NAGIOS: RODERIC FUNCIONANDO

Genetic analysis of familial Alzheimer’s disease, primary lateral sclerosis and paroxysmal kinesigenic dyskinesia: a tool to uncover common mechanistic points

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Genetic analysis of familial Alzheimer’s disease, primary lateral sclerosis and paroxysmal kinesigenic dyskinesia: a tool to uncover common mechanistic points

dc.contributor.advisor	Pérez Tur, Jordi
dc.contributor.author	Szymanski, Jacek Pawel
dc.contributor.other	Facultat de Ciències Biològiques	es_ES
dc.date.accessioned	2021-03-12T09:01:52Z
dc.date.available	2021-03-13T05:45:05Z
dc.date.issued	2021	es_ES
dc.date.submitted	25-03-2021	es_ES
dc.identifier.uri	https://hdl.handle.net/10550/78249
dc.description.abstract	Las enfermedades neurológicas pueden tener un amplio espectro de fenotipos, causando interrupciones en las actividades de la vida diaria y, a menudo, una enfermedad progresiva que termina en la pérdida de la vida. Los mecanismos moleculares que subyacen a muchas de estas enfermedades pueden tener vías comunes y, dependiendo del gen en cuestión, su disfunción puede llevar a una variedad de condiciones. La enfermedad de Alzheimer (EA) es la demencia neurodegenerativa más común en el mundo, con una estimación de 50 millones de personas que viven con demencia en todo el mundo. Los síntomas de la EA incluyen dificultad para recordar nombres o eventos recientes, apatía, depresión , desorientación, confusión, dificultad de hablar, caminar y tragar. La división canónica de la EA en inicio temprano (EOAD por sus siglas en inglés) e inicio tardío (LOAD por sus siglas en inglés) se establece en los 65 años de edad. Ambos se caracterizan por agregados de proteína tau hiperfosforilada intracelular llamados ovillos neurofibrilares (NFT por sus siglas en inglés) y placas seniles extracelulares compuestas principalmente por grupos de péptido amiloide-β (Aβ). La patología de EA comienza en la corteza entorrinal, una región del lóbulo temporal medial, y causa la muerte de las neuronas provocando la atrofia del tejido cerebral. La EA es una enfermedad multifactorial con un patrón de herencia dicotómico. Aproximadamente el 70 % de las causas son genéticas y el resto ambientales. Mutaciones en los genes: APP, PSEN1 y PSEN2, son las causas más comunes de EOAD y el alelo ε4 de APOE es un factor de riesgo bien establecido de LOAD. Tres vías principales contienen la mayoría de los factores de riesgo genéticos de EA: la respuesta inmune, el metabolismo lipídico y la endocitosis. Entre los genes involucrados en la respuesta inmune, CR1 se ha asociado con la EA mediante estudios de asociación de todo el genoma (GWAS por sus siglas en inglés). CR1 forma un parte importante del sistema del complemento y es significativo para este trabajo. Una isoforma de CR1, CR12, se expresa en niveles más bajos que la isoforma CR11 y se especula que provoca un menor aclaramiento de Aβ y una desregulación del sistema del complemento. La esclerosis lateral primaria (ELP) se considera una parte del espectro patológico de la esclerosis lateral amiotrófica (ELA). La ELA, aunque se considera una enfermedad rara, es la enfermedad de la neurona motora (ENM) más común. La ELP se caracteriza por la espasticidad espinobulbar causada por la degeneración de las neuronas motoras superiores (NMS), mientras que la ELA se caracteriza por la degeneración tanto de las NMS como de las neuronas motoras inferiores (NMI) a nivel espinal y bulbar, lo que causa parálisis de las extremidades, disartria, disfagia y muerte por insuficiencia respiratoria. Características clínicas de ELP incluyen la espasticidad, ligera debilidad en las extremidades inferiores, inicio en adultos, curso progresivo, duración de más de 4 años y los síntomas seudobulbares. Los déficits cognitivos y conductuales pueden ocurrir con ELA, que van desde la demencia leve, moderada a la demencia frontotemporal (DFT) que también se observó en pacientes con ELP. La base genética de la ELP no se conoce bien, aunque se conocen mutaciones en los genes SPG7 y TBK1 en pacientes afectados por ELP familiar. Las mutaciones en el gen SOD1, que codifica una enzima antioxidante, y en la proteína codificada por el gen C9orf72 son las causas más comunes de ELA. La patogenia de la