NAGIOS: RODERIC FUNCIONANDO

Getting on host’s nerves: Baculovirus-associated changes in the neuronal system of Spodoptera exigua

Repositori DSpace/Manakin

IMPORTANT: Aquest repositori està en una versió antiga des del 3/12/2023. La nova instal.lació está en https://roderic.uv.es/

Getting on host’s nerves: Baculovirus-associated changes in the neuronal system of Spodoptera exigua

Mostra el registre parcial de l'element

dc.contributor.advisor Herrero Sendra, Salvador
dc.contributor.advisor Crava, M. Cristina
dc.contributor.author Llopis Giménez, Ángel
dc.contributor.other Departament de Genètica es_ES
dc.date.accessioned 2021-05-10T07:21:58Z
dc.date.available 2021-05-11T04:45:05Z
dc.date.issued 2021 es_ES
dc.date.submitted 20-05-2021 es_ES
dc.identifier.uri https://hdl.handle.net/10550/79273
dc.description.abstract La família Baculoviridae constitueix un grup divers de virus entomopatogens amb un genoma d’ADN de doble cadena circular. Generalment, els baculovirus infecten en estadis larvaris dels ordres Lepidoptera, Hymenoptera i Diptera. Dins dels baculovirus, els nucleopoliedrovirus són els més comuns, tenint els seus virions oclosos dins d’una estructura proteica anomenada cos d’inclusió (OB) amb forma de poliedre. Els baculovirus tenen dues classes de virions, els virions oclosos dins dels OBs, que s’anomenen occlusion-derived viruses (ODVs); i els virions no oclosos que es coneixen com budded viruses (BVs). El cicle d’infecció pel baculovirus comença quan les larves ingerixen els OBs després d’alimentar-se de superfícies contaminades pel virus. Quan les larves ingerixen els OBs, l’alta alcalinitat dels sucs intestinals de l’insecte, produïx la hidròlisi de l’estructura proteica dels OBs, alliberant els ODVs al lumen del intestí. Els ODVs són els causants de la infecció primària, infectant les cèl·lules columnars de l’intestí larvari. Llavors, els BVs comencen a ser produïts i s’estenen a través del cos de l’insecte, infectant i replicant en molts teixits diferents, en el que es coneix com la infecció secundària. Com a conseqüència d’esta infecció sistèmica, el baculovirus produïx canvis de comportament en el seu hoste que promouen la dispersió vírica en el camp, en un clar exemple d’avantatge evolutiu. Un d’estos fenotips de comportament ben coneguts és l’augment de l’activitat de locomoció (enhanced locomotor activity, ELA) que fa que les larves esdevinguen més actives, augmentant els seus desplaçaments horitzontals, que alhora amplien la dispersió vírica al camp. En algunes espècies de lepidòpters, com ara Bombyx mori, este augment de la locomoció ha estat relacionada amb l’acció del gen ptp, present al genoma del baculovirus i que codifica per a la proteïna tirosina fosfatasa. Tot i que els mecanismes moleculars a través dels quals este gen produïx este fenotip encara no estan clars. El tree-top disease és un altre dels fenotips de comportament induïts pels baculovirus que empeny les larves a escalar a posicions apicals en les plantes quan estan prop de morir a causa de la infecció. Allí liqüen i moren. Com a conseqüència, el virus augmenta les seues possibilitats de dispersió amb ajuda dels elements naturals com ara l’aigua o l’aire. Inicialment, este fenotip ha estat vinculat a l’acció del gen egt present al genoma del baculovirus, com s’ha vist al baculovirus de Lymantria dispar. El gen egt codifica per a una UDP-glucosiltransferasa que catalitza la conjugació de l’hormona ecdisteroide amb sucres, esdevenint inactiva i evitant o retardant la inducció de la muda o la pupació de les larves. Per tant, les larves de lepidòpters amb estes hormones inactivades, continuen alimentant-se i creixent, augmentant la seua vida mitja i esdevenint més grans al moment de la seua mort. Com a conseqüència, la progènie vírica lliurada al medi ambient és molt major. No obstant això, l’acció d’egt i el tree-top disease necessiten de més investigació per tal de revelar el mecanisme molecular que els connectaria entre sí. Estos dos gens que han estat relacionats amb estos fenotips específics van ser adquirits ancestralment en el genoma del baculovirus procedent dels seus hostes. A més, l’existència d’estos fenotips induïts pel paràsit també pot implicar canvis d’expressió en els gens de l’hoste que jugarien un paper clau en el control de patrons fisiològics o de comportament. Tenint en compte això, plantegem la hipòtesi que estos ja descrits fenotips conductuals i d’altres que podrien ser descoberts, podrien estar relacionats amb canvis en els sistemes neurals dels hostes. Spodoptera exigua (Lepidoptera: Noctuidae) (Hübner, 1808) també és conegut com el cuc soldat i constituïx una plaga polífaga distribuïda a tot el món, especialment