ANTECEDENTES La combinación sinérgica de métodos automatizados de captura y análisis de bioimagen está emergiendo como un enfoque de vanguardia para abordar muchas cuestiones biológicas. Sin embargo, hay muchos campos en los que estas técnicas aún no se implementan y, en cambio, todavía se basan en la inspección visual y el análisis manual, que inevitablemente limitan el rendimiento alcanzable y son más propensos a introducir el sesgo del investigador. Por lo tanto, aún queda un gran esfuerzo por hacer en la difusión del uso de tecnologías de bioimagen de vanguardia en los campos de las ciencias de la vida con una gran dependencia de métodos de microscopía. En la presente tesis, nuestro objetivo ha sido desarrollar y aplicar métodos de bioimagen automatizados al estudio del cerebro adulto, en particular en las áreas de estudio de la biología de las células madre neurales (NSC, del inglés neural stem cells) y el proceso de remielinización de axones. Con respecto a las NSC, la zona subependimaria (SEZ, del inglés, subependymal zone) de los ventrículos laterales es el área neurogénica más extensa y activa en el cerebro mamífero adulto. En el nicho de la SEZ, las NSC coexistentes muestran estados proliferativos heterogéneos que pueden agruparse en dos condiciones principales, quiescencia o activación. Las NSCs activadas producen neuroblastos, que migran para integrarse como neuronas maduras en el bulbo olfatorio. El estudio de la biología de las NSC adultas, a pesar de alcanzar su mayor nivel de complejidad cuando se realiza in vivo, se basa en gran medida en ensayos in vitro que permiten una descomposición y manipulación mucho más fácil y versátil de las variables del sistema. El aislamiento y la expansión de NSCs de la SEZ de ratones adultos es posible en condiciones de cultivo definidas. Se induce un estado proliferativo mediante el crecimiento de células disgregadas en condiciones no adhesivas en presencia de factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) y / o factor de crecimiento epidérmico (EGF) como mitógenos. En estas condiciones, una pequeña población de células comienza a proliferar formando agregados clonales flotantes conocidos como neuroesferas. Las neuroesferas primarias se pueden disociar para subcultivar las células individuales obtenidas, propagando así el cultivo con la formación de neuroesferas secundarias. Además, cultivados sobre un sustrato adhesivo en presencia de suero, se pueden inducir la diferenciación de las NSCs. De este modo, los cultivos de neuroesferas se han convertido en una técnica central para el estudio de las NSC adultas en un entorno altamente controlado. En las últimas décadas se han desarrollado diferentes ensayos para evaluar específicamente sus propiedades básicas, que han permitido un gran avance en nuestro conocimiento sobre la neurogénesis adulta y el mantenimiento y regeneración del tejido neural. No obstante, no se ha aprovechado el potencial de estos modelos in vitro en forma de rastreos a gran escala basados ​​en microscopía. Por el contrario, la mayoría de los análisis actuales se realizan normalmente de forma manual o, como mucho, con la ayuda de software, pero dependiendo de la supervisión del investigador. Por otro lado, los oligodendrocitos son las células mielinizantes del sistema nervioso central (CNS, del inglés central nervous system). Extienden sus procesos alrededor de los axones para formar la capa aislante rica en lípidos conocida como vaina de mielina, cuyas funciones principales son proporcionar apoyo metabólico a los axones subyacentes y potenciar la transmisión rápida de potenciales de acción a lo largo del axón. En el cerebro adulto, los oligodendrocitos mielinizantes maduros son generados por las células precursoras de oligodendrocitos (OPC, del inglés oligodendrocyte precursor cells) que residen en el parénquima cerebral y por las NSCs subependimarias. Para el estudio de la remielinización de axones se han desarrollado una serie de modelos in vivo que consisten en causar una lesión desmielinizante mediante la administración de toxinas para, más tarde, estudiar el proceso de la remielinización. El análisis de estos experimentos se ha basado clásicamente en la captura de imágenes de microscopía electrónica de alta resolución seguidas de anotación manual para la cuantificación. A lo largo de los años se han implementado algunos protocolos de análisis de bioimagen para cuantificar la envoltura de mielina por axón en la forma del parámetro conocido como g-ratio. Sin embargo, aunque algunos de ellos alcanzan cierto grado de automatización, su uso no se ha extendido entre los científicos. Además, todas estas herramientas se centran en el g-ratio, pero ninguna mide la lengua citoplásmica interna, un elemento clave en el proceso de (re)mielinización. Este trabajo se ha realizado utilizando exclusivamente software de código abierto y gratuito. La base fundamental del software de código abierto es que su código está disponible públicamente, lo que encaja perfectamente con estándares de la ciencia como el método científico y la validación de resultados a través de un sistema de revisión por pares. En general, el trabajo se ha desarrollado principalmente en ImageJ/Fiji, uno de los softwares más populares para el análisis de imágenes científicas. Además también se han utilizado otros dos programas de código abierto. Por una parte CellProfiler (en conjunto con CellProfiler Analyst), un software dedicado a la cuantificación de fenotipos celulares en rastreos de alto contenido utilizando imágenes de microscopía. Por otro lado ilastik, un programa que implementa una serie