The genus Vibrio is comprised several species that are ubiquitous in the water ecosystems around the world. A great variety of this species are pathogenic for humans, like V. cholerae and V. vulnificus, this species are able to vibriosis infections, and are considered to be an important public health issue, some examples of these are V. vulnificus is a highly heterogeneous species, which has been classified in 5 distinct lineages and a pathovar, the pv. piscis. This pathovar includes a zoonotic clonal complex that can cause vibriosis in fish thanks to the pVvbt2, which confers the bacteria to ability to sequester iron and evade the immune response of teolost fish. In addition to this, the bacteria counts with other virulence factors e such as enzymes, toxins, capsule and bacterial appendages that enable the cell to be motile, adhere to several substrates and produce biofilms. One of this appendages is the flagellum which is involved in swimming motility, however, it is also involved in virulence by enabling survival and invasion and colonization inside the host. Other types of appendages called pili also have indispensable roles in pathogenesis, such as adhesion, biofilm production and DNA uptake. A Special subfamily of pili, called Type IV pili are versatile molecular nanomachines that are directly involved in motility, formation of biofilm and virulence. Two of Type IV pili systems are known to be important for several vibrio species, these are the MSHA and Tad pili. The aim of this work was to assess the role in biofilm and virulence of the flagella and these two Type IV pili systems, in a representative strain of the zoonotic clonal complex of V. vulnificus. To this end we created a library of mutants in essential genes of these bacterial appendages, and tested them in several in vivo, ex vivo and in vitro experiments. First we analyzed the three distinct major pilin subunit genes of the MSHA pili, and found out that only the mshA-1 gene is necessary for biofilm formation, adhesion to biotic and abiotic surfaces, and virulence in eels by helping in initial colonization of the gills. On the other hand, mshA-2 and mshA-3 seem to have no function at all. Then, we observed that a functional flagella is necessary for virulence in eels through water, as aflagellated mutant was deficient in virulence for eels. Finally, after assessing the virulence and biofilm production capabilities of the three distinct tad loci that exists within the genome of the zoonotic clonal complex, we concluded that the three functional pili are needed to exert a significative role in biofilm production, while they play no part in virulence or evasion of the eel immune system. The synergistic action of the three tad loci could be needed to confer an added adhesive power to the one of the MSHA pili, in order to favor adhesion to gills, initial colonization and virulence in eels. In conclusion, this thesis reveals new roles in biofilm production and virulence from two Type IV pili system, as well as from the flagellum in the zoonotic clonal complex of V. vulnificus. This suggests that, even though there are previous reports of different functions of these mechanisms in other species belonging to the same genus, and even same species, no generalization should be made. Moreover, this implies that role of previously studied virulence factors may vary depending on the specific environment and host related to the bacteria.Las bacterias del género Vibrio, compuesto por mas de 100 especies, están presentes en la gran mayoría de los ecosistemas acuáticos alrededor del mundo. Estas bacterias son gram-negativas, aeróbicas y anaeróbicas facultativas, y cuentan con al menos un flagelo polar. Se pueden encontrar tanto como un organismo de vida libre en el agua, como habitando superficies bióticas y abióticas en forma de agregaciones inmóviles llamadas biofilms. Una gran cantidad de especies pertenecientes a este género son patógenas para los humanos, dentro de las cuales, las tres más importantes son, V. cholerae, V. parahaemolyticus, y V. vulnificus, debido a su elevada tasa de incidencia y gravedad de las infecciones causadas por ellos. V. vulnificus es considerado como un agente zoonótico de gran importancia para la salud publica. Esta especie fue descrita en los años 70 por diversos estudios, debido a que fue encontrada al mismo tiempo en pacientes septicémicos en los Estados Unidos, y