ELA puede ser causada por excitotoxicidad del glutamato, disfunción mitocondrial, alteración de la estructura o transporte en los axones y estrés oxidativo. La discinesia paroxística cinesigética (PKD por sus siglas en inglés), el trastorno del movimiento paroxístico más común, se caracteriza por una variedad de movimientos involuntarios desencadenados por movimientos repentinos. Con inicio en la niñez o adolescencia, sus características clínicas incluyen ataques recurrentes que involucran corea, atetosis, posturas distónicas o balismo. La gravedad de estos ataques suele disminuir con la edad. Las mutaciones en el gen PRRT2 son, hasta ahora, la única causa conocida de este trastorno. Se sabe que PRRT2 interactúa con las proteínas SNAP-25, SYT1 y SYT2 en la membrana presináptica de las neuronas, que participan en la señalización en las células nerviosas. La falta de PRRT2, a menudo causada por la vía de degradación del ARN mensajero mediada por mutaciones terminadoras (NMD por sus siglas en inglés), debido a codones de terminación prematura (PTC por sus siglas en inglés) en el transcripto, es el mecanismo molecular común involucrado en la haploinsuficiencia que causa PKD. Objetivos El objetivo principal de este trabajo es comprender la etiopatogenia de tres enfermedades neurológicas que afectan a tres familias españolas distintas y estudiar los mecanismos genéticos y moleculares que afectan a estas enfermedades. Materiales y métodos Se recogieron muestras de ADN de miembros de tres familias españolas: UGM037 (11 individuos) afectados por EA, UGM471 (7 individuos) afectados por ELP y UGM478 (7 individuos) afectados por PKD. También se dispone de una población de control de individuos sanos y otra de individuos afectados por EA disponible. Las muestras se recogieron con la aprobación de los Comités de Ética en la Investigación de los hospitales correspondientes con el consentimiento informado firmado por los pacientes. La cepa bacteriana utilizada para todas las manipulaciones necesarias fue Escherichia coli DH5α y la línea celular humana fue SH-SY5Y. La secuenciación del exoma completo (WES por sus siglas en inglés) se utilizó como herramienta para identificar variantes dentro del exoma de los pacientes. A través de “base-calling” y análisis de imágenes, alineación de lectura y “SNP calling”, los datos podrían transformarse en una base de datos viable de variantes. Se utilizó el filtrado y la priorización seguida de la validación de secuenciación de Sanger de los resultados para identificar las variantes más interesantes, posiblemente involucradas en la causa de las enfermedades. Para la evaluación de variantes se utilizaron bases de datos públicas como Collaborative Spanish Variant Server (CSVS) o Genome Aggregation Database (gnomAD). La frecuencia de la variante también se verificó mediante PCR específica de alelo (ASPCR por sus siglas en inglés) realizada en las poblaciones de control. Después de identificar las variantes más interesantes, se realizaron manipulaciones de plásmidos para obtener ADNc, correspondientes a secuencias de los genes con estas variantes, en vectores de expresión específicos. Se utilizó mutagénesis dirigida para la introducción de variantes de un solo nucleótido (SNV por sus siglas en inglés), el epítopo FLAG y sitios de restricción enzimática. La subclonación se utilizó para transferir ADNc específicos a los correspondientes vectores de expresión. El análisis in silico se realizó utilizando los servicios web HOPE, I-Mutant 2.0 y ConSurf. De esa forma se pudo establecer la influencia de una variante específica en la función y estabilidad de la proteína. También el grado de conservación de los residuos. En el caso de genes implicados en la EA, conocer los genotipos de APOE y CR1 es importante y se realizó mediante PCR. En el caso de APOE, la PCR fue seguida por restricción enzimática y análisis del patrón de bandas en un gel de agarosa. En el caso de CR1, la PCR fue seguida por secuenciación de Sanger o análisis de presencia o ausencia de bandas en un gel de agarosa. Las células SH-SY5Y se mantuvieron en un medio de crecimiento completo y se utilizó el reactivo de transfección Lipofectamine 2000 para transfectarlas con plásmidos correspondientes a experimentos específicos. Un experimento