aposición ósea en la superficie del implante. Por lo tanto, la consideración de un macro-diseño de implante específico debe ser en relación con el micro entorno biológico y mecánico, como lo sugiere Vivan-Cardoso y cols., en el 2015. De acuerdo con las observaciones antes mencionadas, el patrón de curación en los compartimentos corticales y medulares fue analizado en profundidad en dos entornos óseos diferentes (diáfisis y metáfisis) en tibias de conejo. A este respecto, en el presente estudio, la nueva formación de hueso en el compartimento medular mostró valores ligeramente mejores en los sitios de implantación en la diáfisis, mostrando valores del 13,8%, 20,4 y 24,6% a las dos, cuatro y ocho semanas, en comparación con los 10.3%, 13% y 25.1% obtenidos en la metáfisis. La misma tendencia se observó en el compartimiento cortical con valores de alrededor de 17.8%, 21.4% y 37% en la diáfisis, comparados a los 15.1%, 19.7% y 35.5% en la metáfisis. Se observa que los valores de hueso viejo observados fueron ligeramente más altos en la diáfisis a las cuatro y ocho semanas en comparación a la metáfisis en la presente muestra de estudio. En el contexto de los sitios topográficos de implantación, nuestros resultados fueron contradictorios con los informados en un estudio previo de Caneva et al. en 2017, donde la nueva formación ósea se desarrolló a una velocidad mucho mayor en los implantes colocados en la metáfisis respecto a la diáfisis. Sin embargo, estas diferencias podrían atribuirse a varios factores, como se mencionó anteriormente. Los autores atribuyeron los hallazgos al patrón más denso del hueso trabecular en la metáfisis en comparación con la diáfisis en tibias de conejo. Por otro lado, la formación ósea que se supone debe ser reforzada por la médula ósea no ocurre, ya que esto apenas contribuyó en la sección media (medular) de los implantes colocados en la diáfisis en comparación con lo que se encontró en las regiones corticales en coronal y apical. Las diferencias metodológicas podrían ser mencionadas para este aspecto. En el estudio de Caneva y cols., en 2017, se demarcaron tres secciones (coronal, media y apical) para probar las diferencias entre los compartimentos en las tibias de conejo. En el presente estudio, las tres secciones se demarcaron de la misma manera, pero el compartimiento cortical se considera como la suma de las regiones corticales y apicales en su conjunto, independientemente del compartimiento medular (centro). Aunque, en ambos estudios, las regiones extremas de los implantes estuvieron en contacto cercano con el hueso prístino debido a su estabilización bicortical. Por otro lado, es posible concluir que la osteointegración parece favorecerse por la existencia de un coágulo sanguíneo, y perjudicada por la presencia de la médula ósea de grasa amarilla en el modelo de hueso largo, como la tibia de oveja. En este sentido, Morelli y cols., en 2014 realizan dos osteotomías para la instalación de implantes en cada tibia. En los sitios de control, no se realizaron tratamientos adicionales mientras que, en los sitios de prueba, se extrajo la médula ósea del sitio de la osteotomía con una cureta que excedía las dimensiones del implante. Como resultado, la porción apical de los implantes en los sitios de control estaban en contacto con la médula ósea mientras que, en los sitios de prueba, estaba en contacto con el coágulo de sangre. En promedio, la nueva aposición ósea fue mejor en el compartimiento cortical, como se observa en el presente estudio. Además, se observó que la nueva aposición ósea fue más rápida en el grupo con médula ósea grasa en comparación con los grupos con coágulos de sangre en el compartimento medular a las 4 semanas pero sin alcanzar significancia estadística. Sin embargo, los autores concluyen de que los coágulos sanguíneos parecen favorecer la osteointegración, ya que a las 12 semanas de cicatrización, el grupo de prueba mostró mejores valores de hueso nuevo, y que fueron estadísticamente significativos en el compartimento medular, aunque en este estudio los implantes no se colocaron de forma bicortical. Sin embargo, a pesar de las diferencias inter-especies que impiden las comparaciones directas, no existe certeza hasta qué punto el modelo de tibia de conejo, en su diáfisis, proporciona