en aislados de anguilas pertenecientes a granjas de acuicultura en Japón. Inicialmente esta bacteria fue clasificada dentro de un género totalmente diferente, pero consecuentes pruebas relacionadas con sus características fenotípicas y metabólicas lo llevaron a ser clasificado dentro de el genero Vibrio y finalmente denominado como V. vulnificus en 1979. Tras varios análisis genómicos, se demostró que los aislados procedentes de pacientes septicémicos y anguilas enfermas eran de la misma especie, aunque demostraban algunas diferencias fenotípicas. Esto llevó a los autores de dichos análisis a proponer una clasificación de la especie en 3 biotipos diferenciados por sus características metabólicas y especificidad de hospedador. Dentro de estos biotipos, el biotipo 2 (Bt2) agrupaba varias cepas aisladas de anguilas, las cuales contaban con características serológicas casi idénticas, y por lo cual fueron designadas como serovar E (SerE). Con el paso del tiempo, se describieron otras serovares provenientes de anguilas, aunque estas resultaron ser menos virulentos para las mismas anguilas y para ratones, y por consiguiente, la SerE fue denominada como un agente causante de la vibriosis humana, el cual tenía la capacidad de infectar tanto humanos como peces, convirtiéndolo en un complejo zoonótico clonal. Esta habilidad infectiva hacia peces es concedida por el plásmido de virulencia pVvBt2, el cual se encuentra en todas las cepas de este biotipo, y confiere los mecanismos necesarios para resistir al sistema inmune de los peces. Debido a la alta heterogeneidad de la especie, esta clasificación de biotipos esta siendo revisada actualmente y se han propuesto, tras varios análisis genómicos, la implementación de una nueva taxonomía basada en 5 linajes diferentes, incluyendo una patovariedad denominada piscis, cuya característica representativa es la posesión del pVvbt2. Esta patovariedad incluye todos los aislados virulentos para peces, incluyendo el complejo zoonótico clonal, cuya cepa representativa es la CECT 4999, comúnmente denominada R99 en las colecciones de laboratorio. Esta cepa fue aislada en 1999 a partir de anguilas europeas enfermas, y es la cepa usada en este estudio. Su genoma consta de dos cromosomas, uno de un tamaño relativamente grande y otro más pequeño, en el cual se encuentran la mayor parte de los genes relacionados con virulencia. Por otro lado, el plásmido cuenta con una gran cantidad de genes identificados previamente, así como varias proteínas hipotéticas, y como ya se menciono antes, los genes necesarios para infectar a peces. V. vulnificus es capaz de causar una variedad de sintomatologías, que en conjunto se denominan vibriosis, tanto en peces como en humanos. Esta enfermedad está caracterizada por diferentes síntomas que varían dependiendo de la ruta de entrada e infección del patógeno. Algunas de las manifestaciones clínicas causadas por la vibriosis son, necrosis, gastroenteritis, fascitis y en el peor de los casos, septicemia fulminante, la cual conlleva la muerte. En humanos la vibriosis se puede contraer mediante la ingesta de mariscos contaminados, o mediante la exposición de heridas a agua o animales marinos portadores de la bacteria. Personas que padecen enfermedades crónicas como cirrosis, hepatitis, cáncer e inmunodeficiencias son 80 veces mas propensos a sufrir una septicemia fulminante causada por V. vulnificus. Cabe resaltar que, las patologías del hígado causan elevados niveles de hierro en la sangre, y se ha demostrado que esta característica es sumamente favorable para las infecciones causadas por este patógeno. Afortunadamente, las infecciones causadas por V. vulnificus son relativamente raras, sin embargo, en los Estados Unidos, se ha estimado que mas de 80,000 personas contraen vibriosis cada año, de las cuales aproximadamente 500 casos resultan en hospitalizaciones y 100 de ellos en muerte. Esto ocurre debido a que, existen co-morbilidades que afectan al resultado de la infección. En peces, la vibriosis puede ocurrir en dos modalidades causadas por la SerE, la modalidad de agua dulce y de agua salobre. Los signos clínicos mas comunes asociados a la vibriosis de peces son lesiones externas en el abdomen, ano, opérculo, ulceras y abdomen inflamado, mientras que internamente se presenta inflamación intestinal, palidez del hígado e inflamación del riñón. Igual que en humanos, los casos septicémicos en