consistió en comparar los niveles de ARNm y proteínas de genes específicos afectados por las variantes identificadas. En otro, se realizó la misma comparación después de la inhibición de la vía NMD, usando NMDI14. Para medir los niveles de ARNm, se extrajo el ARNm de células SH-SY5Y transfectadas después de aproximadamente 48h de incubación y se obtuvo el ADNc mediante retrotranscripción. Estos se utilizaron en PCR cuantitativa (qPCR por sus siglas en inglés) con cebadores diseñados específicamente para amplificar el producto de la transcripción reversa con controles apropiados. Para medir los niveles de proteína, las proteínas se extrajeron de las células SH-SY5Y transfectadas después de aproximadamente 48h de incubación y se usaron para el análisis por Western Blot (WB). El gen constitutivo de actina se utilizó como control. Para el análisis funcional de las distintas variantes de ADPRH, las proteínas se extrajeron de las células SH-SY5Y transfectadas y se sometieron a purificación utilizando una columna de afinidad de proteínas marcadas con GST. Después de la diálisis y concentración de la muestra, las proteínas podrían usarse para un ensayo de actividad. Esto implicó la ADP-ribosilación del sustrato por la toxina del cólera (CT) seguida de la hidrólisis de este enlace por ADPRH y sus variantes. Las muestras se cargaron luego en una columna de cromatografía líquida de ultra rendimiento (UPLC por sus siglas en inglés) que permitió la separación, identificación y cuantificación de los componentes basándose en los datos de un detector que mide la absorbancia a 260 nm. También se utilizó co-inmunoprecipitación con extractos de proteínas de células SH-SY5Y cotransfectadas con ADPRH y ADPRHL1 para determinar si tiene lugar la interacción proteína-proteína. El análisis estadístico se realizó utilizando la prueba t de Student y ANOVA unidireccional o bidireccional para comparar las diferencias entre las medias de los grupos, con una prueba post hoc de Tukey de comparaciones múltiples de medias. Se utilizó el software R para realizar las pruebas. Resultados y discusión La filtración, priorización y validación mediante secuenciación Sanger identificó la variante rs764542666 en el gen CR1 que codifica un PTC c.C406T p.R136* (CR1R136) como la causa probable de EA en la familia UGM037. Los datos clínicos sugirieron LOAD en la familia, que estaría más en consonancia con los factores de riesgo que con las mutaciones causales. Los miembros de la familia poseían el alelo APOE ε4, sin embargo, sorprendentemente, el análisis de la familia reveló que un miembro con un genotipo APOE ε4/ε4 y una edad de 88 años no presentaba alteración cognitiva alguna. La variante CR1R136 segrega con la enfermedad en el pedigrí, y no aparece en ninguno de los miembros sin EA. Estudios anteriores mostraron que la isoforma CR12 de CR1, asociada con un mayor riesgo de LOAD, se expresaba menos que CR11. Según esto, el tránscrito de CR1R136* podría causar un efecto similar al activar el NMD y causar sí haploinsuficiencia. El estudio de los niveles de ARNm y proteínas reveló que CR1R136* se expresa en niveles más bajos que el tipo silvestre. Estos niveles aumentaron significativamente después del tratamiento con inhibidor de NMD, lo que sugiere la participación de esta vía en la degradaciódel transcrito CR1R136. El genotipado de la isoforma CR12 y rs3818361 en CR1 en muestras de la familia UGM037, mostró que ninguno de ellos tenía isoforma CR12 y rs3818361 no se segregó con la enfermedad, no estando presente en ninguna de las muestras de pacientes. Ambos fueron genotipados, ya que se describieron previamente como asociados con la EA. La isoforma CR12, como se mencionó anteriormente, se expresa a niveles más bajos que CR11, por lo que posiblemente afecte un aclaramiento de Aβ más bajo y una desregulación del sistema del complemento. El rs3818361 fue genotipado para verificar si puede ser el verdadero culpable de la enfermedad, estando en desequilibrio de ligamiento con CR1R136. Los hijos de los pacientes y el miembro de la familia sano, no fueron diagnosticados con EA, sin embargo, sus muestras de ADN se recolectaron entre las edades de 50 y 57. Pueden estar en riesgo de desarrollar la enfermedad a una edad posterior, especialmente porque todos excepto uno de