Crohn’s disease (CD) is a chronic gastrointestinal inflammatory disorder with an unknown aetiology with alternating periods of relapses and remissions. The transmural involvement of CD leads to complications, such as strictures or fistulas, that often require surgery. Fibrosis is usually detected in CD and is characterized by a dysregulation of the equilibrium between the production and the degradation of the extracellular matrix. There is no effective treatment for intestinal fibrosis in CD, which makes a better understanding of the etiopathogenesis of CD essential. GWAS studies have revealed single nucleotide polymorphisms (SNP) in different genes associated with CD. Among them, TaqI SNP in the vitamin D receptor (VDR) gene has been reported as a risk factor for CD. VDR is a member of the nuclear receptor family of transcription factors, and vitamin D constitutes its main ligand. VD deficiency and defective signalling have been reported in CD patients. In recent years, PDIA3 has emerged as a vitamin D receptor. The aim of this work was to analyse the relevance of genetic polymorphisms and the VD/VDR/PDIA3 pathway in CD complications. First, we detected that homozygosity for the C allele in CD patients was associated with reduced VDR protein levels and higher expression of IL-1β in PBMCs, as well as an elevated lymphocyte activation and a higher probability of deriving towards a penetrating phenotype. We also observed a lower expression of VDR and a higher expression of PDIA3 in intestinal resections and in isolated intestinal fibroblasts from CD patients vs controls. PDIA3 levels correlated with COL1A1 levels in intestinal tissue, and down-regulation of the PDIA3 receptor in control fibroblasts was associated with decreased COL1A1 expression and increased VDR protein levels. In addition, a reduced expression of VDR and an increase in PDIA3 were detected in fibroblasts from control subjects who were homozygous for the C allele in the TaqI SNP of VDR, providing strong evidence of a crosstalk between the two VD receptors. VD treatment increased VDR protein levels in control fibroblasts. VD also induced a slight increase in VDR expression and a decrease in PDIA3 in fibroblasts isolated from the damaged mucosa of CD patients. Finally, the systemic treatment of mice with VD prevented intestinal fibrosis induced by the heterotopic transplant model. The effects of VD were mediated by modulation of the immune system and a direct action of VD on intestinal fibroblasts. In summary, this study demonstrates reduced VDR protein levels in PBMCs and fibroblasts from CD patients carrying the TaqI SNP of the VDR gene, and shows that these patients are more prone to develop a penetrating phenotype. VD increased VDR and decreased PDIA3 expression in intestinal fibroblasts from CD patients, which correlates with a reduced expression of markers of fibrosis. These effects may be involved in the anti-fibrotic effect of VD demonstrated in the in vivo murine model.La Enfermedad Inflamatoria Intestinal (EII) comprende un grupo de enfermedades crónicas que cursan con inflamación y afectan al tracto gastrointestinal. Están caracterizadas por periodos de brotes y de remisiones clínicas. Aunque su causa es desconocida, se sabe que las complejas interacciones entre factores inmunológicos, microbianos, ambientales, nutricionales y genéticos juegan un papel importante en su etiología. Las dos principales manifestaciones son la Enfermedad de Crohn (EC) y la Colitis Ulcerosa (CU). Aunque comparten características, son patologías claramente diferenciadas. La CU se asocia con inflamación y ulceraciones en las capas mucosa y submucosa principalmente del colon. La EC puede aparecer en cualquier parte del tracto gastrointestinal de forma discontinua y la inflamación es asimétrica y transmural, formando granulomas no necróticos y fístulas. La mayoría de los pacientes con EC debutan con un fenotipo considerado inflamatorio (B1 en la clasificación de Montreal). Sin embargo, la inflamación subclínica presente en los periodos de remisión de la EC lleva en muchas ocasiones a complicaciones de la enfermedad como pueden ser estenosis (patrón estenosante o B2 en la clasificación de Montreal) y fístulas o abscesos (patrón penetrante