peces presentan una gran probabilidad de muerte. Este patógeno es capaz de causar una septicemia fulminante debido a sus diversos factores de virulencia, que le confieren a la capacidad de infectar a peces y humanos a través de diversos mecanismos. Desafortunadamente, estos factores de virulencia aun no se conocen en su totalidad, por lo que actualmente siguen siendo estudiados. La producción de vibriosis por este patógeno es un proceso multifactorial que se logra mediante la acción sinérgica de diversos mecanismos celulares, los cuales permiten a la bacteria ser motil, adherirse a diferentes superficies, producir biofilms, sobrevivir la acción bactericida del sistema inmunitario, adquirir hierro dentro del hospedador y producir enzimas citotóxicas y citolíticas. En peces, la patovar piscis, mediante el pVvbt2, produce dos importantes proteínas, la Ftbp y la Fpcrp, que confieren la habilidad de secuestrar el hierro de la sangre, y de resistir las acciones bactericidas del complemento y la fagocitosis respectivamente. En general, el factor de virulencia mas importante de V. vulnificus es la capsula, debido a que se ha demostrado que variantes acapsulados de la especie son avirulentos, y el polisacárido de la cápsula es el único factor esencial necesario para la resistencia del complemento en sangre humana. Por otro lado, en anguilas, la cápsula resulta ser esencial solamente para la vibriosis transmitida a través del agua y dirigida a la colonización de las branquias. Sin embargo existen otros factores de virulencia que influencian de forma importante el curso de la infección causada por V. vulnificus. Añadidos al polisacárido de la cápsula, los lipopolisacárido también influyen en la letalidad causada por las infecciones de vibriosis que surgen por el consumo de marisco contaminado. Esto se debe a que la cápsula ayuda en gran medida a que la bacteria se proteja de el ambiente hostil y acídico encontrado en el tracto digestivo. De igual forma, la bacteria secreta diversas enzimas y toxinas que están involucradas en daño celular. Una de las mas importantes es la toxina RtxA1, que está directamente relacionada con la producción de sepsis y citotoxicidad. Otras toxinas, como la VvhA y la VvpE, también están involucradas en citotoxicidad y daño celular, y se hipotetiza que aunque individualmente no tienen un efecto importante en la virulencia, ejercen un efecto aditivo o de soporte hacia otras toxinas mas importantes como la RtxA1, incrementando así la acción toxica de la bacteria. Otro importante factor de virulencia es la capacidad de adquisición de hierro dentro del hospedador, que le permite a la bacteria superar la inmunidad nutricional que se presenta dentro del hospedador. La adquisición de hierro es un fator critico para la patogenicidad de V. vulnificus. Para esto, la bacteria cuenta con dos sistemas generales de captación de hierro, un sideróforo con su receptor, y un receptor de hemina. Estos mecanismos le permiten al patógeno secuestrar el hierro del hospedador, como se demostró en un estudio donde al ser irrumpidos, la bacteria perdió totalmente su virulencia en ratones. Sin embargo, esto no sucede en anguilas, debido a la existencia de un tercer sistema de captación de hierro especifico para peces, el ya mencionado Ftbp, codificado en el plásmido de virulencia. La relación entre el hierro y la virulencia de V. vulnificus, abarca diferentes mecanismos de patogenicidad como toxinas y enzimas que le permiten sobrevivir a los efectos del sistema inmune. Sin embargo, existen otro tipo de mecanismos físicos en forma de apéndices bacterianos, que también participan en la virulencia de la bacteria. El mas conocido de estos apéndices es el flagelo, el aparato de motilidad mas importante para diversos géneros de bacterias. Este organelo permite a las células bacterianas moverse a altas velocidades hacia quimio atrayentes como, potenciales hospedadores o gradientes de nutrientes en el ambiente. Sin embargo, el flagelo también es usado por diversos patógenos como mecanismo de supervivencia, de colonización y de invasión hacia sus hospedadores. No obstante, también existen otros tipos de apéndices involucrados en la patogenicidad en Vibrios y en otras especies bacterianas, estos son los pelos o “pili”. Los pili bacterianos son organelos filamentosos que están presentes en la superficie de diversas bacterias gram negativas. Estos apéndices cuentan con