ellos tenía una copia del alelo APOE ε4. Además, tres de siete de ellos tenían la variante CR1R136. Aunque la sobreexpresión in vitro de una proteína en un modelo celular tiene sus limitaciones, el mecanismo molecular detrás de la EA en la familia UGM037 parece ser la haploinsuficiencia causada por la destrucción del transcripto CR1R136 por la vía NMD. Son necesarios más estudios funcionales sobre los efectos de CR1R136* y un seguimiento futuro de los miembros más jóvenes de la familia. Según mi conocimiento, CR1R136* (rs764542666) sería la primera mutación causante de EA conocida en el gen CR1. Los datos clínicos disponibles respaldaron el diagnóstico de ELP en miembros de la familia UGM471. A través de la priorización y filtración de datos de WES y la validación por secuenciación de Sanger, se identificaron dos variantes que posiblemente podrían causar los síntomas en la familia. Uno era una nueva variante c.G884C p.R295P en ADPRH (ADPRHR295P) y el otro era una mutación c.T497C p.L166P previamente descrita en PSEN1 (rs63750265; PSEN1L166P). Este último fue descubierto recientemente dentro del genoma de la familia UGM471, por lo que se discutirán cronológicamente, a partir del descubrimiento. La ADPRH es una proteína ubicua que se encuentra en el citoplasma de ratones y humanos. ADPRH hidroliza el enlace N-glicosídico entre la arginina y la ADP-ribosa, escindiendo la ADP-ribosa del sustrato en el ciclo de ADP-ribosilación. La reacción resulta ser específica para sustratos mono-ADP-ribosilados, debido a la estructura de la proteína. El ciclo de ribosilación de ADP es muy importante para la regulación celular. El variante ADPRHR295P se prevé que sea perjudicial por SIFT y Polyphen. No se encontró en ninguna base de datos pública y la secuenciación de Sanger confirmó su segregación con la enfermedad en el pedigrí de la familia UGM471. Sin embargo, dos individuos sanos de esta familia también portaban ADPRHR295P. La evaluación de la frecuencia de ADPRHR295P por ASPCR en la población de control, mostró que ninguno de los 196 individuos que no eran afectedos por ELP eran portadores. Se encontró que la arginina en la posición 295 en ADPRH era un residuo conservado y un cambio a una prolina podría afectar la función o estabilidad de la proteína de manera significativa. La reevaluación de los datos de WES mostró un parálogo de ADPRH, ADPRHL1 afectado por una variante ADPRHL1L294R, que también se predice que es perjudicial. Esta variante se segrega con la enfermedad en la familia, no estando presente en los individuos sanos. Se especula que ADPRH junto con ADPRHL1 están implicados en el ensamblaje de filamentos de actina y la modulación de la polimerización de actina puede estar implicada en la interrupción del transporte nucleocitoplasmático que es importante en la patogénesis de la ELA. Así, la variante ADPRHR295P puede tener una penetrancia baja, provocando la enfermedad solo en ciertos miembros de la familia, o puede ir acompañada de la variante ADPRHL1L294R, para afectar a los pacientes. La coinmunoprecipitación no mostró una interacción entre las dos proteínas, sin embargo, pueden funcionar al unísono sin una interacción directa. El ensayo de actividad para ADPRHR295P, donde se usó CT para ADP-ribosilar un sustrato y ADPRH de tipo silvestre (ADPRHWT) y sus variantes (ADPRHR295P y ADPRHD55A/D56A) se usaron para hidrolizar la ADP-ribosa, mostró que ADPRHR295P tenía una eficiencia de actividad similar a la del ADPRHWT. La variante ADPRHD55A/D56A, en la que se cambiaron los residuos esenciales del sitio activo, no mostró actividad hidrolasa. Aunque este ensayo no mostró disminución de la actividad de la variante ADPRHR295P, no tuvo en cuenta el posible efecto desestabilizador de la variante. El ensayo RT-qPCR para medir los niveles de ARNm de esta variante mostró que no variaban del tipo silvestre, sin embargo, los niveles de proteína medidos con WB demostraron ser significativamente más bajos que los del ADPRHWT o para otras variantes examinadas (ADPRHR295Q, ADPRHD55A/D56A). Solo la variante ADPRHR295* que se ha descrito previamente, demostró tener niveles de ARNm muy bajos y no pudo detectarse ninguna proteína. Esto sugiere que puede verse afectado por la vía NMD. Si bien es difícil decir si la variante de ADPRHR295P