en zones càlides i temperades. Les etapes larvàries de S. exigua s’alimenten de més de 200 espècies de cultius i plantes ornamentals, amb enormes conseqüències econòmiques i agronòmiques. S’han utilitzat diferents estratègies per al control de S. exigua al camp sobre tot emprant pesticides químics, així com diferents agents de control biològic, com ara bactèries, fongs, nematodes o virus, com els baculovirus. La majoria dels baculovirus tenen un rang d’hostes estret, i això representa un avantatge per al seu ús com insecticides en el camp. Això, juntament amb la seva gran virulència i el seu baix impacte mediambiental, els convertix en excel·lents alternatives al control químic. Els baculovirus són el producte víric més utilitzat en el control de plagues de lepidòpters. Tenint en compte tot açò, el propòsit principal d’esta tesi doctoral és estudiar la influència del Spodoptera exigua nucleopoliedrovirus múltiple (SeMNPV) en els sistemes neuronals de S. exigua. El sistema nerviós de l’insecte està compost pel sistema nerviós central i el sistema nerviós perifèric. Tots dos participen en el control de la fisiologia i el comportament de l’insecte, encara que també en la comunicació de l’insecte amb el seu entorn circumdant. La nostra hipòtesi està recolzada pel fet que la presència i la replicació dels baculovirus en els òrgans neuronals, com el cervell o les antenes, ja s’ha observat. Dins del sistema nerviós central, hem centrat els nostres esforços en l’estudi del sistema neuropeptidèrgic, format per neuropèptids que regulen la fisiologia interna de l’insecte i formen part del sistema de comunicació química entre les diferents cèl·lules de l’organisme. Els neuropèptids són xicotetes proteïnes lliurades per les neurones i cèl·lules neurosecretores que actuen com neuromoduladors, neurotransmissors i neurohormones. Els neuropèptids insecticides són sintetitzats principalment en les cèl·lules neurosecretores del protocerebrum de l’insecte. Desprès s’emmagatzemen en òrgans neurohemals i s’alliberen a través d’axons que s’estenen i penetren la barrera de sang a l’hemolimfa. Els neuropèptids deriven de precursors proteics anomenats prepropèptids que s’escindixen i després es modifiquen post-transcripcionalment. El resultat és el pèptid actiu que serà alliberat i enllaçat a receptors específics. Els neuropèptids també poden ser alliberats per glàndules endocrines situades en el tracte intestinal i en altres llocs perifèrics. Generalment es classifiquen segons la seua funció principal i el receptors que activen normalment són receptors acoblats a proteïnes G (GPCRs). Els neuropèptids regulen aspectes fisiològics molt diferents com ara: la alimentació i el desenvolupament, la reproducció, el moviment muscular, l’homeòstasi, la memòria i els ritmes circadians. Encara que la majoria d’ells són considerats pleiotròpics, es a dir, intervenen en més d’una funció biològica. Dins del sistema nerviós perifèric, ens hem centrat en els gens relacionats amb la quimiorecepció. La quimiorecepció és el procés de detecció d’estímuls químics externs. És molt important en la biologia dels insectes, ja que la informació proporcionada pels senyals químics influïx en comportaments fonamentals com ara l’aparellament, la cerca d’aliments, la ponència d’ous o la fugida de parasitoids o depredadors. La quimiorecepció inclou dues branques principals: l’olfacció i el gust. Diferents famílies de gens participen en l’olfacció i el gust com: receptors d’odorants (ORs), receptors ionotròpics (IRs), receptors gustatius (GRs), proteïnes d’unió a odorants (OBPs) o proteïnes quimiosensorials (CSPs). Cadascun d’estos repertoris gènics tenen funcions concretes en el sistema de quimiorecepció d’insectes, i permeten que la informació proporcionada per molècules químiques s’integre i es combine en el cervell. El cervell de l’insecte llavors emet respostes de comportament concretes segons el canviant entorn químic. Dins dels gens relacionats amb la quimiorecepció, ens hem centrat principalment en els receptors d’odorants, que són la peça central de l’olfacció de l’insecte. Els receptors d’odorants s’expressen a la membrana de les neurones olfactives receptores que estan situades dins de les sensilla distribuïdes al llarg de la cutícula de l’insecte, principalment a les parts bucals i a les antenes. Per tal d’analitzar la influència de SeMNPV en tots dos sistemes, hem seguit un protocol comú. En primer lloc, hem descrit els repertoris gènics dels neuropèptids i els gens quimiosensorials de S. exigua. Això, ha estat possible gràcies a la realització d’estudis d’ARN-Seq realitzats amb mostres de caps de S. exigua infectats i no infectats, però també, utilitzant enfocaments