de flujos de trabajo de aprendizaje automático (ML, del inglés, machine learning). HIPÓTESIS Consideramos como hipótesis general que la aplicación de métodos de análisis de bioimagen y, cuando sea posible, la adopción de estrategias de rastreo basadas en microscopía, podrían beneficiar enormemente estos dos campos de estudio al aumentar tanto el rendimiento como la estandarización del análisis. Para abordar la hipótesis, seleccionamos escenarios específicos de diversa complejidad que combinaban una configuración experimental, adquisición de imágenes y desarrollo e implementación de estrategias de análisis de bioimagen. OBJETIVOS Teniendo en cuenta las consideraciones anteriores, los objetivos específicos que nos propusimos alcanzar fueron: Implementar un ensayo de rastreo de alto rendimiento para la evaluación in vitro de las propiedades adhesivas y la regulación en cultivos 2D de NSCs. Desarrollar un ensayo de rastreo de alto contenido para el análisis unicelular de la proliferación y apoptosis de NSCs en cultivos 2D. Establecer un ensayo de rastreo de alto rendimiento para la evaluación de la autorrenovación y la capacidad clonal de NSCs a través del análisis poblacional de neuroesferas 3D. Crear un flujo de trabajo semiautomático para mejorar el rendimiento del análisis de bioimagen de modelos de remielinización in vivo utilizando un parámetro novedoso en microscopía electrónica. CAPÍTULO 1 Antecedentes biológicos Las cadherinas son proteínas transmembrana de tipo 1 que establecen uniones adherentes homofílicas, célula-a-célula y dependientes del calcio a través de su dominio extracelular. Los miembros de esta familia de moléculas de adhesión celular desempeñan papeles críticos y variados durante el desarrollo y en la homeostasis adulta. Entre otras funciones, estas moléculas se han relacionado con la regulación del ciclo de activación de quiescencia en varios nichos de células madre. Nuestro laboratorio ha demostrado que la adhesión de las NSC subependimarias a la capa ependimaria a través de N-cadherina (cadherina 2, Cdh2) contribuye a mantener la organización estructural del nicho neurogénico y regula la quiescencia de las NSC. Además, describimos que este papel es dinámico ya que la escisión regulada por N-cadherina por MT5-MMP, una metaloproteinasa de tipo membrana (MMP, del inglés membrane-type metalloproteinase), codificada por el gen Mmp24, promueve la activación de las NSCs en condiciones fisiológicas y regenerativas. Sin embargo, los mecanismos subyacentes a la quiescencia mediada por adhesión no se han dilucidado por completo. Por lo tanto, decidimos explorar la posible implicación en la regulación de la adhesión de las NSCs de otro miembro de la familia MMP, la adamlisina ADAM10. Esta shedasa, como otros miembros de ADAM, contiene dominios de desintegrina y metaloproteasa y se ha observado que escinde la N-cadherina en las neuronas. De hecho, es una de las proteasas más expresadas en el cerebro adulto, incluida la SEZ. Con el fin de investigar los efectos y la regulación de la adhesión mediada por N-cadherina de las NSCs y caracterizar los factores de nicho secretados involucrados en su escisión, hemos desarrollado un ensayo funcional in vitro que modela el anclaje de células subependimarias mediadas por N-cadherina y automatizado su análisis mediante la adopción de una estrategia de captura de imágenes por rastreo y el desarrollo de una herramienta de análisis de bioimágenes para la extracción de los datos cuantitativos relevantes. Configuración experimental y captura de imagen Los ensayos de adhesión celular tienen como objetivo cuantificar el anclaje de células aisladas a superficies recubiertas con ligandos, componentes de la matriz extracelular purificados u otras células, generalmente en forma de monocapas. Para nuestro ensayo de rastreo basado en microscopía, con el fin de imitar en la medida de lo posible las condiciones in vivo, en lugar de utilizar una proteína recombinante purificada como recubrimiento, el sustrato adherente es proporcionado por una monocapa de células vivas que sobreexpresan el ligando de interés. En primer lugar, las neuroesferas se someten a disgregación mecánica con el fin de preservar la integridad de los dominios extracelulares de N-cadherina, y se depositan en una monocapa confluente de fibroblastos NC-L929 que sobreexpresan N-cadherina. En caso de que las NSC interrogadas no sean intrínsecamente fluorescentes, se marcan con el trazador de células DDAO-SE para facilitar su detección. Además, para incluir un control de especificidad, parte de las células se incuban con el anticuerpo bloqueador de N-cadherina GC4 (NcadBlock) para reducir su adhesión mediada por N-cadherina. Una vez que se deja adherir durante un tiempo controlado, las células no adheridas se lavan a fondo y los cultivos se fijan para un análisis adicional. Finalmente, los núcleos se marcan con DAPI para visualizar las células de la monocapa subyacente y las células se fijan para fotografiarlas mediante un microscopio de rastreo automático. Para obtener datos cuantitativos del ensayo se deben realizar dos tareas diferentes: estimar el porcentaje de superficie de cultivo ocupada por la monocapa que expresa N-cadherina y detectar y contar el número de NSCs adheridas a ella. Dado que no se requiere una morfología celular precisa para lograr las tareas mencionadas, decidimos capturar imágenes de baja resolución. De hecho, las condiciones de obtención de imágenes se han configurado para llegar a un compromiso entre reducir el tamaño de la imagen al mínimo y aún poder detectar de manera eficiente los objetos de interés, lo cual