afecta la enfermedad en la familia UGM471, es importante conocer su fuerte efecto sobre la estabilidad de la proteína para el estudio adicional de la mono-ADP-ribosilación poco estudiada. La mutación c.T497 C p.L166P en PSEN1 (rs63750265) se descubrió recientemente en la familia UGM471. Aunque las mutaciones en PSEN1 comúnmente causan EOAD, ha habido informes que asocian PSEN1 con ELP y ELA. PSEN1A431E y PSEN1L381V son dos ejemplos de mutaciones asociadas con ELP y EA, que provocan un inicio temprano alrededor de los 40 años de edad. Se sabe que la mutación PSEN1L166P causa EA y paraparesia espástica a una edad temprana, siendo el primer caso encontrado en una niña de 15 años. También se encontró que otras mutaciones en la posición L166 en PSEN1 estaban asociadas con la EA (PSEN1L166V, PSEN1L166R (rs63750265), PSEN1L166H (rs63750265) y PSEN1L166del (rs63751458)). La mayoría de ellos se asociaron con deterioro cognitivo, aunque algunos se asociaron con síntomas motores. La mutación PSEN1L166P causa pérdida parcial de función de escisión de la γ-secretasa y aumenta la proporción Aβ42/Aβ40 mediante la reducción de los niveles de Aβ40. Además, PSEN1 funciona formando canales de fuga de Ca2+ del retículo endoplásmico (RE), y la mutación PSEN1L166P interrumpe esa función. El descubrimiento reciente de la mutación PSEN1L166P en la familia UGM471 no permitió una investigación más exhaustiva de sus efectos, pero se confirmó que se segrega con la enfermedad en el pedigrí. La naturaleza agresiva de esta mutación, la edad temprana de aparición y los síntomas motores, sugieren fuertemente que es PSEN1L166P el que causa la enfermedad en la familia. Si bien no está asociado con ELA ni ELP, los pacientes también pueden haber sido afectados por otros factores ambientales o genéticos para producir este fenotipo. Al mismo tiempo, existen informes de pacientes con ELP con mutaciones en PSEN1. O el efecto de las mutaciones de PSEN1 es lo suficientemente heterogéneo como para causar estos diferentes trastornos, los trastornos están mucho más relacionados debido a los mecanismos moleculares que los causan, o el efecto de la mutación de PSEN1 se ve afectado por la interacción con otras proteínas. Ciertamente, los genes comunes relacionados con la neurodegeneración deben considerarse al identificar una posible causa de una enfermedad, independientemente de la enfermedad con la que estén asociados. Los pacientes con ELP, ELA o paraparesia espástica deben ser investigados para detectar mutaciones en PSEN1. En PKD, la filtración, priorización y validación de secuenciación de Sanger identificaron una nueva variante c.C316T p.Q106* en PRRT2 (PRRT2Q106) como la causa probable de la enfermedad en la familia UGM478. Los datos clínicos de la familia apoyan el diagnóstico de PKD. La evaluación de los resultados de WES conduce a una fuerte sospecha de PRRT2Q106 como mutación causante de la enfermedad. Las mutaciones en PRRT2 son la única causa conocida de PKD hasta el momento y, a menudo, son mutaciones truncadas que conducen a una haploinsuficiencia debido a la destrucción del transcripto portador de PTC por la vía NMD. PRRT2Q106* no se encontró en ninguna base de datos, por lo que los únicos datos de frecuencia se obtuvieron a través de nuestro ensayo ASPCR para una población de control de 192 muestras. Ninguno de ellos portaba esta variante, sin embargo, se segregó con la enfermedad en el pedigrí, no estando presente en ninguno de los miembros de la familia que no tenían PKD. De acuerdo con los resultados previos, se encontraron niveles de ARNm significativamente más bajos para las variantes con PTC (PRRT2Q106, PRRT2Q163, PRRT2Q250), en comparación con el tipo silvestre (PRRT2WT), en un modelo celular con PRRT2 y sus variantes sobreexpresadas. PRRT2Q163 y PRRT2Q250* se eligieron como controles, siendo variantes descritas previamente en PRRT2. La inhibición de la ruta NMD, por el tratamiento de células SH-SY5Y transfectadas con NMDI14, aumentó los niveles de ARNm para PRRT2Q106* y PRRT2Q163* y mostró una tendencia creciente para PRRT2Q250. Esto sugiere que la vía de la NMD puede ser la culpable de la desintegración del ARNm provocada por las PTC en las variantes estudiadas. Curiosamente, los niveles de proteína de la nueva variante PRRT2Q106 eran