o B3 en la clasificación de Montreal), que frecuentemente requieren de cirugía. Ambos patrones se caracterizan por la presencia de fibrosis intestinal. Este proceso es esencial en la cicatrización de la herida, un mecanismo fisiopatológico de reparación que conduce al depósito de diferentes proteínas en la matriz extracelular (MEC, red de macromoléculas extracelulares formadas por colágeno, glicoproteínas y enzimas, cuyo objetivo es proporcionar soporte a las células circundantes). Sin embargo, el desequilibrio entre la producción y la degradación de estas proteínas puede convertirse en una fibrogénesis incontrolada y persistente, causando un depósito excesivo de la MEC. Las citocinas, las quimiocinas y diversos tipos celulares como los fibroblastos están implicados en el proceso de fibrogénesis intestinal, que incluye la activación de miofibroblastos y otras células productoras de colágeno, la producción de TGF-β1, el daño celular, el reclutamiento de células inflamatorias y la producción de especies reactivas de oxígeno (ERO). La EII puede ser considerada una enfermedad global con diferente prevalencia e incidencia en el mundo. Inicialmente, su incidencia se encontraba en los países más desarrollados, sin embargo, en los últimos años cada vez es más frecuente en países de Asia o el este de Europa. Los factores principalmente implicados en el desarrollo de la EII son elementos ambientales como el tabaco, la dieta o el estrés sumado a una alteración en la microbiota intestinal y en la respuesta inmune que lleva a una disrupción en la barrera intestinal y a un fallo en la defensa contra los microbios intestinales. La penetración de las bacterias en el contenido luminal, estimula respuestas del sistema inmunitario adaptativo promoviendo procesos inflamatorios crónicos, causando los daños característicos de la EII. El componente genético también ha sido ampliamente estudiado en la EII como un factor etiológico de la enfermedad. Un pequeño porcentaje de los pacientes con EII poseen historia familiar de la enfermedad y se ha demostrado que el riesgo de padecerla depende del grado de parentesco. Se han descrito más de 50 genes que predisponen a padecer EII. Gracias a estudios de asociación del genoma completo (GWAS) se han descubierto numerosas variaciones genéticas asociadas a la EII. La mayoría de estas variaciones implican el cambio en una sola base del ADN, son llamadas polimorfismos de nucleótido simple (SNP). El primer y más estudiado gen con susceptibilidad a la EC es un receptor de reconocimiento de patrones, llamado dominio de oligomerización por unión de nucleótidos que contiene la proteína 2 (NOD2). Además de incrementar el riesgo de sufrir la enfermedad, mutaciones en NOD2 están asociadas a pacientes con una EC ileal, estenótica y con enfermedad perianal. La mayoría de los genes implicados pertenecen a procesos relacionados con la EII, como la regulación de la respuesta inmune, la barrera intestinal o la autofagia. Entre ellos se ha descrito un polimorfismo genético en el receptor de la vitamina D, VDR como factor de riesgo para sufrir la enfermedad de Crohn, el rs731236 o TaqI. Este polimorfismo consiste en el cambio de una citosina por una timina en la secuencia de ADN en el exón 9 del gen VDR, lo que no produce ninguna alteración en la secuencia de aminoácidos de la proteína, es sinónima. La vitamina D (VD) o colecalciferol, es una hormona secoesteroide con funciones paracrinas y autocrinas esenciales en el metabolismo del calcio y la mineralización ósea. Esta forma es una pro-hormona no activa que se puede sintetizar bajo la acción de los rayos ultravioleta u obtenerse de la dieta. El colecalciferol sufre dos hidroxilaciones, una en el hígado y otra en los riñones, antes de convertirse en su metabolito activo, el calcitriol. Esta molécula se une al VDR que es un factor de transcripción perteneciente a la familia de receptores nucleares. Una vez en el citosol, VDR forma un heterodímero con el receptor X retinoide y se une al elemento de respuesta a hormonas (HRE) en el ADN, dando lugar a la expresión o trans-represión de determinados genes. La proteína disulfuro-isomerasa A3 (PDIA3), una isomerasa que actúa como chaperona en el plegamiento de proteínas, también se ha