supone un ahorro enorme de espacio al tratarse de un ensayo de rastreo de alto rendimiento. Concretamente, muestreamos las NSCs DDAO-SE+ con una longitud mínima de 5 a 10 píxeles. Tanto los parámetros de captura como los de análisis de imagen de nuestro protocolo están ajustados para trabajar fotografiar y analizar objetos en este rango de tamaño. Análisis de bioimagen Hemos desarrollado un flujo de trabajo de análisis de bioimagen que se ha automatizado en una macroinstrucción de ImageJ. Además, dada la importancia del tamaño de los objetos para la aplicación de esta herramienta, junto a ella proporcionamos otra macroinstrucción que permite disminuir el tamaño de las imágenes agrupando píxeles en cuadrados de 2x2, 3x3 o 4x4 que toman el valor de la media de todos los píxeles del conjunto. Una vez las imágenes tienen una resolución adecuada se puede iniciar el flujo de trabajo principal. Dado que es probable que sea necesario ajustar el conjunto de parámetros entre análisis, la macro permite modificar la configuración para adaptarse al análisis de diferentes experimentos. De hecho, la macro incluye un modo de prueba, que permite al usuario modificar los parámetros y verificar el resultado fácilmente antes de lanzar el análisis. Además, el conjunto de parámetros se puede guardar e importar en análisis futuros. Para favorecer el análisis no supervisado hemos incluido la medición de diferentes métricas para ser aplicadas en controles de calidad. Nuestro control de calidad está destinado a detectar dos tipos diferentes de imágenes inadecuadas: aquellas que están desenfocadas o contienen artefactos saturados, y aquellas que, a pesar de ser adecuadas en términos de adquisición de imágenes, contienen una monocapa incompleta. Tal y como se ha descrito previamente, el objetivo principal del ensayo es cuantificar el número de células adheridas por superficie de monocapa. Para contar el número de células adheridas, la imagen correspondiente al trazador DDAO-SE se suaviza antes de determinar las posiciones de los máximos de intensidad locales. Estos máximos se utilizan como marcadores para separar la imagen en territorios de Voronoi. Además, se aplica una segmentación por umbrales para generar una máscara binaria que puede contener varias células fusionadas en un único objeto. Estos objetos son separados utilizando operadores lógicos con los territorios de Voronoi y, finalmente, los píxeles aislados y otros objetos demasiado pequeños para ser células son eliminados de la imagen binaria. Por lo que respecta a la monocapa, dado que se ha utilizado DAPI para marcar el ADN de las células, el área de la monocapa debe estimarse a partir de los núcleos de los fibroblastos. Para ello se aplica el filtro del máximo para “rellenar” los espacios de fondo que quedan entre núcleos cercanos. A continuación se aplica una segmentación por umbrales para obtener una segmentación semántica de la monocapa. Una vez obtenidas las máscaras binarias de las células adheridas y la monocapa se utilizan para calcular el número de células adheridas y la superficie que ocupa la monocapa. Estudio: regulación de la proteólisis de N-cadherina en la SEZ por factores de nicho Dado que algunos de nuestros resultados preliminares in vivo sugerían que ADAM10 también podría estar involucrado en la escisión de la N-cadherina presente en la membrana NSC, aplicamos nuestra estrategia para abordar cuantitativamente el papel de ADAM10 en la regulación de la adhesión de las NSCs mediada por N-cadherina. Para ello, los cultivos de neuroesferas se trataron previamente con GI254023X (GIX), un potente fármaco inhibidor de ADAM10. Antes de realizar el protocolo de adhesión celular también se incluyó un control de especificidad con anticuerpos NcadBlock: la mitad de las células se incubaron con NcadBlock y la otra mitad con inmunoglobulinas de isotipo de ratón (IsoMsIgG). Tras el tratamiento, las NSCs (marcadas con DDAO-SE) se sembraron en la monocapa NC-L929 y se dejaron adherir durante un tiempo determinado antes de lavar las células no adheridas, fijarlas y teñirlas con DAPI para su posterior captura y análisis. Tal y como se esperaba, el NcadBlock redujo consistentemente la adhesión de las NSCs a la monocapa NC-L929. Con respecto a la condición experimental, en caso de que ADAM10 realmente participe en la proteólisis y el desprendimiento de la N-cadherina en las NSC, su inhibición debería provocar un incremento en los niveles de N-cadherina en la superficie celular y, por lo tanto, en una mayor adhesión. Esto fue confirmado en nuestro ensayo, ya que la condición tratada con GIX mostró un mayor recuento de células DDAO-SE-positivas adheridas por área de monocapa. CAPÍTULO 2 Antecedentes biológicos La proliferación celular y la muerte celular programada son sin duda dos de los procesos más estudiados en el campo de la biología celular. En el campo de las células madre en particular, la regulación del ciclo celular es fundamental para comprender las propiedades clave de las células madre, como su mantenimiento a través de la transición reversible entre la quiescencia y la activación o el cambio de la pluripotencia a la diferenciación. La apoptosis, por otro lado, ha surgido en los últimos años como un tema importante en el estudio de las células madre, ya que se ha encontrado que los cuerpos apoptóticos de las células circundantes pueden inducir la proliferación de células madre o que mediadores apoptóticos específicos pueden desempeñar un papel en la diferenciación de las células madre. Entre los métodos adecuados para evaluar la proliferación celular mediante análisis microscópico, los experimentos