cantidades de médula ósea grasa que pueden afectar la osteointegración después de las ocho semanas de cicatrización. Ventajas, limitaciones y recomendaciones para estudios futuros– Este estudio se realizó de acuerdo con las directrices de ARRIVE que fomentan las buenas prácticas y la calidad de los informes en experimentación animal. La novedad del presente trabajo radica en el hecho de que no hay otro estudio que tenga como objetivo evaluar el impacto de distintos macro-diseños de implantes con similar tratamiento de superficie (RBM de rugosidad moderada) en dos ambientes óseos diferentes sobre los valores de osteointegración y los patrones de curación en los compartimientos corticales y medulares en tibias de conejo. Esto nos permite aislar los efectos del macro-diseño en la osteointegración, lo que nos ayuda a evaluar por separado la dinámica del patrón de curación en distintas densidades óseas. Sin embargo, debido a la ausencia de carga funcional, estos parámetros reflejan la conexión estructural entre el implante y el hueso, y no las propiedades funcionales del hueso a la interfaz del implante. Existe poca evidencia preclínica con respecto a la curación secuencial de los implantes instalados de forma bicortical con dos macro-diseños y tratamiento de superficie igual, intentando evaluar su interacción en dos sitios topográficos. A pesar de que se evaluó la interacción de los factores, solo el sitio topográfico parece contribuir a los valores de osteointegración a las 4 y 8 semanas. Lamentablemente, es difícil determinar en qué medida cada macro-diseño de implante contribuye a estos hallazgos observados en los sitios de diáfisis o metáfisis. La muestra escasa no permite una adecuada comparación estadística. Cabe mencionar, que los resultados de la interacción son meramente exploratorios y deben interpretarse con cautela. Es de suma importancia tener en cuenta que los resultados actuales solo podrían extrapolarse a implantes con la misma rugosidad de la superficie, su aplicabilidad está fuera del alcance para otros modelos animales debido a las diferencias que se mostraron en los patrones de curación entre las especies (por ejemplo, perros, ovejas, conejos, rata). Se justifican estudios adicionales que comparen el tratamiento de superficies iguales pero con diferentes enfoques de fabricación (p.ej. superficies SLA, anodizadas, etc.), para dilucidar si reproduce los patrones observados en el presente trabajo. Además, no hay datos concretos sobre hasta qué punto el modelo de tibia de conejo, en su diáfisis, proporciona cantidades de médula ósea grasa que pueden afectar la osteointegración después de las ocho semanas de cicatrización. Por lo tanto, sería interesante aislar su efecto en un estudio posterior para confirmar esta hipótesis en el modelo de tibia de conejo. Se requieren estudios adicionales con un tamaño de muestra mayor para responder a estos aspectos, pero este es un desafío difícil, teniendo en cuenta los aspectos éticos y económicos que pueden estar involucrados en la consideración de los criterios de reemplazo, refinamiento o reducción (3R) para el uso animales en investigación. Conclusiones– En resumen esta tesis concluye que: I. El patrón de osteointegración secuencial de las superficies RBM en el modelo de conejo fue satisfactorio. II. Los macros-diseños de implantes no afectan significativamente el proceso de osteointegración en ausencia de carga en las etapas de cicatrización. III. La morfometría y la densidad ósea pueden afectar la aposición ósea sobre la superficie del implante. Las tasas de aposición fueron ligeramente mejores en la diáfisis en comparación a los sitios topográficos de metáfisis. Los valores de BIC fueron significativamente más altos a las 4 y 8 semanas en la diáfisis. IV. No hay interacción entre el macro-diseño del implante y el sitio topográfico, como lo muestra el análisis multivariado. Sin embargo, se observó que el macro-diseño de implante Ticare Quattro® mostró valores BIC ligeramente mejores en los sitios de diáfisis a través de las etapas de curación. V. La nueva aposición ósea fue mejor en el compartimento cortical comparado al compartimento medular. Las tasas de aposición fueron ligeramente mejores tanto en los compartimentos corticales y medulares en la diáfisis comparado a la metáfisis.