descrito como receptor de la Vitamina D. Existe una clara relación entre la Vitamina D y la EII. Diversos estudios describen niveles más bajos de esta vitamina en los pacientes con EII, especialmente con EC. Además, los pacientes deficitarios en Vitamina D poseen un mayor riesgo de incremento en la actividad clínica y de cirugías. En modelos murinos de colitis en ratones deficitarios de VDR se ha descrito una colitis más severa y mayor mortalidad. Con todo esto, la asociación entre esta vitamina y la enfermedad es clara, sin embargo, los mecanismos celulares y moleculares detrás de estos efectos todavía se desconocen. OBJETIVOS El objetivo general de este trabajo es analizar la relevancia de los polimorfismos genéticos y los efectos de la vía VD/VDR en las complicaciones de la EC. Los objetivos específicos son: Analizar la relación que poseen diferentes SNP en genes relacionados con la EC, con las características clínicas de los pacientes con EC, evaluar la influencia de SNP TaqI en el gen VDR en las características clínicas de los pacientes con EC así como, en el curso clínico de la enfermedad, determinar los efectos que tiene en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de pacientes con EC el SNP TaqI de VDR en: la expresión de VDR, en las citocinas inflamatorias y en la activación de linfocitos, evaluar la influencia de la EC en la expresión de VDR, PDIA3 y COL1A1 en resecciones intestinales humanas, analizar los efectos del SNP TaqI de VDR en el gen VDR en la expresión de VDR, PDIA3 y COL1A1 en fibroblastos intestinales humanos, estudiar la influencia de la EC y los efectos de la vitamina D en la expresión de VDR y PDIA3 en fibroblastos intestinales humanos y caracterizar los efectos de la vitamina D en la fibrosis intestinal murina. METODOLOGÍA Y RESULTADOS Relación entre las características clínicas de los pacientes de EC y los diferentes SNP en genes relacionados con la enfermedad. Los pacientes con EC y los controles fueron genotipados y las frecuencias genotípicas se analizaron para diferentes SNPs en genes relacionados con procesos relevantes en la patogénesis de la EII. En los SNP de los genes de NOD2, LAMB1 y ECM1 el genotipo homocigoto para el alelo de riesgo fue significativamente más frecuente en pacientes con EC que en los controles. El análisis de asociaciones entre las características clínicas de la enfermedad y el genotipo, a excepción de rs731236 en el gen VDR, no mostró ninguna relación significativa y relevante con la localización o el comportamiento en la EC. Sin embargo, algunas tendencias no significativas como, por ejemplo, en el SNP del gen CDH1 o del gen LAMB1, el genotipo considerado como de riesgo, podría asociarse con pacientes con EC que poseen un mejor pronóstico. El SNP rs731236 en el gen VDR está asociado con niveles disminuidos de proteína en PBMCs y con un patrón en la EC penetrante (B3). Los pacientes con EC homocigotos para el alelo C de riesgo en el SNP rs731236 o TaqI fueron diagnosticados a una edad más temprana, lo que es indicativo de un peor pronóstico de la enfermedad. Además, los pacientes con este genotipo exhibieron un mayor riesgo de tener un fenotipo de la enfermedad penetrante (B3) así como de sufrir cirugía. Esta asociación no se observó cuando los pacientes tenían una fístula perianal. Cuando se analizaron las frecuencias genotípicas del TaqI SNP entre pacientes con EC y donantes sanos se demostró que los pacientes con EC que presentan un fenotipo de comportamiento B3 eran significativamente más propensos a ser homocigotos para el alelo C que los controles, lo que reforzó la observación obtenida en la población de pacientes. El SNP TaqI no altera la secuencia de aminoácidos de la proteína VDR, es una mutación sinónima. Por ello, el primer análisis fue observar si el polimorfismo cambiaba la expresión de VDR. Para este propósito, el análisis se realizó en dos muestras diferentes. Primero, se genotiparon para el TaqI SNP dos líneas celulares de monocitos diferentes, y se detectó que la línea celular THP1 poseía un genotipo TT, por el contrario, los monocitos U937 eran genotipo CC. Aprovechando los genotipos de estas células, se analizó el ARNm de VDR y los resultados mostraron una reducción significativa en las células