una gran cantidad de funciones tales como; intercambio génico entre células, adhesión, evasión del sistema inmune, agregación bacteriana y producción de biofilms. Entre estos apéndices, se encuentra una familia especial llamada Pili tipo IV. Esta multifuncional familia de pili, además de ejercer las funciones ya mencionadas, también está involucrada en motilidad. Esta habilidad es posible gracias a la característica única que poseen estos apéndices de extenderse y retraerse. Este mecanismo crea un “arpón” bacteriano que impulsa la bacteria y le permite moverse en diversas superficies. Esta habilidad también le permite a la bacteria movilizarse hacia otras células para comenzar la formación de biofilms y colonizar así otras superficies. Dentro de la familia de los Pili tipo IV, existen dos tipos de pili con diversas características especiales, los cuales están involucrados directamente en la formación de biofilms y en cierta manera en la virulencia: los MSHA pili y los Tad pili. Los MSHA pili (pili sensitivo a manosa de hemaglutinación) han sido estudiados extensamente en patógenos como V. cholerae, sin embargo no se ha descrito mucho en V. vulnificus. Estos apéndices están involucrados en la adhesión inicial a sustratos en el ambiente acuático, y son necesarios para la persistencia de la bacteria en el medio ambiente. De igual forma, también son esenciales par la formación de biofilms. Ninguna función del pelo MSHA en torno a virulencia había sido descrita hasta hace poco, cuando se describió el papel que desempeñan en la colonización del intestino de ratones. Estos apéndices tienen que ser reprimidos y destruidos para evitar que el sistema inmune los reconozca y emita una señal que alerte al sistema inmune. Sin embargo, estos estudios solo se han realizado en V. cholerae y las funciones patogénicas de este pili aun no han sido descritas en su totalidad para otras especies. Los Tad pili, por sus siglas en inglés, Tight adherence, se diferencian de los demás por ser notablemente pequeños y no estar asociados con motilidad celular. Sin embargo, los Tad pili desempeñan importantes funciones en patogénesis, así como también en producción de colonias rugosas, adhesión y formación de biofilms. Estos apéndices han sido relacionados con el aparato de secreción celular Tipo II debido a su estructura y proteínas relacionadas con su biosíntesis que presentan cierta homología con los de estos sistemas de secreción. Los Tad pili se encuentran codificados por los tad loci, los cuales se encuentran dentro de los genomas de diversos Vibrios y, sorprendentemente, varias de estas especies presentan más de un tad loci. V. vulnificus cuenta con 3 tad loci distintos que se han denominado de la siguiente manera: tad-1, tad-2 y tad-3. Independientemente de las funciones ya mencionadas que ejercen los Tad pili, solo se han descrito un puñado de funciones especificas relacionadas a tad-3, el cual está involucrado en la persistencia ambiental y la resistencia que confiere a los biofilms ante fuerzas mecánicas exteriores, como corrientes acuáticas. Sin embargo, un estudio reciente ha propuesto la hipótesis que, aunque individualmente los tad loci no participan mayoritariamente en producción de biofilms y virulencia, es necesario que los tres sean expresados para conferir un mecanismo de evasión hacia el sistema inmune del hospedador. En conclusión, V. vulnificus es un patógeno zoonótico de gran importancia sanitaria a nivel mundial. Esto lo convierte en un sujeto de estudio altamente importante para poder elucidar los mecanismos de patogénesis que lo convierten en un patógeno peligroso, no solo para la salud publica, sino también para la acuicultura que sufre grandes perdidas por brotes infecciosos de vibriosis. Estos factores de virulencia funcionan de forma sinérgica para lograr una evasión del sistema inmune y un ataque al hospedador efectivo, el cual es sorprendentemente rápido. Es por esto que el estudio de dichos factores nos ayudara a comprender integralmente la patogénesis producida por esta bacteria y por tanto a combatirla de una mejor manera. El primer objetivo general de el presente trabajo fue descubrir si los Pili tipo IV del complejo zoonótico clonal estaban controlados por hierro. Esto surgió debido a que en nuestro estudio transcriptómico anterior, varios genes involucrados en dos sistemas de Pili tipo IV (MSHA y Tad), estaban siendo diferencialmente