Lung cancer is the most frequent cancer and the leading cause of cancer death worldwide, and specifically non-small cell lung cancer (NSCLC) comprises more than 80% of cases. Currently, the most commonly used drugs in this type of cancer are chemotherapeutics; however, the acquisition of resistance to these compounds greatly limits the effectiveness of the treatments. Inside the different cell populations present in the tumor microenvironment are the cancer stem cells (CSCs), responsible for proliferation and differentiation, these cells have latent capacity and little response to the treatments currently used in clinical practice, therefore, responsible for recurrences. The main objective of this work is to identify new compounds, more effective for the inhibition of the population of cancer stem cells in non-small cell lung cancer. For this purpose, in vitro tumorspheres formation is used as an approximation of enriched cells in properties of cancer stem cells, from 12 cell lines (H23, H358, H460, H1395, H1650, H1975, H1993, H2228, A549, PC9, SW900 and HCC827) and 7 primary cultures (FIS299, FIS302, FIS303, FIS315, FIS317, FIS320 and FIS343) derived from resected NSCLC tumors from patients. The tumorspheres were used as in vitro pharmacological screening platforms of 11.280 compounds belonging to the Prestwick and Myria libraries, identifying three compounds (DSF, JMM 1-3 and JMM 1-4) with statistically significant inhibitory capacity (p <0.05) against tumorspheres, compared with data obtained in cells grown in monolayer. Proving that these 3 drugs induce apoptosis by activating the ROS-p38 MAPK signalling pathway and are capable of inhibiting MMP9, a gene involved in the development of distant metastases. Subsequently, in vivo assay supported the results in vitro, demonstrating the antitumor capacity of these selected compounds, by reducing tumor volume in xenografts induced with NSCLC tumorspheres. However, more studies would be lacking for the characterization of other possible pathways activated or inhibited by these drugs, as possible mechanisms of action involved in the inhibition of lung tumorspheres with CSCs properties. The future steps could be to try to implement these compounds as possible new inhibitors of lung CSCs, alone or in combination with conventional treatments.El cáncer de pulmón es el tumor con mayor mortalidad a nivel mundial, y en concreto el cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) comprende más del 80% de los casos. Actualmente, los fármacos más empleados en este tipo de cáncer son los quimioterápicos; sin embargo, la adquisición de resistencia a estos compuestos limita en gran medida la eficacia de los tratamientos. Dentro de las diferentes poblaciones celulares presentes en el microambiente tumoral se encuentran las células madre tumorales (CMTs), encargadas de la proliferación y diferenciación, estas células tienen capacidad de latencia y poca respuesta a los tratamientos empleados actualmente en la práctica clínica, por tanto, responsables de las recidivas. El objetivo principal del presente trabajo es identificar nuevos fármacos, más eficaces para la inhibición de la población de células madre tumorales en cáncer de pulmón no microcítico. Para ello, se emplea la formación de tumoresferas in vitro como aproximación de células enriquecidas en propiedades de células madre tumorales, a partir de 12 líneas celulares (H23, H358, H460, H1395, H1650, H1975, H1993, H2228, A549, PC9, SW900 y HCC827) y 7 cultivos primarios (FIS299, FIS302, FIS303, FIS315, FIS317, FIS320 y FIS343) derivados de tumores de CPNM resecados de pacientes. Las tumoresferas se emplearon como plataformas de cribado farmacológico in vitro de 11.280 compuestos pertenecientes a las quimiotecas Prestwick y Myria, identificando mediante ensayos de viabilidad celular tres compuestos (DSF, JMM 1-3 y JMM 1-4) con capacidad inhibitoria estadísticamente significativa (p < 0.05) frente a las tumoresferas, en comparación con los datos obtenidos en las células crecidas en adherencia. Demostrando que estos 3 fármacos inducen apoptosis mediante la activación de la vía de señalización ROS-p38 MAPK y son capaces de inhibir MMP9, gen implicado en el desarrollo de metástasis a distancia. Posteriormente, el ensayo in vivo corroboró los resultados in vitro, demostrando la capacidad antitumoral de estos compuestos seleccionados, al reducir el volumen tumoral en xenografts inducidos con tumoresferas de CPNM. Sin embargo, faltarían más estudios para la caracterización de otras posibles vías activadas o inhibidas por estos fármacos, como posibles mecanismos de acción implicados en la inhibición de las tumoresferas de pulmón con propiedades de CMTs, para en un futuro intentar implementar estos fármacos como posibles nuevos inhibidores de CMTs de pulmón, solos o en combinación con los tratamientos convencionales.