transcripcionals com la RT-qPCR. Després, hem estudiat canvis associats a SeMNPV en l’expressió d’estos repertoris gènics. Finalment, hem seleccionat candidats gènics per a la seua caracterització funcional i així intentar entendre el seu paper en la interacció hoste-patogen i les conseqüències de la seua regulació després de la infecció per baculovirus. Al primer capítol de la tesi, anotem el neuropeptidoma de S. exigua. La identificació i la descripció dels neuropèptids ajuda a entendre millor la regulació de la fisiologia dels insectes i la seua adaptació als diferents entorns, però també proporciona nous objectius per al desenvolupament d’estratègies avançades de control de plagues d’insectes. La primera descripció del neuropeptidoma d’un insecte va ser realitzada a Drosophila melanogaster, encara que durant els últims anys s’ha estès a diferents espècies, especialment a plagues agrícoles o vectors per a malalties humanes. En este context, anotem el neuropeptidoma més complet d’insectes fins el moment. S’obté a través de un transcriptoma de S. exigua generat a partir de mostres de caps de larva, intestí de larva i cervells d’adult. Seixanta-tres gens són identificats i anotats com a neuropèptids putatius, incloent-hi splicing variants per a sis gens i isoformes genètiques diferents per a dos gens específics. Es duu a terme una anàlisi filogenètica per estudiar l’homologia dels neuropèptids de S. exigua amb seqüències d’altres espècies d’insectes (algunes pertanyents a altres ordres d’insectes), i detectar possibles esdeveniments de duplicació gènica. Això ha permès revelar un nucli de neuropèptids format per 43 gens en lepidòpters. Al sistema neuropeptidèrgic, els neuropèptids gut-brain tenen una importància fonamental en la regulació de l’alimentació, el creixement i la digestió, ja que s’expressen tant en cervell com en les cèl·lules neurosecretores de l’intestí. Si comparem l’expressió dels neuropèptids anotats en el cap de larva i en les mostres d’intestí, setze transcrits es consideren brain-gut. Alguns exemples són: allatostatin, allatotropin, proctolin, CCHamide, neuropeptide F i short neuropeptide F. A més, per obtenir informació sobre la presència o absència dels diferents transcrits de neuropèptids en les larves i els adults, la seua expressió es compara en les mostres de cap de larva, intestí de larva i cervell d’adult. Encara que no apareixen neuropèptidsespecífics de larva, sis transcrits es consideren específics d’adults, suggerint una implicació potencial en processos específics d’adults. Per tal de completar la descripció del neuropeptidoma de S. exigua, s’estudia l’expressió d’alguns dels neuropèptids en condicions de fam induïda en les larves. La majoria dels transcrits seleccionats regulen l’alimentació i la digestió. Els resultats mostren que molts d’ells s’expressen de manera diferencial durant la fam induïda, la major part d’ells mostrant una sobreexpressió. Això possiblement correspon a una resposta general d’estrès. La sobreexpressió d’alguns d’ells, com ara el short neuropeptide F, allatostatin o CCHamide, podria estar relacionada amb modificacions olfactives provocades per la inanició, com ja s’havia observat prèviament en D. melanogaster. L’expressió dels neuropèptids també es compara sota diferents condicions de llum i temperatura, ja que estos factors influïxen en el desenvolupament d’insectes. A més, alguns dels neuropèptids tenen un paper en la regulació dels ritmes circadians, que estan connectats amb els cicles de llum i foscor. Cap dels neuropèptids apareix regulat significativament després de la privació de llum, i així es descarta un efecte directe sobre la regulació d’estos gens. Considerant els resultats, la temperatura no té cap efecte clar, suggerint que l’expressió de neuropèptids no està fàcilment influenciada per factors externs. En general, la anotació del neuropeptidoma de S. exigua ajudarà a identificar neuropèptids en altres espècies d’insectes proporcionant informació valuosa sobre la importància de l’acció dels neuropèptids en la regulació de la fisiologia de l’insecte. En el context d’esta tesi, permet el següent pas, dirigit a estudiar la influència de la infecció de SeMNPV en la regulació del sistema neuropeptidèrgic per tal de descobrir nous aspectes rellevants de la interacció baculovirus-eruga. Al segon capítol de la tesi, una vegada s’ha identificat i anotat el repertori de neuropèptids de S. exigua, s’intenta analitzar els possibles canvis produïts per SeMNPV durant la infecció de l’hoste. L’objectiu és identificar alteracions en la regulació dels gens del sistema nerviós central que podrien estar relacionats amb els fenotips induïts pel baculovirus. Com a primer