expresados por hierro. Por consiguiente, al observar que el genoma de V. vulnificus contaba con tres genes distintos de mshA, los cuales supuestamente codificarían para la principal subunidad estructural de dicho pelo, nuestro segundo objetivo general fue averiguar si las dos copias extras de mshA estaban involucradas en la formación de biofilms y adhesión a superficies. Para esto, generamos diversos mutantes knock-out de estos genes en la cepa representativa del complejo zoonótico clonal y los testamos individualmente para observar sus capacidades de adhesión y producción de biofilms. Finalmente, el tercer objetivo general fue determinar las funciones, si es que existen, de los dos sistemas de Pili tipo IV en la virulencia del complejo zoonótico clonal. Esto se abordó mediante la obtención de cepas mutantes para los genes de la subunidad mayor de los tad loci. Tras haber obtenido todos los mutantes necesarios, procedimos a observar la capacidad de producción y las estructuras de biofilms de toda las cepas, cuantificando su producción mediante diversas metodologías. Finalmente, pusimos aprueba la capacidad de virulencia ante anguilas a través de diferentes ensayos in vivo y ex vivo. Para cumplir nuestros objetivos generales, diseñamos y ejecutamos el siguiente esquema experimental: 1. Para observar qué genes están influenciados por hierro, hemos analizado el perfil transcriptómico de la cepa representativa del complejo zoonótico clonal al crecerla en presencia y ausencia de hierro. 2. Para obtener los mutantes de los genes seleccionados a partir del análisis transcriptómico, los cuales incluyen a los sistemas MSHA, Tad pili y su peptidasa, y el flagelo, probamos varios protocolos de mutación bacteriana, y finalmente diseñamos un protocolo de mutación. Esto con el fin de encontrar y utilizar la metodología más eficaz para la producción de diversos mutantes simples y compuestos en el complejo zoonótico clonal de V. vulnificus. 3. Para averiguar las funciones en virulencia de los genes seleccionados, efectuamos diversas pruebas in vivo, in vitro y ex vivo. En estos experimentos testeamos las capacidades de infección, colonización, virulencia, adhesión y producción de biofilms. Para esto, aplicamos diversas metodologías y tecnologías como; microscopia confocal, microscopia de fluorescencia, infecciones por baño e intraperitoneales, entre otras. Después de obtener la extensa librería de mutantes necesarios y concluido satisfactoriamente las extensas pruebas fenotípicas e infecciones con animales, hemos obtenido los siguientes resultados. El método de mutagénesis basado en pTfoX y transformación natural es el mas efectivo para crear mutantes en el complejo zoonótico clonal. Después de probar diversos métodos para la generación de mutaciones en la cepa de R99, y de diseñar un protocolo nuevo utilizando la enzima de digestión NotI, con el cual pudimos obtener un mutante con dominio de glicosiltransferasa llamado slt, hemos llegado a la conclusión que usar el plásmido pTfoX es la forma más eficiente de delecionar genes. Mediante la inducción artificial de la transformación natural, que en las especies del género Vibrio está regulada por el gen tfoX, y el uso de PCR’s anidadas, la construcción e inserción de un constructo artificial de mutación en el genoma del complejo zoonótico clonal resultó ser altamente eficiente. Este método es suficientemente estable y reproducible para obtener diversos mutantes en poco tiempo. Este proceso puede ser manipulado fácilmente para obtener dobles, e incluso triples mutantes, al variar la implementación de casetes de resistencia a antibióticos. V. vulnificus tiene tres copias distintas de la subunidad mayor del pelo MSHA en su genoma, pero solo uno de ellos es funcional. El complejo zoonótico clonal, así como varias otros especies pertenecientes al género Vibrio, cuentan con tres genes mshA codificados en su genoma. Sin embargo, solo uno de ellos se encuentra dentro de un locus funcional, previamente descrito, que esta encargado de la biosíntesis de los MSHA pili. Hasta donde sabemos, este es el primer trabajo donde se estudian los dos genes mshA extra que se encuentran en el genoma de V. vulnificus. Con fines de esta investigación, los hemos denominado mshA-1, mshA-2 y mshA-3. Al comparar las secuencias y estructuras proteicas de los tres genes, es evidente que, aunque conservan cierta homología en su secuencia, son