THP1. Sin embargo, las células U937 expresaron niveles más altos de citocinas proinflamatorias que los monocitos THP1. Posteriormente, se analizaron los niveles de ARNm y proteína VDR en PBMCs de pacientes con genotipo TT y CC. Los resultados no mostraron cambios en los niveles de ARNm de ninguno de los grupos de pacientes. Como el SNP se encuentra en el extremo 5' del exón 9 en el ARNm de VDR, estudiamos si podría estar afectado el proceso de splicing y que el cambio de base generara una proteína truncada o no funcional. Sin embargo, el análisis por PCR usando cebadores para amplificar una región entre los exones 7 y 9 reveló el mismo producto de PCR en muestras de pacientes con genotipos TT y CC. Al realizar el análisis de los niveles de proteína VDR, sí se observaron diferencias, los pacientes homocigotos C mostraron niveles más bajos de esta proteína en comparación con el otro grupo. La disminución de la expresión de la proteína VDR en pacientes con EC homocigotos para el alelo C llevó a investigar los niveles de citocinas pro-inflamatorias en las PBMC de estos pacientes. Cuando los datos se expresaron en relación a los de donantes sanos, los pacientes con genotipo CC exhibieron un aumento en la expresión de ARNm de IL1-β, IL-8, IL-18, IFN-γ y TNF-α. Con esto, se decidió analizar el factor de transcripción NFκB. En los extractos citosólicos de PBMC de pacientes con EC, los niveles de proteína IκBα fueron más bajos en pacientes homocigotos para el alelo C que en aquellos homocigotos para el alelo T. Además, los pacientes con 2 alelos C presentaron niveles más altos de la proteína NFκB p65 en el núcleo, lo que indica un aumento de la translocación nuclear. Tomados en conjunto, los datos sugieren que la disminución de los niveles de proteína VDR en pacientes con EC con 2 copias del alelo C de riesgo en el SNP rs731236 lleva a un aumento tanto de la activación de la vía de señalización de NFκB como de la expresión de citocinas pro-inflamatorias en las PBMC. Por último se analizó, por citometría de flujo, sangre entera de pacientes de ambos genotipos. Los resultados mostraron un incremento en los niveles de las integrinas CD11a, CD11b y CD49d en linfocitos de los sujetos CC. Además, la expresión de CD62L (L-selectina) en este tipo de células fue significativamente menor en pacientes CC que en aquellos con el genotipo TT, lo que es indicativo de una mayor interacción de leucocitos con células endoteliales. En conclusión, estos resultados indican que los pacientes con EC homocigotos para el alelo C en el SNP TaqI llevan asociados niveles reducidos de proteína VDR y una mayor expresión de IL-1β en PBMC, mayor activación de linfocitos y un mayor riesgo de derivar hacia un fenotipo penetrante. Niveles inferiores de VDR en resecciones intestinales de pacientes con EC Después del análisis de VDR en PBMC, la investigación se centró en el tejido intestinal, la estructura afectada en la EC. El análisis de los niveles de proteína VDR mostró una disminución significativa tanto en el tejido intestinal como en las criptas epiteliales de pacientes con EC en comparación con tejido control. Paralelamente, también se observó una disminución en la expresión de ARNm de VDR y un aumento en la expresión de ARNm de PDIA3 y COL1A1 en el tejido de pacientes con EC en comparación con el tejido de control. Finalmente, los resultados mostraron una correlación significativa entre el ARNm de COL1A1 y la expresión del ARNm de PDIA3 en el intestino de pacientes con EC. Esta disminución de VDR en pacientes también se observó en el análisis inmunohistoquímico de los cortes histológicos. No se detectaron diferencias significativas en la expresión de la proteína VDR entre los diferentes fenotipos de la enfermedad. Existe una acción cruzada entre VDR y PDIA3 en fibroblastos intestinales humanos Se obtuvieron fibroblastos intestinales de resecciones intestinales de pacientes control y se transfectaron con un ARN pequeño de interferencia (ARNip) de PDIA3. Se consiguió reducir en un 80% la expresión del ARNm de PDIA3, así como una ligera reducción en los niveles de proteína PDIA3. En estas condiciones, los resultados mostraron un aumento significativo tanto en los niveles de ARNm como de proteína de VDR en paralelo con una