enfocament, els canvis d’expressió gènica en el sistema neuropeptidèrgic relacionats amb SeMNPV s’estudien en mostres d’ARN-Seq de cap de larva. No s’observa un patró clar d’expressió diferencial després de la infecció vírica. Tot i que alguns gens, la funció dels quals ja estava descrita, apareixen regulats segons l’anàlisi estadística. Este és el cas de l’eclosion hormone, l’ecdysis triggering hormone i la prothoracicotropic hormone, que són inductors de l’ècdisi i tenen una funció oposada a l’hormona juvenil. La regulació d’este conjunt de gens produiria un retard en el procés de muda normal, estenent la vida de l’hoste. Això està funcionalment relacionat amb la funció del gen egt, que ja ha estat comentat anteriorment. La regulació d’este grup de gens podria complementar l’acció del gen egt en la interacció baculovirus-hoste. A causa de l’absència d’un patró general de regulació dels gens de neuropèptids després de la infecció per SeMNPV, i per centrar-se en el cervell, on s’expressen la majoria dels gens de neuropèptids, s’analitza l’expressió gènica de neuropèptids en mostres de cervell infectades per SeMNPV a través de RT-qPCR. Els resultats mostren que proctolin-like, un gen semblant al neuropèptid proctolin present en els ordres Coleoptera i Diptera, està clarament regulat després de la infecció vírica, mostrant una infraexpressió. A causa del seu patró d’expressió en els teixits cerebrals i intestinals, als seus llocs d’escissió predits, i la presència de la part activa del neuropèptid proctolin (RY/HLPT) en la seqüència de proctolin-like, es considera per a la seua caracterització funcional i per estudiar el seu paper en la interacció hoste-patogen. El silenciament de gens a través de la interferència d’ARN a millorat l’estudi de la funció gènica en els insectes. No obstant això, l’ús d’estes tècniques en lepidòpters s’ha demostrat que és difícil d’aconseguir. Per això, el mètode seleccionat per a estudiar la funció de proctolin-like és l’estratègia de guany de funció. Així es generen els baculovirus recombinants AcMNPV que expressen el fragment C-terminal de proctolin-like (Se-PLP). Posteriorment, es realitzen bioassajos per comprovar la influència de la sobreexpressió de Se-PLP en la patogenicitat del baculovirus. També s’analitza el seu efecte en el desenvolupament larvari i la locomoció larvària, que són factors que estan funcionalment relacionats amb el neuropèptid proctolin i la seua funció com a regulador de les contraccions dels músculs esquelètics i viscerals. Les infeccions amb el baculovirus AcMNPV que sobreexpressa Se-PLP mostren un augment de la mortalitat a dosis baixes, encara que no a dosis altes. Tot i això, ens porta a concloure que Se-PLP influïx en la interacció baculovirus-eruga. A més, apareix una reducció en el creixement larval i també en la digestió de les larves en aquelles infectades amb el baculovirus AcMNPV-PLP en comparació amb aquelles infectades pel virus control AcMNPV-Con i en les no infectades. D’altra banda, l’expressió de Se-PLP durant la infecció pel baculovirus produïx una reducció en la locomoció de les larves. Per estudiar-ho, desenvolupem un mètode que ens permet mesurar l’activitat de locomoció larvària, comparant els diferents tractaments d’infecció. Els resultats obtinguts ens permeten vincular la funció de Se-PLP amb la regulació de les contraccions dels músculs esquelètics i intestinals, que afecten la digestió i la locomoció, com s’havia descrit anteriorment per al neuropèptid proctolin. Com a conclusió d’este capítol, la infecció per SeMNPV produïx la infraexpressió de tres gens importants en el procés d’ècdisi, possiblement complementant la funció del gen egt en la interacció baculovirus-eruga. En el sistema nerviós central, proctolin-like apareix clarament regulat degut a la infecció per SeMNPV. La caracterització de Se-PLP podria connectar la seua funció amb el fenotip d’hiperactivitat induït pel baculovirus, ja que una disminució en l’expressió d’este gen podria produir un augment en l’activitat de locomoció de les larves. La disminució de expressió de Se-PLP també podria complementar els efectes gènics d’egt d’una manera alternativa, afectant a la regulació de les contraccions intestinals, produint larves més grans i possiblement alliberant més virus al medi ambient. Queda per dilucidar si la regulació de l’expressió de neuropèptids després de la infecció de SeMNPV representa un efecte directe de manipulació directa pel virus en l’hoste, una resposta de l’hoste o un efecte colateral de la infecció baculovírica. Seria necessària fer recerca addicional per revelar els mecanismes de regulació de l’expressió gènica pel virus, augmentant el nostre coneixement