de pulso y caza con análogos de nucleósidos destacan por su fiabilidad y aplicabilidad en ensayos de rastreo. Este enfoque se basa en la detección de nucleósidos trazables incorporados al ADN mientras las células pasan por la fase S del ciclo celular. Para ello, las células se incuban con pirimidinas modificadas, que actúan como análogos de timidina, durante un breve período de tiempo (pulso). Después de eso, las células se pueden fijar y procesar inmediatamente para la detección del ADN marcado, lo que proporciona una estimación de la proliferación general en la muestra (caza). Las pirimidinas que contienen halógenos, como BrdU (5-bromo-2'-desoxiuridina) se han utilizado durante décadas con este objetivo, lo que requiere la desnaturalización del ADN para revelar su presencia mediante inmunotinción con anticuerpos específicos. Por el contrario, la EdU (5-etinil-2'-desoxiuridina) puede detectarse directamente mediante una reacción “click” mediante la cual grupo alquino presente en la molécula de EdU forma un enlace covalente con una azida ligada a un fluoróforo, haciendo innecesario el uso de anticuerpos o el desenmascaramiento de antígenos por tratamiento térmico o ácido. Por esta y otras ventajas, EdU se ha convertido en los últimos años en una alternativa popular para los ensayos de rastreo. La apoptosis es una forma de muerte celular provocada por la activación de cascadas proteolíticas altamente reguladas y con características bioquímicas y morfológicas estereotipadas. Los procesos apoptóticos se dividen en dos subtipos principales, apoptosis intrínseca o extrínseca, según las vías bioquímicas implicadas en su regulación. Por un lado, la apoptosis intrínseca depende de la permeabilización de la membrana externa mitocondrial, liberando proteínas mitocondriales que son responsables de la activación de la caspasa iniciadora 9. Por otro lado, la apoptosis extrínseca está mediada por dos tipos diferentes de receptores de membrana: la presencia de ligandos de receptores de muerte conduce a la activación de las caspasas iniciadoras 8 y 10, mientras que la ausencia de ligandos de receptores de dependencia conduce a la activación de la caspasa iniciadora 9. Las caspasas ejecutoras 3, 6 y 7 son efectores comunes tanto para la vía intrínseca como extrínseca, y son escindidas por las caspasas 8, 9 o 10 para iniciar la apoptosis. Debido a su papel central en las vías de señalización de la apoptosis, los efectores comunes como las caspasa 3 y 7 son biomarcadores bien establecidos para la detección de células apoptóticas y pueden detectarse fácilmente en los núcleos mediante inmunoquímica mediante una gran variedad de anticuerpos disponibles comercialmente que distinguen específicamente la forma activada de cada caspasa de su cimógeno pro-caspasa. Análisis de bioimagen Hemos desarrollado un flujo de trabajo de análisis de bioimagen para analizar un rastreo de alto contenido para la evaluación de la proliferación celular y la apoptosis. A pesar de que el flujo de trabajo se ha ensamblado en una sola macroinstrucción de ImageJ, se han diseñado flujos de trabajo adicionales para realizar pasos de preprocesamiento opcionales. Además, igual que en el capítulo anterior, este flujo de trabajo también incluye un modo pre-análisis para testar los parámetros ajustables y visualizar el resultado. Dado que el ensayo se basa en datos densitométricos, es necesario tener en cuenta que las imágenes adquiridas a través de un microscopio óptico se ven afectadas por el viñeteado, que se estima que causa una variación en la iluminación efectiva del 10-30% entre las diferentes regiones de la imagen. Para mejorar la calidad de los datos, es posible corregir las imágenes experimentales en un paso de preprocesamiento o determinar una región con una variación de iluminación mínima para excluir el resto del análisis. El flujo de trabajo incluye un paso opcional destinado a corregir la iluminación irregular utilizando la plugin BaSiC, un método retrospectivo que utiliza múltiples imágenes aprovechando la gran cantidad de imágenes que se generan en un ensayo de rastreo. El ensayo computa datos densitométricos de diferentes sondas fluorescentes que marcan moléculas localizadas total o parcialmente en los núcleos celulares pero que muestran diversos patrones de tinción. En consecuencia, la segmentación se realiza en el canal de la tinción nuclear (p.ej., DAPI). Para lograr una segmentación de núcleos precisa, el usuario puede elegir entre dos estrategias diferenciadas. Por un lado, un flujo de trabajo basado en métodos clásicos de procesamiento de imágenes que incluye algunos de los pasos más habituales en este tipo de estrategias (filtros de suavizado, métodos de segmentación por umbrales y operaciones de morfología matemática). Por otro lado, un enfoque de aprendizaje profundo (DL, del inglés, deep learning) utilizando el modelo versátil (núcleos fluorescentes) de StarDist. StarDist predice la probabilidad de cada píxel de ser parte de un objeto y la distancia al límite del objeto a lo largo de una serie de direcciones radiales. de este modo, se propone un polígono de forma estrellada-convexa como región candidata por cada píxel dentro de un objeto, lo que genera una gran cantidad de formas redundantes que luego se filtran usando supresión no máxima para podar aquellas regiones que probablemente correspondan al mismo objeto. Para utilizar StarDist hemos adaptado nuestro protocolo de captura de imagen, de modo que la resolución obtenida es la más adecuada para aplicar este método. El uso de microscopios de alto rendimiento permite la adquisición de un gran conjunto de