disminución significativa en la expresión de ARNm y proteína de COL1A1. Los fibroblastos aislados fueron cultivados 24 horas y 7 días. Los fibroblastos cultivados durante 7 días expresaron niveles de ARNm significativamente más altos de VDR, PDIA3 y COL1A1 en comparación con 24 h. Estos fibroblastos cultivados 7 días fueron genotipados y clasificados según el genotipo para TaqI y aquellos homocigotos para el alelo C presentaban una expresión reducida de la proteína VDR, así como niveles aumentados de PDIA3 y COL1A1 en comparación con las células que portaban el alelo T. Esta clasificación por genotipo también se llevó a cabo en monocitos obtenidos de PBMC de donantes sanos. Estas células se polarizaron con IFN-γ, lo que indujo un aumento en la expresión de la proteína VDR en los macrófagos que portaban el alelo T, que no se detectó en los macrófagos que portaban el alelo C. La menor expresión de VDR detectada en las células CC, iba en paralelo con una mayor expresión de IL-1β e IL-6. Bajos niveles de proteína VDR, tanto basales como estimulados por vitamina D, se detectan en fibroblastos de pacientes con EC Se obtuvieron fibroblastos de resecciones intestinales de pacientes con EC tanto de la zona dañada como de la zona no dañada del paciente. Al analizar la expresión proteica de VDR, los niveles fueron significativamente más bajos en las células obtenidas de la mucosa dañada por la EC que en los fibroblastos tanto del tejido no dañado del mismo paciente con EC como de los fibroblastos control. También se detectó una reducción significativa en la expresión de ARNm de un gen diana de VDR, el CYP24A1, en fibroblastos de pacientes en comparación con los controles. No se detectaron cambios significativos en los niveles de proteína de PDIA3 y COL1A1 entre los diferentes fibroblastos analizados. El tratamiento con vitamina D, aumentó significativamente los niveles de proteína VDR en los fibroblastos control y también en fibroblastos obtenidos del tejido no dañado de pacientes con EC, pero solo causó una ligera acumulación de VDR en fibroblastos del tejido dañado de los pacientes con EC. Por el contrario, la vitamina D disminuyó significativamente los niveles de proteína PDIA3 en fibroblastos de la mucosa dañada mientras que no lo hizo en fibroblastos control. La expresión de ARNm de VDR, PDIA3, COL1A1, COL3A1 y α-SMA no fue significativamente diferente entre los fibroblastos control y los fibroblastos obtenidos de pacientes con EC, pero los niveles de MMP2 fueron significativamente más altos en los fibroblastos del tejido no dañado de pacientes. El tratamiento con vitamina D aumentó ligeramente los niveles de ARNm de VDR en todas las células analizadas y también indujo un aumento significativo en la expresión de ARNm de PDIA3 y COL1A1 en fibroblastos obtenidos de la parte dañada del paciente con EC mientras que no modificó la expresión de COL3A1, α-SMA o MMP2. Sin embargo, se detectó una correlación positiva y significativa entre la expresión de ARNm de PDIA3 y COL1A1, así como entre la expresión de ARNm de PDIA3 y COL3A1, tanto en fibroblastos tratados con vehículo como con vitamina D. Del mismo modo, se detectaron correlaciones significativas entre la expresión génica de VDR y marcadores de fibrosis; MMP2 se correlacionó positivamente y α-SMA negativamente, con los niveles de ARNm de VDR. Se realizaron experimentos para evalúan la capacidad de migración y proliferación de los fibroblastos. Los resultados demostraron que, tras 48 horas, los fibroblastos procedentes de la zona dañada de pacientes con EC migran más rápido que las células control. Por otro lado, el tratamiento de estas células procedentes de pacientes con EC con vitamina D, disminuyó su tasa de migración. La vitamina D es capaz de reducir la fibrosis intestinal en un modelo murino Finalmente, analizamos los efectos del tratamiento con vitamina D sobre la fibrosis intestinal en un modelo in vivo, mediante el uso de un trasplante heterotópico de un trozo de colon de ratón. La evaluación de la expresión de VDR en el modelo de fibrosis reveló que los injertos intestinales obtenidos 7 días después del trasplante mostraron una disminución significativa en los niveles de proteína VDR en comparación con los injertos intestinales en