sobre els canvis induïts pel paràsit en els seus hostes. En el tercer capítol de la tesi, es descriu el repertori de gens relacionats amb la quimiorecepció de S. exigua. Les descripcions anteriorment publicades dels gens relacionats amb la quimiorecepció de S. exigua es van obtenir utilitzant nomes mostres d’adults i utilitzant diferents nomenclatures d’anotació que van dificultar les comparacions entre estudis. A més, hi havia una manca de coneixement dels gens quimiosensorials en estadis larvaris, que és l’etapa susceptible a la infecció per baculovirus. En este context, es reanoten els gens relacionats amb quimiosensors de S. exigua utilitzant mostres d’ARN-Seq d’adult i de larves, i també s’unifica la nomenclatura gènica amb l’espècie germana Spodoptera frugiperda, el repertori quimiosensorial de la qual ja s’havia anotat i publicat. Llavors, s’identifiquen un total de 200 gens relacionats amb la quimiorecepció en S. exigua, expandint el nombre de gens identificats en les anotacions publicades anteriorment. Per tal d’obtenir informació sobre l’expressió d’este repertori de gens en les fases larvàries, combinem tècniques d’ARN-Seq i RT-qPCR, centrant-nos principalment en els ORs, la peça central de l’olfacció de l’insecte. En total, s’expressen en larves 50 dels 63 ORs, tot i que no apareixen gens específics d’estadis larvaris. A més, 14 OBPs pareixen ser específics de larves i quatre PBPs (proteïnes d’unió a la feromona) es troben expressades en caps de larva, tot i que la seua funció principal és el reconeixement de la feromona sexual adulta. Això, s’ha vist en altres espècies de lepidòpters i s’ha teoritzat que les larves podrien utilitzar la senyal de la feromona per trobar aliment o per protecció (hipòtesi mother knows best). En altres estudis anteriors, s’havia observat una sobreexpressió de gens ORs i OBPs quan adults eren exposats a volàtils de plantes específiques, en un mecanisme conegut com “sensibilitat als olors”. En este capítol es quantifiquen els nivells d’expressió d’un conjunt d’ORs i PBPs en les larves després de la preexposició a diferents compostos odorants. Després de 24 hores d’exposició, diversos ORs apareixen regulats per sobre de qualsevol que fos l’olor utilitzat. Especulem que l’àmplia sobreexpressió dels ORs podria ser una resposta fisiològica a l’alta concentració de volàtils. Per provar si estos canvis corresponen a una resposta d’estrès general, es duu a terme una altra anàlisi fent passar fam a les larves durant 24 hores. No s’observa el mateix efecte en l’expressió de gens quimiosensorials, així que es conclou que els canvis d’expressió observats anteriorment, no corresponen a una resposta general d’estrès. La identificació d’olors que causen fenotips conductuals en larves de S. exigua, ajuda a enllaçar molècules volàtils amb l’ecologia de la larva. A causa de l’absència de protocols en les larves de S. exigua, es dissenya una nova configuració que permet estudiar les respostes de comportament de les larves a odorants específics. Per tal de provar el mètode, s’empren diferents odorants. Dos d’ells, 1-hexanol i benzaldehid, resulten atractius per a les larves; mentre que d’altres com indol, alcohol benzil, linalool, 3-octanona i cis-3-hexenil propionat, les repel·lixen. Els resultats obtinguts i l’atracció produïda per 1-hexanol, que coincidix amb l’anteriorment observat a Spodoptera littoralis i Lobesia botrana, valida el nostre mètode per identificar odorants que causen fenotips conductuals. En conclusió, en este capítol es duu a terme una nova i més fiable anotació dels gens relacionats amb la quimiorecepció de S. exigua, centrant-se en els gens expressats en estadis larvaris. Per tal d’aprofundir en l’olfacció larvària, es realitzen experiments d’exposició a odorants a llarg termini, mostrant canvis no específics en l’expressió d’ORs. També es desenvolupa un nou mètode per identificar compostos odorants que causen fenotips conductuals per a larves de S. exigua. Tots estos resultats constituïxen eines útils per a utilitzar en estudis addicionals destinats a caracteritzar l’olfacció larvària a S. exigua. En este context, els utilitzem per a estudiar la influència de SeMNPV en l’olfacció larvària per tal de descobrir noves idees en la interacció baculovirus-eruga. Al quart capítol de la present tesi i amb l’objectiu de completar la descripció de la manipulació parasitària del comportament que desencadena el baculovirus en el seu hoste, s’estudien els canvis d’expressió en gens relacionats amb la quimiorecepció en S. exigua després de la infecció baculovírica. Ens centrem en els ORs, que són la peça central de l’olfacció de l’insecte. Utilitzant dades d’ARN-Seq a partir de mostres de cap