datos de forma automatizada. A pesar de sus ventajas, el enfoque automático también puede conducir a la captura de imágenes de mala calidad. Dado que el análisis de dichos rastreos imposibilita la inspección visual de las imágenes es necesario aplicar métodos para la identificación automática y la exclusión de esas imágenes a fin de evitar una interpretación errónea de los resultados. Dado que se han propuesto muchos parámetros para la detección de imágenes desenfocadas, decidimos entrenar un clasificador utilizando métodos de ML en CellProfiler Analyst. Para aumentar el número de imágenes desenfocadas para el entrenamiento y la validación del método se capturaron dos conjuntos de imágenes adicionales: uno de imágenes ligeramente desenfocadas y otro de campos de visión afectados severamente. Los resultados demostraron la gran exactitud del método utilizando un único parámetro, el power log-log slope. Estudio: respuesta de las NSCs al daño del ADN El funcionamiento del flujo de trabajo se probó en un rastreo real de proliferación celular (mediante un pulso corto de EdU) y apoptosis (mediante detección de caspasa 3 activada por inmunocitoquímica). Seleccionamos una estrategia que combinaba funciones de corrección de la iluminación calculadas con BaSiC y segmentación de los núcleos con StarDist. El objetivo del ensayo era evaluar la respuesta de las NSC al daño del ADN in vitro, que fue inducido por una breve exposición al agente alquilante metil metanosulfonato (MMS). En concreto, las células se expusieron a una concentración baja (0,005%) o alta (0,02%) de MMS. Tal y como se esperaba, los efectos del tratamiento sobre la proliferación celular fueron dramáticos. Mientras que un MMS bajo condujo a una disminución importante en las células positivas para EdU, un MMS alto provocó una detención completa del ciclo celular. Además, observamos una caída evidente de la intensidad media y los valores de densidad integrados del canal EdU en las células EdU+ tratadas con MMS bajo. Además, se estratificaron las células de la muestra en cinco grupos (C1-5), asignando las células EdU- a C1 mientras que las EdU+ se distribuyeron entre los cuatro grupos restantes de acuerdo con su señal (C2 a C5 de menor a mayor intensidad). De este modo se observó que las células proliferantes en condición de MMS baja se asignaron preferentemente en C2, muy probablemente debido a la interrupción transitoria de la fase S. Respecto a la apoptosis, se trata de un fenómeno extremadamente raro en NSCs cultivadas en condiciones regulares in vitro, por lo que a pesar de que un MMS provocó un aumento importante la tasa de apoptosis más alta no superó el 0,4% CAPÍTULO 3 Antecedentes biológicos Una de las características definitorias de las NSCs es su capacidad clonal y de autorrenovación. El desarrollo de cultivo in vitro de estas células madre ha permitido la evaluación de sus características definitorias. Tanto la evaluación de la clonalidad como la autorrenovación se basan en la formación controlada de agregados clonales flotantes conocidos como neuroesferas durante el denominado "ensayo de formación de neuroesferas". El ensayo se inicia con la obtención de células individuales a partir de la disección y disociación del tejido SEZ o de la disgregación de neuroesferas previamente formadas. Luego, estas células se siembran a una densidad celular estandarizada en placas multipocillo en un medio definido sin suero y suplementado con mitógenos. Después de varios días, el número de neuroesferas formadas define la capacidad clonal del cultivo, mientras que su disgregación y resiembra en rondas posteriores de formación de neuroesferas proporciona información sobre su autorrenovación. Los ensayos de una sola célula aseguran la densidad clonal verdadera, ya que se realizan cultivando células individuales de forma independiente, es decir, sembrando solo una célula por pocillo. Sin embargo, los procedimientos para lograr esto no siempre son fáciles y pueden perjudicar la viabilidad celular. Una alternativa interesante son los ensayos de muy baja densidad (ensayo pseudo-clonal), que también pueden generar resultados consistentes. Nuestro laboratorio y otros han demostrado que una densidad celular de menos de 5 NSC por µL (hasta 1000 células por pocillo en una placa convencional de 96 pocillos) permite la formación reproducible de neuroesferas clonales a partir de células individuales sin signos de agregación. El objetivo de este ensayo es cuantificar el número de neuroesferas formadas, generalmente después de 5-7 días, en relación al número de células sembradas. El procedimiento para cuantificar el resultado de los ensayos de neuroesferas ha sido típicamente la observación directa de la placa de cultivo a través de un microscopio invertido de contraste de fase, por lo que los investigadores obtienen el número de agregados clonales mediante inspección visual mientras se desplazan manualmente a través de la placa. Además de ser tedioso y lento, especialmente en experimentos con varias réplicas técnicas y biológicas y condiciones experimentales, requiere un cierto entrenamiento y puede verse afectado por el sesgo del investigador. En algunos paradigmas experimentales, además del número de clones, el tamaño de las neuroesferas formadas también podría ser informativo y ayudar a caracterizar un fenotipo particular. Esta medida no se puede obtener directamente durante el recuento manual de neuroesferas, sino que es necesario capturar imágenes representativas de la superficie de cultivo y medir el tamaño de las neuroesferas muestreadas. Configuración experimental y captura de imagen Para nuestro