el día 0. Además, estos injertos de 7 días mostraron un aumento en la expresión de proteínas de COL1A1 y la relación pSTAT3 / STAT3. Se administraron diferentes dosis diarias de vitamina D (1 μg / kg ó 2 μg / kg, i.p.) o su vehículo a ratones receptores y se obtuvieron sus injertos 7 días después del trasplante. El análisis histológico del colon mostró una disminución en la deposición de colágeno y una arquitectura histológica preservada en los injertos de colon obtenidos de ratones tratados con vitamina D en comparación con los ratones tratados con vehículo. El tratamiento con vitamina D a la dosis de 1 μg / kg no alteró significativamente la expresión de ARNm de ninguno de los marcadores analizados, pero a la dosis de 2 μg / kg, la vitamina D redujo significativamente la expresión de ARNm de Col1a1 y Pdia3 mientras que no modificó significativamente la expresión de Vdr. Se detectó un aumento leve pero no significativo en la expresión proteica de VDR en injertos intestinales de ratones tratados con vitamina D, pero encontramos una ligera disminución en los niveles de proteína PDIA3 en paralelo con niveles de proteína significativamente más bajos de COL1A1 en injertos de ratones tratados con 2 μg / kg de VD. Estos injertos también exhibieron una reducción significativa en los niveles de proteína vimentina en comparación con los injertos de ratones tratados con vehículo. Además, se detectó una correlación significativa y positiva entre la expresión de ARNm de Pdia3 y Col1a1. El tratamiento con vitamina D no alteró significativamente la infiltración de macrófagos según lo analizado por la expresión de ARNm de F4/80. Sin embargo, ambas dosis de vitamina D alteraron el fenotipo de macrófagos y el perfil inflamatorio en comparación con el vehículo. Se detectó una disminución significativa en la expresión de ARNm de Cd86 en paralelo con una disminución significativa en la expresión de ARNm de Il-6, mientras que se observaron diferencias no significativas en la expresión de ARNm de Tgf-β. En resumen, nuestro estudio demuestra niveles reducidos de proteína VDR en PBMC y fibroblastos aislados de pacientes con EC que son homocigotos para el alelo C en el gen VDR, lo cual va asociado con una mayor activación de estas células y una predisposición de estos pacientes hacia un comportamiento penetrante en la EC. Además, los datos también muestran que la vitamina D aumenta VDR y disminuye PDIA3 en fibroblastos intestinales de pacientes con EC, lo que se correlaciona con una expresión reducida de marcadores de fibrosis. Estos resultados apoyan firmemente que los pacientes con EC se beneficiarían del valor terapéutico anti-fibrótico de la vitamina D, claramente demostrado en modelos experimentales. Son necesarios estudios adicionales destinados a conocer los efectos de la vitamina D en pacientes con EC con el polimorfismo TaqI en el gen VDR para así, comprender mejor la relevancia que tendría el genotipar para este SNP de VDR en la decisión del médico a la hora de recetar suplementos de vitamina D a pacientes con EC. CONCLUSIONES 1. Los pacientes con EC homocigotos para el alelo C en el SNP TaqI del gen VDR mostraron: a) Niveles reducidos de proteína VDR y mayor expresión de citocinas proinflamatorias en PBMC. b) Mayor activación de linfocitos. c) Disminución en los niveles de proteína VDR en fibroblastos intestinales. d) Mayor riesgo de desarrollar un comportamiento penetrante en la EC. 2. En fibroblastos humanos intestinales existe una acción cruzada independiente de VD entre VDR y PDIA3 que regula la expresión de COL1A1. 3. La EC está asociada con niveles disminuidos de proteína VDR en resecciones intestinales, células epiteliales y fibroblastos intestinales los cuales exhibieron una alta tasa de migración. 4. El tratamiento con VD aumenta los niveles de proteína VDR y disminuye la expresión de la proteína PDIA3 en fibroblastos de pacientes de EC. Ambas situaciones se correlacionan con marcadores de fibrosis reducidos. 5. El tratamiento con VD previno la fibrosis intestinal en un modelo murino. 6. Teniendo en cuenta los resultados en las muestras humanas y los experimentos in vivo, nuestros datos respaldan que los pacientes con EC se podrían beneficiar del valor terapéutico antifibrótico de la VD.