de larva infectades o no, es duu a terme una anàlisi d’expressió diferencial per tal d’estudiar si la infecció per SeMNPV influïx en l’expressió dels gens. Alguns OR manifesten una forta regulació després de la infecció per SeMNPV i això, es confirma després per RT-qPCR, comparant la seua expressió en mostres infectades per SeMNPV i AcMNPV (Autographa californica nucleopoliedrovirus múltiple). Estes variacions en la expressió dels gens semblen estar associades a la infecció específica per SeMNPV, ja que la infecció amb el baculovirus generalista AcMNPV no produïx la mateixa regulació. Els dos ORs més regulats, SexiOR35 i SexiOR23, són seleccionats per a la seua caracterització funcional, per tal de revelar els lligands que els activen. Per això, s’utilitza l’empty neuron system de Drosophila per tal de desorfanitzar-los. La identificació dels lligands d’ambdós receptors es realitza a través de la tècnica SSR (single sensillum recording). El SexiOR35 resulta ser un receptor d’ample espectre, capaç de reconèixer molts compostos odorants diferents. Mostra respostes fortes a odorants com ara: 1,4-dimetilbenzè, 3-carè, acetofenona, estragol, linalool, citral i p-cimen. El SexiOR23 no mostra respostes significatives a cap dels odorants testats i els seus lligands principals romanen desconeguts. Això ens duu a la hipòtesi que el seu lligand o lligands no es troba al panel d’odorants testats, ja que soles representa una xicoteta fracció de tots els olors que una larva podria trobar al llarg de la seua vida diària. Per tal de correlacionar la funció de SexiOR35 amb la resposta conductual de larves de S. exigua, dos dels seus lligands principals, linalool i estragol, són utilitzats en assajos de comportament amb larves infectades per SeMNPV, AcMNPV o no infectades. Estos assajos de comportament tenen l’objectiu de mostrar canvis en la percepció dels odorants quan les larves es troben infectades pel baculovirus. El linalool, un olor molt comú a les plantes, produïx un efecte dissuasiu en les larves infectades per SeMNPV que no mostren les larves infectades per AcMNPV i tampoc les no infectades. El linalool ja en estudis anteriors havia demostrat que millorava la patogenicitat de SeMNPV quan les larves estaven exposades a l’odorant, mostrant un efecte sinèrgic amb el virus. Este fenotip observat podria correspondre a una resposta de defensa de les larves per evitar l’efecte sinèrgic que la infecció de SeMNPV i l’exposició a linalool es produïx. L’estragol, un odorant molt comú a les plantes aromàtiques, produïx un efecte similar en les larves infectades per SeMNPV i AcMNPV. Això podria representar un fenotip no específic produït com a conseqüència de la infecció pel baculovirus. El SexiOR40c és l’únic receptor regulat sota ambdós infeccions de baculovirus i podria estar associat a este comportament. Els lligands que activen SexiOR40c romanen desconeguts. L’1-indanona no va ser reconeguda activament per SexiOR35, i l’únic fenotip significatiu de comportament observat es una atracció per les larves infectades per SeMNPV en una de les concentracions testades. Este odorant podria ser detectat per un altre receptor que seria responsable del comportament observat. Per tal de concloure, la infecció de SeMNPV regula la expressió d’alguns ORs en S. exigua. Un d’ells, SexiOR35 es caracteritzat funcionalment com un receptor d’ampli espectre. Els canvis en la seua expressió estan connectats amb respostes de comportament en larves exposades a dos lligands de SexiOR35. Queda per dilucidar si els efectes observats són una manipulació per part del baculovirus o un efecte secundari de la infecció. Això, suposa la primera descripció dels canvis olfactius produïts a l’hoste durant una infecció per baculovirus, i demarca la importància de l’ecologia química en les interaccions paràsit-hoste. El desenvolupament d’esta tesi doctoral revela diferents influències de la infecció de SeMNPV en el sistema neuronal de S. exigua, incloent el sistema nerviós central i el perifèric. Centrant-se en el sistema nerviós central, la infecció per SeMNPV produïx una infraexpressió del potencial neuropèptid proctolin-like. Tenint en compte els resultats obtinguts durant la caracterització funcional d’este gen, la seua regulació podria afectar als processos de digestió en les larves, induint la generació de larves més grans que alliberarien més virus al final del cicle d’infecció, d’una manera similar al que fa el gen egt en la interacció baculovirus-eruga. Però, també la regulació de proctolin-like i la seua probable participació en la regulació de les contraccions del múscul esquelètic, faria que les larves augmentaren la seua activitat locomotora, ajudant a la distribució