ensayo elegimos un enfoque pseudo-clonal porque es mucho más fácil de realizar a diario en un laboratorio de cultivo celular normal. Sin embargo, con el fin de optimizar el análisis y permitir la evaluación simultánea y automática tanto del número como del tamaño de las neuroesferas, decidimos desarrollar un protocolo de captura de imágenes similar a un rastreo de alto contenido al que le sigue un flujo de trabajo de análisis de bioimagen automático. Dado que las neuroesferas no se distribuyen de manera heterogénea a lo largo del pocillo decidimos capturar una cuadrícula ordenada de 5x5 imágenes parcialmente superpuestas cubriendo toda la superficie del pocillo, lo que permite combinarlas más tarde para obtener una reconstrucción completa. Por otro lado, al tratarse de agregados tridimensionales, encontrar un plano focal apropiado para obtener una imagen representativa enfocada de todas las neuroesferas en el pocillo no es una tarea fácil. De hecho, el software de enfoque automático que se aplica normalmente para encontrar células adheridas al fondo del pocillo falla en gran medida al intentar enfocar las neuroesferas. Por lo tanto, nuestro protocolo de imágenes se basa en la información proporcionada por el operador para establecer el mejor plano focal posible. Análisis de bioimagen Hemos desarrollado un flujo de trabajo de análisis de bioimagen para el ensayo de neuroesfera pseudo-clonal. El flujo de trabajo se ha automatizado mediante varias macroinstrucciones de ImageJ combinadas con un clasificador entrenado en ilastik. En este caso no se ha incluído un modo pre-análisis, pues el flujo de trabajo requiere más tiempo para procesar pocillos enteros. Por el contrario, se ha implementado una macroinstrucción adicional en la que se pueden probar con mayor eficiencia los parámetros de la segmentación en las imágenes de los pocillos una vez han sido reconstruidos. Capturar toda el área de cultivo de un pocillo redondo en una placa multipocillo de plástico transparente mediante una cuadrícula de imágenes cuadradas conlleva algunos problemas para el análisis de bioimagen. Destaca la iluminación desigual introducida por la pared del pocillo, que refleja la luz. De hecho, este fenómeno es tan prominente que enmascara la típica iluminación irregular que afecta a cualquier imagen obtenida con un microscopio. Para hacer frente a esto, en primer lugar se preprocesan las imágenes del experimento para corregir la iluminación no uniforme. Al contrario que en el capítulo 2, la iluminación es diferente en cada campo de visión, según su posición respecto a la pared del pocillo. Por esta razón se ha implementado una macroinstrucción que utiliza BaSiC para generar una función de corrección para cada uno de los 25 campos de visión que conforman un pocillo. Dado que los microscopios de alto contenido no suelen utilizar contraste de fase, es probable que las neuroesferas se detecten mejor debido a su textura más que a sus intensidades absolutas. Por lo tanto, decidimos aplicar una estrategia de ML en ilastik para facilitar la segmentación semántica de varios componentes de la imagen (fondo, neuroesferas y bordes del pocillo) mediante la clasificación de píxeles. El clasificador está integrado en la macroinstrucción de ImageJ, en el que genera un mapa de probabilidades como un paso intermedio del flujo de trabajo. A continuación se reconstruyen los pocillos (tanto las imágenes de luz transmitida como los mapas de probabilidades) utilizando el algoritmo de “costura” incluido en el núcleo de Fiji. El objetivo principal del ensayo es contar el número de neuroesferas y medir su tamaño. Una vez reconstruidos los pocillos, la segmentación se realiza en los mapas de probabilidad generados, que son procesados mediante una estrategia basada en el uso de filtros. La imagen de probabilidad de neuroesferas se procesa para segmentar los agregados clonales. Además, el mapa de probabilidad de las paredes se invierte y para definir el área correspondiente a la superficie de cultivo del pocillo. Estudio: comparación entre los clasificadores propuestos para la segmentación de las neuroesferas Dado que probamos cuatro clasificadores diferentes, cada uno basado en un número diferente de características, decidimos comparar su funcionamiento en la segmentación de objetos. Para ello, ejecutamos el flujo de trabajo previamente descrito aplicando cada uno de los cuatro clasificadores pero manteniendo constante el conjunto de parámetros ajustables. Además, un experto anotó manualmente todas las neuroesferas en las imágenes reconstruidas del canal de luz transmitida. Luego, comparamos las segmentaciones obtenidas a través de nuestro flujo de trabajo de análisis de bioimagen aplicando los cuatro clasificadores con las anotaciones de referencia anotadas manualmente. Con este objetivo, utilizamos el parámetro F1 para evaluar el rendimiento de la segmentación, para lo que implementamos una macro de Fiji. Esto nos permitió identificar el mejor clasificador, cuyo resultado fue comparado también con el obtenido al enfrentar las anotaciones del primer experto con las generadas por un segundo anotador. De este modo demostramos que nuestro flujo de trabajo automatizado genera resultados tan precisos como los anotados manualmente por investigadores. CAPÍTULO 4 Antecedentes biológicos Los oligodendrocitos en el CNS envuelven sus proyecciones citoplasmáticas especializadas alrededor de los axones para formar la estructura de recubrimiento conocida como vaina de mielina. Las OPCs son las encargadas de dar lugar a oligodendrocitos mielinizantes, tanto durante el desarrollo embrionario que conduce