indetectables con WB antes y después del tratamiento con NMDI14, mientras que las otras variantes estudiadas (PRRT2Q163* y PRRT2Q250) tenían niveles de proteína significativamente más bajos que el PRRT2WT antes del tratamiento y niveles aumentados después. Esto puede deberse a que las regiones ricas en prolina son importantes para la estabilidad de la proteína, ya que PRRT2Q106 tiene una PTC antes de esa región y PRRT2Q163* y PRRT2Q250* en el medio y después de ella. Estos resultados sugieren que la nueva variante PRRT2Q106* es probablemente la causa de PKD en la familia española UGM478. Los mecanismos moleculares responsables de la aflicción pueden ser la vía NMD que causa la degradación del transcripto que conduce a la haploinsuficiencia. La falta de PRRT2 a su vez provoca hiperexcitabilidad a través de la liberación desregulada de neurotransmisores y la hiperactividad de los canales de Na+. Mecanismos moleculares patológicos comunes, o relacionados, pueden afectar diversos trastornos neurológicos tradicionalmente considerados como no relacionados, en la intrincada red del sistema nervioso. En este trabajo he esbozado algunos de esos supuestos mecanismos. Variantes de un solo nucleótido que pueden afectar a diferentes fenotipos a través de la pérdida parcial de función debido a la desestabilización de proteínas o la haploinsuficiencia debida a NMD. El número estimado de genes haploinsuficientes humanos es 12,443 de aproximadamente 22,000. Si bien el número total de genes humanos es un tema de debate y estudio adicional, su estimación indica que podemos esperar un gran número de genes en los que el efecto de la dosis del nivel de proteína puede ser esencial. La haploinsuficiencia es importante en los trastornos neurológicos. Recientemente se descubrió que C9orf72 es haploinsuficiente en ELA/DFT debido a la expansión repetida de GGGGCC. En este trabajo, postulo que CR1 y PRRT2 son haploinsuficientes en familias españolas con EA y PKD respectivamente. Si bien está establecido que la mayoría de las mutaciones en PRRT2 conducen a la pérdida de función y a la haploinsuficiencia, según mi conocimiento, no existen tales informes sobre CR1. La haploinsuficiencia, por tanto, surge como un factor común entre estas y otras enfermedades neurológicas. Además, el mecanismo molecular detrás de la haploinsuficiencia relacionada con CR1 y PRRT2 parece ser la NMD provocada por SNV que codifican PTC, lo que demuestra un mecanismo molecular común en distintas enfermedades neurológicas. La pérdida de función está estrictamente relacionada con la haploinsuficiencia, que es un fenotipo dominante en organismos heterocigotos para tales alelos. Aunque no se encontró que la variante PSEN1L166P (rs63750265) causara haploinsuficiencia, afecta una pérdida parcial de la función de escisión de la γ-secretasa y la función del canal de fuga del Ca2+ del RE. Se muestra que la variante ADPRHR295P, identificada en la misma familia, desestabiliza significativamente la proteína, afectando drásticamente sus niveles. Esto, a su vez, puede obstaculizar su función. Queda por ver si la variante ADPRHR295P en hererocigosis es, de hecho, deletérea, dependiendo de su tolerancia a la dosis de proteína disminuida. Sin embargo, la pérdida de función, ya sea total o parcial, engloba los mecanismos moleculares subyacentes de los SNV descritos en este trabajo, que contribuyen a enfermedades neurológicas independientes. Al discutir los mecanismos moleculares en EA y ELP en las dos familias españolas, y la participación de las variantes CR1R136* ( rs764542666 ) y PSEN1L166P (rs63750265) en la patogénesis de las enfermedades, es importante no omitir otros factores posiblemente contribuyentes. Si bien CR1R136* puede ser una mutación causal en la familia, sus miembros tenían una alta incidencia de APOE ε4. En familias con mutaciones de APP, la incidencia de APOE ε4 se relacionó con una edad de inicio más temprana, mientras que la incidencia de APOE ε2, con una edad de inicio más tardía, con respecto a APOE ε3. Curiosamente, la variante PSEN1E318G está relacionada con un mayor riesgo de EA, que depende de APOE ε4. Si bien, por lo demás, PSEN1E318G se consideró no patógeno, su interacción con APOE ε4 aumentó la deposición de Aβ, provocando un deterioro cognitivo más rápido y