significativamente diferentes entre si. Aunado a esto, tras hacer un estudio filogenético, se observó que los genes mshA-2 y mshA-3 están bastante conservados en diversas especies de Vibrios, mientras que el mshA-1 se encuentra en un clúster donde se observa más heterogeneidad entre sus secuencias. Esto podría indicar que, de ser el único gen funcional, sus tareas podrían variar de cierta forma dependiendo de cada especie y de su ambiente específico. Tras poner a prueba las cepas mutantes de los 3 genes sobre sus capacidades de producción de biofilms y analizando los resultados mediante de microscopía confocal y tinción con cristal violeta, fue evidente que solo el gen mshA-1 estaba involucrado en la formación de biofilms. Esto se comprobó debido a que la deleción de los otros genes no afecto en absoluto a este mecanismo. Además, al probar la adhesión a superficies bióticas tras una prueba utilizando caparazones de crustáceo como sustrato, solo el mutante de mshA-1 resultó ser ineficiente en su adhesión. Finalmente, al probar la influencia de los pili MSHA en la virulencia del complejo zoonótico clonal, observamos que estos pili influencian de manera significativa la adhesión a branquias de las anguilas, ya que al estar incapacitados mediante la deleción de mshA-1, la bacteria fue deficiente en infección por el medio acuático. Curiosamente, el mutante en este gen no fue deficiente en la infección intraperitoneal, ni tampoco fue más sensible al suero humano ni de anguila. Estos resultados nos indican que, solamente el gen mshA-1 está involucrado en la producción de los MSHA pili, y por consiguiente, es el único gen involucrado en la producción de biofilm y adhesión a superficies. De igual forma, en este estudio describimos por primera vez el papel que juegan los pili MSHA en la virulencia de anguilas en el complejo zoonótico clonal. El flagelo juega un papel significativo en la virulencia del complejo zoonótico clonal y en el crecimiento de la bacteria. Tras obtener un mutante en el flagelo al delecionar el gen flgE que codifica para la proteína hook que ancla el filamento flagelar a la bacteria, observamos un cambio significativo en el crecimiento celular. Al parecer, al perder el flagelo, la bacteria tiende a producir una mayor población y biomasa al llegar a la fase estacionaria. Esta diferencia se observó al comparar el crecimiento total del mutante con el de la R99 a través de absorbancia y recuento en placa. Curiosamente, no se observaron diferencias en el crecimiento durante las primeras 8 horas, solo se observaron tras una incubación overnight (18 horas). Sin embargo, aunque el mutante exhibió un crecimiento mayor, este exceso de crecimiento no afectó la producción de biofilms, debido a que los niveles de biomasa producidos eran comparables con los de la cepa mutante si se discriminaban las células bacterianas no adheridas. Por otro lado, el mutante de flagelo resultó ser deficiente en la virulencia para anguilas cuando estas se infectan a través del medio acuático. Este resultado era de esperarse, ya que al ser inmóviles, las bacterias no tienen la capacidad de ser atraídas ni de moverse hacia el hospedador o las branquias, las cuales son el principal portal de entrada hacia el organismo. Sin embargo, al inyectar el mutante por la vía intraperitoneal, no hubo diferencia alguna entre la virulencia de este de la cepa salvaje. Estos resultados difieren con los obtenidos en una investigación previa, donde el flagelo resultó ser necesario para una colonización eficiente por V. cholerae del intestino de ratón. No obstante, al ser una especie diferente, una comparativa estricta no puede realizarse, así como se debe tener en cuenta la gran diferencia existente entre hospedadores. Esto puede influir de manera significativa en la forma en que la bacteria sortea los obstáculos del ambiente interno del hospedador, como por ejemplo, la complejidad y protección mucosa que existe en los intestinos de ratones, que no son similares a los intestinos de anguilas. La peptidasa VvpD juega un papel importante en la virulencia del complejo zoonótico clonal. Estudios previos en P. aeruginosas han demostrado que la peptidasa PilD es necesaria para la biogénesis de los Pili tipo IV y es la encargada de modificara las prepilinas y convertirlas en pili funcionales, así como para la secreción extracelular. El homologo de esta peptidasa en V. vulnificus es la VvpD, y