al proceso de mielinización como en respuesta a una lesión o en el caso de patología desmielinizante durante el proceso de remielinización. Debido a la innegable importancia de estos dos procesos, los científicos han buscado enfoques para cuantificar los cambios en el grosor de la vaina de mielina para ayudar a comprender su biología en condiciones fisiológicas y patológicas. Existe un método generalizado que se ha convertido en un estándar del campo, el parámetro conocido como g-ratio, definido en el campo como la relación entre el diámetro del axón y el diámetro de la fibra. Según esta definición, cuanto más gruesa es la vaina de mielina, menor es el g-ratio, que es igual a uno en ausencia de mielina. Con respecto a la evaluación de la remielinización, las áreas sometidas a un proceso de remielinización se distinguen típicamente por sus vainas de mielina más delgadas, es decir, g-ratios más bajos. Durante la mielinización, los axones del CNS son cubiertos de forma discontinua por oligodendrocitos que albergan proteínas especializadas transmembrana y asociadas a la membrana que confieren a la mielina la mayoría de sus propiedades. Para hacerlo, estas células emiten procesos citoplasmáticos que son guiados para alcanzar el axón, mantener un contacto estrecho y envolverlo para formar la cubierta celular multicapa y concéntrica conocida como vainas de mielina. El engrosamiento de la mielina se debe a la envoltura de la lengua citoplásmica interna alrededor del axón al avanzar por debajo de la envoltura preformada. La compactación de la mielina comienza tras las primeras envolturas y es impulsada por la proteína básica de mielina (MBP, del inglés myelin basic protein) asociada a la membrana. De hecho, el crecimiento de la membrana y la compactación de la mielina tienen lugar de una manera coordinada, con lo que la compactación se da primero en las envolturas de membrana más externas, evitando la compactación de la zona de crecimiento más interna. Luego, la compactación se extiende progresivamente hacia el interior, siempre a la zaga de la región de crecimiento. Durante la mielinización, la lengua interna se agranda y es rica en F-actina. No obstante, a medida que la mielina madura, la lengua se estrecha y la actina F disminuye. Una vez que se completa la mielinización activa, queda una lengua interna de mielina sin compactar, generalmente encogida. De hecho, las fibras adultas del CNS aún conservan el citoplasma no compactado en los extremos de la espiral de mielina, es decir, las lenguas interna y externa. Sorprendentemente, a pesar de la importancia de la lengua interna en el proceso de mielinización, se ha ignorado durante mucho tiempo al evaluar las propiedades de la mielina. De hecho,el g-ratio no la tiene en cuenta. De hecho, a pesar de la existencia de diversos métodos computacionales para la obtención del g-ratio, hasta ahora no se había desarrollado ninguno para la segmentación de la lengua interna. Por esa razón decidimos implementar un flujo de trabajo que permitiese calcular el g-ratio tradicional, pero también obtener medidas teniendo en cuenta este componente de la fibra. Análisis de bioimagen A diferencia de otros enfoques destinados a permitir el análisis de imágenes adquiridas a través de una amplia gama de técnicas de imagen, nuestro objetivo es poder segmentar la lengua interna. De hecho, nuestro enfoque permite la segmentación semiautomática de los tres componentes principales de la fibra: axoplasma, lengua interna y mielina, siempre que las imágenes muestren la lengua interna con suficiente detalle. Por lo tanto, nos enfocamos en imágenes TEM. Nuestra estrategia se basa en métodos de ML supervisados implementados en ilastik para mejorar la segmentación y combina el procesamiento automatizado de imágenes con etapas interactivas de edición del usuario. Los pasos iniciales del flujo de trabajo se realizan en ilastik que, a diferencia de Fiji, reconoce un número limitado de formatos de imagen. Por esta razón decidimos incluir un paso opcional para convertir las imágenes en un formato compatible con ilastik. Además, este flujo de trabajo también permite aplicar algunos ajustes básicos que pueden ser útiles para preprocesar las imágenes con el fin de utilizar un clasificador de ilastik generado previamente, por ejemplo, normalizando las imágenes. Una vez preprocesadas, un clasificador de píxeles entrenado en ilastik se aplica para generar mapas de probabilidad con tres clases diferentes: mielina, citoplasma y membrana. A continuación, la probabilidad del citoplasma se utiliza para generar una segmentación de instancias, a las que se les asignan clases diferentes (axoplasma o lengua de mielina) utilizando un clasificador de objetos entrenado en ilastik. Los resultados obtenidos en ilastik se utilizan para realizar la segmentación secuencial de: i) el objeto definido por el límite interno de mielina, es decir, el axoplasma más la lengua interna, ii) toda la fibra (axoplasma + lengua interna + mielina compacta) y iii) solo el axoplasma sin ninguna estructura derivada de oligodendrocitos. Finalmente, trabajando con estas regiones será posible estimar automáticamente el grosor de la mielina, el área interna de la lengua o el diámetro del axón, entre muchos otros parámetros. No obstante, a pesar del uso de métodos de ML, la complejidad de las imágenes TEM aún dificulta la generación de una segmentación automática perfecta. Por lo tanto, decidimos implementar un flujo de trabajo semiautomático en el que la macroinstrucción de ImageJ obtiene automáticamente las ROIs correspondientes y luego se detiene, lo que permite al usuario