una neurodegeneración. Así, si bien portar la variante CR1R136* puede ser suficiente para desarrollar EA, también es probable que los miembros de la familia española estudiados estuvieran afectados únicamente por el factor de riesgo APOE ε4 o una combinación de ambos. De manera similar, otros factores, ya sean ambientales o genéticos, pueden afectar los síntomas desarrollados por la familia con ELP. Aunque PSEN1L166P parece ser responsable del fenotipo experimentado por los pacientes, sus síntomas difieren de las características más canónicas de la EA relacionadas con esta variante. Esta expresión divergente de la enfermedad puede deberse a la pleiotropía del gen PSEN1, sin embargo, también puede deberse a otros factores contribuyentes. Se ha descubierto que los factores ambientales juegan un papel importante en la ELA y no se pueden ignorar en una enfermedad familiar. Aquí propongo un factor genético que puede contribuir a los distintos síntomas que experimentan los miembros de esta familia. La nueva variante ADPRHR295P puede tener un efecto sobre el desarrollo de la enfermedad, desestabilizando los filamentos de actina en presencia de la variante ADPRHL1L294R, provocando un fenotipo más cercano a ELP, junto con la mutación agresiva PSEN1L166P. La complejidad de las enfermedades neurológicas proviene, en parte, de la naturaleza acumulativa de los defectos que las provocan, por lo que siempre es fundamental buscar otro factor que pueda contribuir al fenotipo observado. Se necesitan más estudios sobre los efectos que las variantes de ADPRH pueden tener sobre las enfermedades neurológicas, ya que contribuye a la mono-ADP-ribosilación aún poco conocida, pero muy importante. Las limitaciones generales de la sobreexpresión in vitro de una proteína en un modelo celular se aplican a todo el estudio. Diferencias entre el modelo celular y las células correspondientes en el organismo, problemas para establecer un microambiente apropiado, como interacciones con otras células, o el hecho de que la proteína se sobreexpresa artificialmente en cantidades naturalmente no disponibles. Pueden ser necesarios más estudios funcionales para todas las variantes descritas. Para concluir, la variante rs764542666 en el gen CR1 que codifica un PTC c.C406T p.R136* es la causa probable de la EA en una familia española UGM037, basado en WES y estudio de la expresión genética. La haploinsuficiencia provocada por la vía NMD de CR1 es el probable mecanismo molecular detrás de la enfermedad. La variante rs764542666 es probablemente la primera mutación causante de EA conocida en CR1, lo que fomenta la investigación de las raras variantes truncadas en este gen. El mutante rs63750265 en el gen PSEN1 que codifica una mutación c.T497C p.L166P es la causa probable de ELP en una familia española UGM471, según el estudio WES, análisis de segregación y conocimientos previos, lo que plantea dudas sobre los efectos pleiotrópicos de la mutación. Los mecanismos moleculares detrás del mutante rs63750265 que causa la enfermedad en la familia UGM471 son probablemente la pérdida de la actividad de la γ-secretasa, el aumento de la relación Aβ42/Aβ40 y el deterioro de la función del canal de fuga de Ca+2 del RE. La nueva variante en el gen ADPRH que codifica una variante c.G884C p.R295P desestabiliza fuertemente la proteína sin afectar su función, arrojando luz sobre el estudio de la mono-ADP-ribosilación. La nueva variante en el gen PRRT2 que codifica un PTC c.C316T p.Q106* es la causa probable de PKD en una familia española UGM037, según el estudio de expresión genética y WES. Este trabajo apoya la hipótesis de que la vía de NMD provoca la haploinsuficiencia de PRRT2, como mecanismo molecular detrás de la PKD.	es_ES
dc.format.extent	270 p.	es_ES
dc.language.iso	en	es_ES
dc.subject	alzheimer's disease	es_ES
dc.subject	amyotrophic lateral sclerosis	es_ES
dc.subject	paroxysmal kinesigenic dyskinesia	es_ES
dc.subject	whole exome sequencing	es_ES
dc.subject	nonsense mediated mRNA decay	es_ES
dc.title	Genetic analysis of familial Alzheimer’s disease, primary lateral sclerosis and paroxysmal kinesigenic dyskinesia: a tool to uncover common mechanistic points	es_ES
dc.type	doctoral thesis	es_ES
dc.subject.unesco	UNESCO::CIENCIAS DE LA VIDA	es_ES
dc.embargo.terms	0 days	es_ES