nuestros resultados demuestran que es necesaria para la secreción extracelular tanto de la hemolisina como de la proteasa. De igual forma, hemos confirmado que esta peptidasa es necesaria para la virulencia de anguilas, ya que el mutante de vvpD es totalmente avirulento tanto en infección por vía intraperitoneal como por agua. El mutante de la peptidasa también es más susceptible al suero de anguila que al suero humano, lo cual indica que, tal vez esta peptidasa está involucrada en la secreción de alguna enzima o proteína que confiere resistencia a la bacteria contra suero de anguila. Finalmente, la deleción de esta enzima, como se ha demostrado en trabajos anteriores, afecta el crecimiento de la bacteria. De igual manera, las cepas deficientes en la peptidasa presentan una formación aberrante de biofilm y menor producción del mismo, lo cual era de esperar, debido a que esta enzima está encargada del correcto funcionamiento de los Tad pili y estos están relacionados con adhesión y biofilm. Los tres tad loci deben ser funcionales para influenciar la producción de biofilm y virulencia en el complejo zoonótico clonal. Diversos estudios genéticos han demostrado la presencia de estos pili en varias bacterias gran negativas, un ejemplo muy claro es en el género Vibrionaceae. Se ha descrito que varias especies pertenecientes a este género contienen más de un locus tad, y en el caso de V. vulnificus, existen tres distintos. Después de probar las capacidades de producción de biofilm de cada tad loci de manera individual y en combinación, incluyendo un triple mutante, llegamos a la conclusión que los tres tad loci deben ser funcionales para que, de manera sinérgica, desempeñen un papel en la producción de biofilms. Anteriormente se había descrito que uno de los tad loci, el tad-3, estaba relacionado con la capacidad de la bacteria de crear biofilms robustos y resistentes ante fuerzas mecánicas exteriores provenientes del ambiente que coloniza. Sin embargo, en nuestro estudio, el locus tad-3 no mostró ninguna relación con la producción de biofilms, esto podría deberse a dos razones: la primera, es que la cepa utilizada en el estudio anterior es una cepa clínica conocida por ser virulenta para humanos. La segunda razón podría ser que el gen flp encargado de procesar la subunidad mayor del pelo estaba sobre expresado, debido a que la cepa usada era una descendiente de la cepa clínica y presentaba un incremento cuatro veces mayor en la producción de biofilms. De igual forma, para que los tad loci influenciasen la virulencia del complejo zoonótico clonal, deben ser funcionales. Esto fue comprobado al hacer diferentes ensayos de virulencia en los cuales únicamente el triple mutante demostró ser deficiente en la colonización de anguilas. Sin embargo, el triple mutante únicamente fue deficiente en la adhesión inicial a las agallas, sin mostrar ningún impedimento para invasión y colonización de otros órganos. Curiosamente, el triple mutante pareció no presentar impedimento alguno en virulencia al ser inyectado por la vía intraperitoneal. Este resultado es diferente al obtenido en una investigación anterior, donde un mutante triple de los tad loci en una cepa clínica de V. vulnificus, resultó ser menos virulenta para ratones. De igual forma en el mismo estudio, el triple mutante mostró una resistencia menor al complemento del suero de ratón. Independientemente de los resultados anteriores, nuestro triple mutante no mostró deficiencia alguna en crecimiento tanto en suero de humano como de anguila, y no existieron diferencias entre la cepa parental y la mutante frente a la actividad de macrófagos humanos. En conclusión, nuestros resultados arrojan nueva información que relaciona nuevas funciones de dos sistemas de Pili tipo IV, así como al flagelo, a producción de biofilms y virulencia en el complejo zoonótico clonal de V. vulnificus. Esto sugiere que, aunque se tengan registros pasados de funciones de sistemas similares, estos pueden cambiar y/o expandirse dependiendo de la especie y nicho donde se encuentren, lo cual implica que la existencia de diversos mecanismos celulares con funciones diferenciales entre especies e incluso entre cepas. P este motivo una generalización en bacterias o el nombramiento de una especie tipo que represente a toda un género, como V. cholerae, debería de reconsiderarse al menos en torno a mecanismos complejos como lo son los de virulencia.