geogràfica del virus. Este podria ser un dels mecanismes que explicarien el fenotip ELA, un fenotip ja estudiat i que produïx el baculovirus en els seus hostes. En el sistema nerviós perifèric, la infecció per SeMNPV regula l’expressió d’alguns ORs, produint canvis en la percepció d’odorants de les larves de S. exigua. Els canvis en els receptors d’odorants tindrien conseqüències en el comportament larvari. D’una banda estos canvis en les preferències olfactives podrien ser representatius d’una resposta larvària contra la infecció, sentint-se atretes ara a plantes que podrien ajudar les larves a augmentar les seues taxes de supervivència en una estratègia d’automedicació. Tanmateix, això també podria ser indicatiu de respostes repel·lents a fonts específiques d’olors que podrien ajudar a la infecció vírica. D’altra banda, estos fenotips de comportament serien directament o indirecta causats pel virus, evitant estratègies d’automedicació per part de les larves, o fent que es sentiren atretes per les plantes que ajudarien al desenvolupament de la malaltia vírica en les larves. Els resultats de la present tesi doctoral requeririen d’investigacions addicionals per tal de revelar més canvis associats al baculovirus en altres repertoris gènics dels hostes i així augmentar el coneixement sobre els mecanismes específics de manipulació de la expressió gènica que el virus podria emprar per a este propòsit, el que portaria al descobriment de més aspectes de la interacció baculovirus-eruga i l’ecologia de l’insecte. Aquesta tesi obre vies per estudiar la regulació de la fisiologia de l’insecte, nous mètodes per entendre les respostes de comportament a les larves i com els insectes es comuniquen i interactuen amb el seu entorn. Els nostres resultats llancen una mica de llum en el complex món de la interacció baculovirus-eruga amb la intenció de millorar i optimitzar les estratègies actuals i futures de control de plagues de lepidòpters, utilitzant els baculovirus com un potent biopesticida. es_ES
dc.description.abstract Baculoviruses constitute a diverse group of entomopathogenic viruses characterised by their high specificity and their strong field incidence. These two characteristics have facilitated their usage as bioinsecticides for controlling lepidopteran crop pests. During the baculovirus infection in the larvae, the virus spreads through the insect body, infecting and replicating in many different tissues. As a consequence of this systemic infection, baculovirus produces behavioral changes in its host to promote its viral dispersion in the field, in a clear example of evolutionary advantage. These well-known behavioral phenotypes, whose main examples are the enhanced locomotion activity and the tree-top disease, have been connected with the presence in the baculovirus genome of genes previously acquired from the host. In addition, the existence of this parasite-induced phenotypes may also imply expression changes in host genes that would play a key role in controlling behavioral patterns. Thus, we hypothesize that the already described baculovirus-associated behavioral phenotypes and others that might be discovered, could also be connected to changes in the neural systems of the insect. The nervous system of the insect is composed of the central nervous system and the peripheral nervous system. Both of them participate in the control of the insect’s physiology and behavior, and also in the communication of the insect with its surrounding environment. Our hypothesis is supported by the fact that baculovirus presence in brain or antennas has been already observed. Considering this background, the main purpose of this doctoral thesis is to study the influence of the Spodoptera exigua Multiple Nucleopolyhedrovirus (SeMNPV) in the neuronal systems of the lepidopteran crop pest Spodoptera exigua. Within the central nervous system, we have centred our efforts in the study of the neuropeptidergic system, formed by neuropeptides that regulate the insect’s internal physiology. Within the peripheral nervous system, we have focused on the chemosensory-related genes, concretely in the odorant receptors, that are the centre piece of the insect’s olfaction. For analysing the SeMNPV influence in both systems, we have followed a common pipeline. We first have described the neuropeptide and chemosensory-related gene repertoires of S. exigua. Then, we have studied SeMNPV-associated changes in the expression of these gene repertoires. Finally, we have selected gene candidates for functional characterization to understand their role in the host-pathogen interaction. In the first chapter, the neuropeptidome of S. exigua is annotated. That supposes the