verificar la selección y, si es necesario, editarla antes de pasar a la siguiente fase. La macroinstrucción sugiere posibles mejoras que pueden ser fácilmente aplicadas por el usuario. Alternativamente, el usuario es libre de utilizar la herramienta de selección a mano alzada de ImageJ para mejorar la selección. Antes de medir y generar la tabla de resultados la macro incluye varios pasos automatizados destinados a: i) verificar las enmiendas manuales introducidas por el usuario y corregir errores comunes de la edición manual e ii) asociar los objetos pertenecientes a la misma fibra mediante un código de tres dígitos para permitir un análisis integral. Estudio: evaluación de la segmentación de la fibra, el límite interno de la mielina y el axoplasma en imágenes de TEM. Para evaluar cuantitativamente el rendimiento del flujo de trabajo, comparamos la segmentación obtenida utilizando la macro descrita en este capítulo con anotaciones manuales de un experto. La evaluación se realizó en imágenes TEM diferentes a las utilizadas para entrenar a los clasificadores. Las imágenes de TEM in vivo se obtuvieron de áreas remielinizantes del corpus callosum previamente sometidas a una lesión de desmielinización mediante la inyección de la toxina lisofosfatidilcolina. Para evaluar el impacto de la supervisión se generaron dos segmentaciones diferentes: i) una de manera completamente automatizada y, ii) otra semiautomática, incluyendo los pasos supervisados ​​por el usuario, pero evitando el uso de la herramienta de selección a mano alzada para la edición de ROIs. El enfoque automatizado demostró una capacidad considerable para predecir los componentes de la fibra, siendo la fibra el objeto que el método parece identificar mejor. Además, como era de esperar, estos resultados se pueden mejorar significativamente al permitir al usuario revisar y modificar los objetos segmentados, incluso con la limitación de no permitir dibujar ROIs con la herramienta de selección a mano alzada. CONCLUSIONES 1-El desarrollo de métodos de captura y análisis de imagen automatizados para el estudio de cultivos de NSCs mejora el rendimiento y la reproducibilidad de los ensayos in vitro. 2-La configuración experimental propuesta y la estrategia de análisis para el ensayo estático de alto rendimiento basado en la adhesión célula-a-célula es un modelo in vitro fiable para la evaluación del anclaje mediado por N-cadherina de NSCs aisladas. 3-Se pueden identificar diversos patrones de proliferación y viabilidad celular mediante métodos de rastreo de alto contenido en ensayos de proliferación celular y apoptosis. 4-El uso de colecciones de imágenes fuera de foco facilita el entrenamiento de clasificadores ML para la detección de campos de visión afectados por el desenfoque. 5-El análisis de bioimagen automatizado de ensayos pseudoclonales de formación de neuroesferas capturados en 2D genera datos tan precisos como los anotados en humanos. 6-La segmentación asistida por ML y supervisada por humanos de secciones transversales de fibras axonales en imágenes de TEM permite la extracción de parámetros clásicos y novedosos (basados en la lengua interna) para el estudio de la (re)mielinización y mejora el rendimiento del análisis de bioimagen.The bioimaging field has quickly evolved during the last years with the implementation of hardware and software for greater automation at the different stages that compose a microscopy-based experiment. The topmost representatives of these forefront methodologies are those combining high-content imaging with automated bioimage analysis protocols, although there is a whole spectrum of intermediate levels of throughput up to the manual analysis that is still practiced in many fields. Therefore, a big effort is still to be made in order to spread the use of cutting-edge imaging technologies throughout the life science fields relying on image-based experiments. Our aim has been to generate bioimage analysis workflows, in some cases including the development and optimization of the experimental and imaging setups, for the study of brain-specific processes in the field of regeneration. On one hand, we investigated the possibilities to adopt microscopy-based screenings combined with automated bioimage analysis for the in vitro study of the subependymal neural stem cells (NSCs). On the other hand, we looked at the possibility to semi-automate the transmission electron microscopy (TEM) analysis of in vivo experiments for the assessment of remyelination. We have shown that automated bioimage analysis protocols developed for the study of cultured NSCs improve the throughput and the reproducibility of the in vitro assays of different kinds and analytical complexity. Specifically, we have deployed high-content imaging and bioimage analysis protocols for i) static, cell-to-cell adhesion-based assays, ii) cell-based proliferation and apoptosis assays and iii) screening-like pseudo-clonal neurosphere formation assays. Emphasis has been made in the establishment of well-conducted pre-processing steps, which have involved the adoption of different illumination correction strategies or the search for more optimised protocols to generate rules for the detection of fields-of-view affected by blur. We also have shown that the combination of supervised machine learning with semiautomated segmentation of fibre cross-sections on TEM images contributes to enhance the analysis throughput of experiments aimed to quantify classic metrics just as the g-ratio, whereas it also empowers the inclusion of novel metrics by including inner-tongue-based features to assess new parameters.