identification of 63 neuropeptide unigenes from a transcriptome assembled with samples of larval heads, larval gut and adult brains. We also build phylogenetical trees with the S. exigua neuropeptides and those from other related species whose neuropeptidomes are already available. Other information as the description of brain-gut neuropeptides, a comparison of the neuropeptidome expression in different tissues and developmental stages, and how external factors as light or temperature can influence it, complete the description of the neuropeptidome of S. exigua. In the second chapter, we analyse how the baculovirus infection affects the expression of neuropeptide genes following different approaches. At first, we perform differential gene expression in RNA-Seq samples of SeMNPV- and mock-infected larval head samples. Some genes related with the ecdysis process appear to be up-regulated, connecting this with previously observed phenotypes produced by the baculovirus infection. More comprehensive results appear studying the SeMNPV influence in brain samples through RT-qPCR. One putative neuropeptide gene, proctolin-like, resembling the insect neuropeptide proctolin, is clearly down-regulated after the SeMNPV infection. For studying its role in the host-pathogen interaction, recombinant baculoviruses are generated expressing this gene, in a gain-of-function strategy. Proctolin-like overexpression resulted in a decrease of the larval locomotion activity and digestion, confirming its similar role to the neuropeptide proctolin. These results permit us to hypothesize about the proctolin-like regulation after the baculovirus infection and the consequences of its down-regulation, possibly making larvae to become more active and bigger and thus, increasing viral fitness by releasing more viral progeny to the environment. In the third chapter, the chemosensory-related gene repertoire of S. exigua is reannotated, improving the previous annotations and using a new nomenclature system that permits its comparison with that of other related species. This new description focuses on larval chemosensory genes, contrary to the previous annotations that used adult transcriptomes. We also analyse how the pre-exposition to specific odorants provokes changes in the expression of some chemosensory genes and we devise a new method for studying behaviourally active odorants against S. exigua larvae. In the fourth chapter, we analyse the SeMNPV influence in the expression of the chemosensory-related genes, mainly focusing on odorant receptors. Using RNA-Seq samples of larval head, some odorant receptors appear to be up-regulated after the virus infection. Two of them, SexiOR23 and SexiOR35 are selected for their functional characterisation using heterologous expression in Drosophila and electrophysiological techniques. SexiOR35 result in a broad-tuned receptor able to recognise many different plant odorants. Behavioral assays with baculovirus- and mock-infected samples reveal changes in the larval perception of odorants recognised by SexiOR35 after baculovirus infection. This supposes the first description of baculovirus-associated changes in the olfaction of lepidopteran larvae. The results obtained from this doctoral thesis discover baculovirus-associated changes in the neuronal systems of S. exigua. On one hand, the down-regulation of proctolin-like, would make the SeMNPV-infected larvae to become bigger and more active, increasing the viral fitness in the environment. On the other hand, the up-regulation of specific odorant receptors during the SeMNPV infection would produce strong changes in the odorant preferences of the larvae, producing behavioral alterations that could increase the viral incidence or unveiling a larval response to decrease the consequences of the viral infection. These results open new questions that aim to understand if the observed changes are directly caused by the virus or are collateral effects of the infection. They also allow to hypothesize about the biological significance of these phenotypes and to discover new potential targets for pest control of the lepidopteran pest S. exigua. en_US
dc.format.extent 284 p. es_ES
dc.language.iso en es_ES
dc.subject baculovirus es_ES
dc.subject spodoptera es_ES
dc.title Getting on host’s nerves: Baculovirus-associated changes in the neuronal system of Spodoptera exigua es_ES
dc.type doctoral thesis es_ES
dc.subject.unesco UNESCO::CIENCIAS DE LA VIDA es_ES
dc.embargo.terms 0 days es_ES

Visualització       (6.798Mb)

Aquest element apareix en la col·lecció o col·leccions següent(s)

Mostra el registre parcial de l'element

Cerca a RODERIC

Cerca avançada

Visualitza

Estadístiques